СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ В КЛЕТКИ БЛАСТОДЕРМЫ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ТРАНСГЕННЫХ КУР Российский патент 2007 года по МПК C12N15/00 C12N15/63 C12N15/867 

Описание патента на изобретение RU2303068C1

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способам получения трансгенной птицы.

Известен способ получения трансгенных кур посредством микроинъекции ДНК в зиготу [Love J., Gribbin С, Mother С., Sang H. Transgenic birds by DNA microinjection // Biotechnology, 1994, - 12, 60-63]. Введение генных конструкций осуществляют в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки, после чего микроинъецированную зиготу культивируют in vitro в течение 18-24 часов в синтетической среде яйцевода. По окончании культивирования эмбрион переносят в суррогатное яйцо и инкубируют до вылупа при стандартных режимах инкубации. Недостатками данного метода являются необходимость забоя птицы для получения зигот, высокая трудоемкость метода, низкая эффективность интеграции, а также потребность в дорогостоящем оборудовании для культивирования клеток.

Известен способ получения трансгенных кур посредством введения трансформированных примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) кур в дорзальную аорту 2,5-дневных эмбрионов [Naito M., Tajima A., Yasuda Y., Kuwana T. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells // Mol Reprod Dev., 1994. - 39 (2), 153-161; Chang I.K., Jeong D.K., Hong Y.H., Park T.S. et al. Production of germline chimeric chikens by transfer of cultured primordial germ cells // Cell Biol. Int., 1997, - 21 (8), 495-499]. Использование примордиальных зародышевых клеток позволяет получать трансгенную птицу, несущую чужеродную ДНК в половых клетках. Однако процесс выделения, культивирования и трансформации ПЗК является достаточно трудоемким и сложным, требует высокой квалификации персонала и сопряжен с большими материальными затратами.

Известен способ получения трансгенных кур путем введения трансформированных клеток бластодермы в субзародышевую полость бластодиска неинкубированного яйца. Введение клеток бластодермы в клетки-мишени осуществляют посредством микроманипулятора через окно, вырезанное в скорлупе [Pettite J.N., Clark M.E., Liu G., Verrinder Gibbins A.M., Etches R.J. Production of comatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells // Development, 1990, - 108 (1), 185-189]. Для повышения химиризма получаемой трансгенной птицы используют также предварительное облучение УФ реципиентных клеток бластодермы, что позволяет сократить долю этих клеток по отношению к вводимым донорским клеткам [Thoraval P., Lassere F., Coudert F., Dambrine G. Somatic and germline chicken chimeras obtained from brown and white Leghorns by transfer of early blastodermal cells // Poult Sci., 1994, - 73 (12), 1897-1905; Carsience R.S., Clark M.E., Verrinder Gibbins A.M., Etches R.J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos // Development, 1993, - 117 (2), 669-675]. К недостаткам данного метода следует отнести высокую трудоемкость, повышенные требования к квалификации персонала, а также высокие материальные затраты.

Известен способ получения трансгенных кур посредством использования ретровирусных векторов, взятый в качестве прототипа. В данном случае раствор генных конструкций вводят в субзародышевую полость бластодиска неинкубированного яйца через окно диаметром 10-20 мм, вырезанное в экваториальной области яйца [Mazurei S., Ono К., Yamaguchi К., Nishijima К., Kamichira M., Iijima S. Production of transgenic quails with high frequency of germline transmission using VSV-G pseudotyped retroviral vector // Biochemical Biophysical Research Communications, 2001, - 286 (3), 456-463]. Использование ретровирусных векторов позволяет значительно повысить эффективность трансформации клеток-мишеней, однако применяемый способ введения генных конструкций является достаточно трудоемким и требует наличия специальной манипуляционной техники. К тому же вырезание окна в экваториальной области яйца с целью визуализации зародышевого диска оказывает сильное негативное влияние на развитие эмбриона, что выражается высокой эмбриональной смертностью.

Задача изобретения заключалась в разработке усовершенствованного способа получения трансгенной птицы, позволяющего снизить эмбриональную смертность и упростить процедуру введения генных конструкций в клетки-мишени при сохранении общей эффективности трансгенеза.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ получения трансгенных кур, включающий введение ретровирусных векторов в желток яйца вблизи бластодиска, особенностью которого является то, что введение генных конструкций осуществляют до инкубации с помощью инсулинового шприца через пробой в скорлупе яйца со стороны тупого конца, что, с одной стороны, не требует наличия специальной манипуляционной техники, с другой стороны, - не оказывает сильного негативного влияния на развитие эмбриона ввиду введения генных конструкций через тупой конец яйца без необходимости вырезания окошка в скорлупе.

Пример. Контрольное использование усовершенствованного способа получения трансгенных кур было проведено на курах кросса ППЗ «Смена». В качестве источника генных конструкций применяли вирусный препарат, представляющий собой среду культивирования клеток-упаковщиц. Для получения инъекционного раствора в вирусный препарат добавляли полибрен в концентрации 8 мкг/мл. Введение генных конструкций осуществляли в асептических условиях под ламинаром. Яйца перед инъекцией кратковременно фламбировали, после чего в тупом конце яйца делали прокол диаметром 1-2 мм, через который с помощью инсулинового шприца вводили раствор генных конструкций в объеме 50-100 мкл. При этом иглу шприца опускали на 2-3 см. После проведения необходимых манипуляций сделанное окно заливали расплавленным парафином. Микроинъецированные яйца инкубировали в течение 21 дня в специальных инкубаторах с соблюдением стандартных режимов инкубации. Из 50 проинъецированных яиц был получен 1 трансгенный петух, несущий рекомбинантную ДНК в клетках крови, печени, сердца и кишечника. Общая эффективность трансгенеза составила 4%. При этом развитие эмбрионов отмечалось в 54% случаев.

Изобретение применимо в биотехнологии, в частности в биоинженерии животных.

Похожие патенты RU2303068C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ КУР ОПОСРЕДОВАННЫМ ПЕРЕНОСОМ ГЕНА ПУТЕМ ОБЫЧНОГО ИСКУССТВЕННОГО ОСЕМЕНЕНИЯ 2011
  • Сураева Наталья Михайловна
  • Самойлов Артем Владимирович
  • Городецкий Станислав Иванович
  • Мартиросян Валентина Владимировна
  • Гороховец Неонила Васильевна
  • Барышников Анатолий Юрьевич
RU2517731C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ПТИЦ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 2007
  • Валарш Изабель
  • Батар Люк
  • Метали Мажид
RU2473688C2
СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ ПРИМОРДИАЛЬНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПТИЦ В ЭМБРИОН "IN OVO" 2023
  • Крутикова Анна Алексеевна
  • Пегливанян Григорий Карапетович
RU2818641C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 1996
  • Соболев А.С.
  • Розенкранц А.А.
  • Иванова М.М.
  • Смирнова О.А.
  • Никитин В.А.
  • Эрнст Л.К.
  • Народицкий Б.С.
RU2108714C1
СПОСОБЫ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ГАМЕТ У ПТИЦ 2001
  • Пардю Самюэль Л.
  • Петитт Джеймс Н.
  • Д'Коста Сюзн
RU2402208C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ 2009
  • Нестерова Анастасия Петровна
  • Головатенко-Абрамов Павел Кириллович
  • Платонов Евгений Семенович
  • Климов Евгений Александрович
  • Брускин Сергей Александрович
RU2425880C2
СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ ГЕНОМА ПТИЦЫ 1988
  • Фисинин В.И.
  • Эрнст Л.К.
  • Карапетян Р.В.
  • Матвеенко Н.П.
  • Зиадинова О.Ф.
  • Ениколопов Г.Н.
  • Кузин Б.А.
  • Зазыкина Т.В.
RU2022014C1
СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ГАМЕТ У ПТИЦ 2001
  • Пардю Самюэль Л.
  • Петитт Джеймс Н.
  • Д`Коста Сюзн
RU2294099C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПЛОДОТВОРЕННОСТИ ЯИЦ ПТИЦЫ 1999
  • Добренко А.М.
  • Давыдов В.М.
  • Хвосторезов П.Е.
RU2161404C1
ФЕРМЕНТ ЛИЗОСОМАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ НАКОПЛЕНИЯ 2011
  • Квинн Энтони
  • Харви Алекс Дж.
RU2575074C2

Реферат патента 2007 года СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ В КЛЕТКИ БЛАСТОДЕРМЫ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ТРАНСГЕННЫХ КУР

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способам получения трансгенной птицы. Для получения трансгенных кур введение ретровирусных векторов в клетки бластодермы осуществляют через пробой в скорлупе неинкубированного яйца со стороны тупого конца. С помощью инсулинового шприца вводят генные конструкции на глубину 2-3 см вблизи зародышевого диска. Способ позволяет упростить процедуру введения генных конструкций в клетки-мишени при сохранении общей эффективности трансгенеза, что способствует снижению эмбриональной смертности.

Формула изобретения RU 2 303 068 C1

Способ введения ретровирусных векторов в клетки бластодермы при получении трансгенных кур, отличающийся тем, что введение генных конструкций осуществляют через пробой в скорлупе неинкубированного яйца со стороны тупого конца с помощью инсулинового шприца на глубину 2-3 см вблизи зародышевого диска.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2303068C1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ СВИНЕЙ 1991
  • Готтфрид Брем[De]
  • Ульрих Вайдле[De]
RU2095412C1
US 6114168 А1, 05.09.2000
SHINJI MIZUARAI et
al., Produktion of Transgenic Qualis with High Frequency of Germ-Line Transmission Using VSV-G Pseudotyped Retroviral Vector, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 286, 456-463.

RU 2 303 068 C1

Авторы

Волкова Наталья Александровна

Волкова Людмила Александровна

Зиновьева Наталия Анатольевна

Эрнст Лев Константинович

Даты

2007-07-20Публикация

2005-10-31Подача