ШТАММ Bacillus amyloliquefaciens - ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ Bacillus amyloliquefaciens Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12N9/28 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве альфа-амилазы, применяемой в различных областях промышленности и сельского хозяйства для осахаривания (гидролиза) крахмалосодержащего сырья, а именно в хлебопечении, спиртовой, пивоваренной, кондитерской и крахмалопаточной промышленности (выработка паток, сиропов, глюкозы), в текстильной, бумажной промышленности, при производстве моющих средств. Очищенные амилазы применяются для аналитических целей, для получения циклодекстринов и в медицине. Альфа-амилазы различного происхождения входят в состав практически всех известных ферментных препаратов для заместительной терапии.

Амилазы - это ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз крахмала, гликогена и родственных соединений. Альфа-амилаза (α-1,4-D-глюкан-глюканогидролаза) относится к эндоамилазам и катализирует гидролиз внутренних α-1,4-глюкозидных связей.

Для получения альфа-амилаз преимущественно используют три вида бацилл - Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus stearothermophilus, амилазы этих штаммов объединены в группу так называемых "Термамил-подобные альфа-амилазы" Ряд таких вариантов альфа-амилаз, известны, например, из WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, US 7713723, US 20090317864, US 20100022433.

Ближайшим аналогом является штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-5144 [RU 2003689], который используется в настоящее время для промышленных целей. Этот штамм секретирует альфа-амилазу, с активностью до 780 ед/мл.

Задача настоящего изобретения - расширить арсенал бактериальных штаммов-продуцентов альфа-амилазы.

Задача решена путем получения штамма Bacillus amyloliquefaciens 19 RifR -продуцента альфа-амилазы, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-10291. Этот штамм получен многоступенчатой селекцией на среде, содержащей рифампицин, и последующим отбором наиболее продуктивных клонов, устойчивых к этому антибиотику и является мутантом штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-5144 (RU 2003689).

Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-10291, характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 2,5-4,0×0,5-0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие. Размер спор 1,0-1,2×0,6-0,7 мкм. Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера - колонии шероховатые, круглые, матовые, желтовато-серые, край неровный, лопастной. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют сухую пленку без помутнения среды, а при аэрации - интенсивную мутность.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут при температуре от 20 до 45°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности D-глюкозу, D-фруктозу, лактозу. Не усваивают ацетат.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и в органической форме, в виде пептона, аминокислот.

Желатину разжижают.

Индол не образуют.

Уреазную активность не обнаруживает.

Штамм проявляет устойчивость к эритромицину (10 мкг/мл), что обусловлено наличием на плазмиде рВА1418 гена устойчивости к эритромицину. Штамм устойчив к рифампицину (100 мкг/мл).

Штамм устойчив к вирулентным фагам Е10, Е25, Е26, выделенным из промышленных фаголизатов и препаратов субтилизина ГХЗ.

Штамм способен продуцировать альфа-амилазу с активностью 900 едГОСТ/мл.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 в колбах на среде Лурия - Бертани (LB).

Штаммы Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 и Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-5144, используемый в качестве контроля, культивируют на питательной среде LB с осахаренным крахмалом, приготовленной на деминерализованной воде и содержащей, мас.%: картофельный крахмал, осахаренный альфа-амилазой - 10, триптон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, хлористый натрий - 0,5, вода - остальное, рН 7,2. Выращивание осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке с интенсивной аэрацией (280 об/мин) при температуре 37°С в течение 72 часов.

Амилолитическую активность культуральной жидкости в ходе ферментации определяют по гидролизу 1%-ного растворимого крахмала в 10 мМ Na-K-фосфатном буфере рН 6,0, 0,3 мМ СаС1₂ и 33 мМ NaCl [ГОСТ 20264.4-89].

К 10 мл 1%-ного растворимого крахмала, растворенного в 15 мМ Na-K-фосфатном буфере рН 6,0, добавляют 5 мл исследуемого образца - культуральной жидкости (разведенного в 2 мМ ацетатном буфере, рН 6,0, 0,3 мМ СаС1₂ и 100 мМ NaCl). Контроль вместо исследуемого образца содержит 5 мл буфера для разведения фермента. Пробы инкубируют при 30°С 10 мин. Реакцию останавливают добавлением к 1 мл реакционной смеси 10 мл 0,1 М раствора НСl. Из полученной смеси отбирают 1 мл и переносят в 10 мл раствора йода, содержащего 0,0025% I и 0,025% KI. Реакционную смесь выдерживают при 20°С 20 мин и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 656 нм. Контрольным раствором при калориметрировании является дистиллированная вода. Количество прогидролизованного крахмала определяют по формуле:

где D₁ - оптическая плотность контрольного раствора;

D₂ - оптическая плотность опытного раствора;

0,1 - количество крахмала, взятое для испытания в качестве субстрата, г.

Если количество прогидролизованного крахмала меньше 0,02 г или больше 0,06 г, то испытание повторяют с большими или меньшими разведениями растворов препарата альфа-амилазы.

Определение амилолитической активности (АС) осуществляется по формуле:

где С - количество прогидролизованного крахмала, г;

n - величина разведения раствора культуральной жидкости;

5,885; 0,001671 - коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости количества прогидролизованного крахмала от количества фермента, взятого для испытания.

За единицу активности амилолитических ферментов (АС) принимают такое количество фермента, под действием которого в принятых условиях (в нашем случае реакцию проводят при температуре 30°С и рН 6,0) за 1 час происходит гидролиз 1 г крахмала до декстринов различной молекулярной массы, составляющих 30% от крахмала, введенного в реакцию.

Данные по накоплению альфа-амилазы В. amyloliquefaciens в культуральной жидкости во время ферментации в колбах суммированы в табл.1. На 65-й час ферментации амилолитическая активность культуральной жидкости штамма Bacillus amyloliquefaciens В-10291 составила 180 едГОСТ/мл, что на 91% превышает амилолитическую активность культуральной жидкости контрольного штамма, в качестве которого использовали штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-5144 (94 ед/мл).

Таблица 1 Время ферментации, ч Амилолитическая активность, едГОСТ/мл ВКПМ В-5144
(контрольный штамм) ВКПМ В-10291
(заявляемый штамм) 0 0,05 0,05 5 0,7 2,1 9 8,5 6,8 15 14,7 9,4 21 24,9 11,7 24 31,7 15,2 29 32,4 25,2 36 43,7 55,8 48 80 144 53 88,7 183 65 94 180

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 в ферментере.

Накопление альфа-амилазы в культуральной жидкости штаммов Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 - заявляемый штамм и в культуральной жидкости В. amyloliquefaciens ВКПМ В-5144 - контрольный штамм оценивают при культивировании их в промышленных ферментационных средах, приготовленных на деминерализованной воде и содержащих, мас.%: картофельный крахмал, осахаренный альфа-амилазой, - 10, кукурузный экстракт - 2,4, белково-витаминный концентрат или пивные дрожжи - 0,3, лактоза - 0,28, (NH₄)₂SO₄ - 0,8, K₂SO₄ - 0,3, MgSO₄ × 7Н₂O - 0,014, CuSO₄ - 0,00038, NaCl - 0,03, вода - остальное, рН 7,2. Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-10291 выращивают на среде без антибиотика, как и контрольный штамм. Инокуляты штаммов (жидкую посевную культуру) выращивают в 750-мл колбах, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава, мас.%: триптон - 1, дрожжевой экстракт - 1, хлористый натрий - 0,25, глюкоза - 1, деминерализованная вода - остальное, рН 7,2. Колбы инкубируют на качалке (280 об/мин) при 37°С в течение 8 часов. Выращенную культуру в количестве 5% от объема среды в ферментере стерильно засевают в лабораторный ферментер Marubishi MDL 100 объемом 1 л. Процесс ферментации ведут при 37°С при интенсивном перемешивании (800 об/мин), рН поддерживают в пределах 7.0-7.4 с помощью 12.5% NH₄OH и 6% H₂SO₄. Амилолитическую активность культуральной жидкости в ходе ферментации определяют по методу, описанному в примере 1. Данные по амилолитической активности культуральной жидкости во время ферментации суммированы в таблице 2.

Таблица 2 Штамм Амилолитическая активность, едГОСТ/мл 17 ч 48 ч 64 ч Заявляемый штамм: ВКПМ В-10291 215 839 900 Контрольный штамм: ВКПМ В-5144 198 710 780

На 64-й час ферментации амилолитическая активность культуральной жидкости штамма Bacillus amyloliquefaciens В-10291 составила 900 едГОСТ/мл, что на 15% превышает амилолитическую активность контрольного штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-5144 (780 едГОСТ/мл).

Пример 3. Расход пеногасителя в процессе культивирования штамма Bacillus amyloliquefaciens В-10291 в ферментере.

Процесс ферментации осуществляют как в примере 2. В процессе культивирования штамма Bacillus amyloliquefaciens В-10291 наблюдали меньшее пенообразование, чем у контрольного штамма, что позволило снизить расход пеногасителя в процессе ферментации в 3,8 раз (таблица 3).

Таблица 3 штамм Суммарный расход пеногасителя в процессе культивирования Заявляемый штамм: ВКПМ В-10291 1,3 мл Контрольный штамм: ВКПМ В-5144 5 мл

Таким образом, получен штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291, продуцирующий альфа-амилазу с активностью 900 едГОСТ/мл. Штамм устойчив к эритромицину и рифампицину, а также обладает пониженным пенообразованием в процессе культивирования, что позволяет уменьшить расход пеногасителя в процессе ферментации более чем в 3 раза, что облегчает выделение фермента из культуральной жидкости.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 получен многоступенчатой селекцией на среде, содержащей рифампицин, и последующим отбором наиболее продуктивных клонов, устойчивых к рифампицину. Штамм продуцирует альфа-амилазу с активностью 900 едГОСТ/мл. Штамм обладает пониженным уровнем пенообразования, что позволяет снизить количество использованного при ферментации пеногасителя более чем в 3 раза. 3 табл., 3 пр.

Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 - продуцент альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens.