РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ-АНТИГЕНЫ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭПИТОПНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ АУТОРЕАКТИВНЫХ АНТИТЕЛ К ОТДЕЛЬНЫМ ФРАГМЕНТАМ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОГО ДОМЕНА ДЕСМОГЛЕИНА 3-ГО ТИПА ЧЕЛОВЕКА У БОЛЬНЫХ ОБЫКНОВЕННОЙ ПУЗЫРЧАТКОЙ, ТЕСТ-СИСТЕМА НА ИХ ОСНОВЕ Российский патент 2022 года по МПК C07K14/705 G01N33/68 

Описание патента на изобретение RU2770444C1

Изобретение относится к медицине, а именно - к дерматовенерологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностике и предназначено для выявления аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа (Dsg3) человека у больных пузырчаткой обыкновенной (L10.0 по МКБ-10). Изобретение может быть использовано для обнаружения аутореактивных антител к Dsg3 человека в сыворотке крови при проведении первичной диагностики пузырчатки, исследовании развития аутоимунного ответа на Dsg3 в динамике заболевания с построением соответствующего прогноза, выборе средств и методов для удаления аутореактивных антител из крови пациентов, а также для оценки эффективности проводимых терапевтических мероприятий.

Из уровня техники (Ishii K, Amagai М, Hall RP. et al.: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 1997; 159:2010-2017) известна чувствительная и специфичная экспериментальная тест-система иммуноферментного анализа (ELISA) для выявления суммарных аутоантител против Dsg3, положенная в основу коммерчески доступной тест-системы «MESACUP-2 TEST Desmoglein 3», выпускаемой фирмой MBL (Medical and Biological Laboratories Co. Ltd. Нагоя, Япония). В данной тест-системе используется полноразмерный рекомбинантный внеклеточный домен Dsg3 человека, продуцируемый клетками СНО (Chinese hamster ovary). Уровень антител в сыворотке крови оценивается индексом U/ml (Unit value/ml). Тест-система включает калибраторы 0, 20 и 100 U/ml, с использованием которых рассчитывается данный индекс. Значение индекса ≥20 свидетельствует о наличии антител к Dsg3. Существенным недостатком данной тест системы является отсутствие возможности построения калибровочного графика для количественной оценки уровня аутоантител против экстрацеллюлярного домена Dsg3, а также невозможность определения профиля аутоантител против отдельных фрагментов ЕС1-ЕС5 внеклеточного домена Dsg3 (Amagai М. Klaus-Kovtun V., Stanley J.R. Autoantibodies against a novel epithelial cadherin in pemphigus vulgaris, a disease of cell adhesion. Cell 1991; 67:869-877).

В другой известной системе ELISA (Schmidt E, C, Rosemann A. et al. Novel ELISA systems for antibodies to desmoglein 1 and 3: correlation of disease activity with serum autoantibody levels in individual pemphigus patients. Exp Dermatol. 2010; 19: 458-463) в качестве целевых антигенов применены экстрацеллюлярные домены Dsg1 и Dsg3, экспрессированные в клеточной линии человека HEK293. Уровень активности антител в исследуемом образце оценивается в сравнительных единицах - relative units в мл (RU/ml). Для количественной характеристики активности антител в состав тест-системы входят калибраторы 2, 20 и 200 RU/ml, на основе значений оптической плотности которых строится калибровочный график. Как и в тест-системе фирмы MBL, значение активности ≥20 RU/ml свидетельствует о наличии антител к Dsg3. Разработанная Schmidt Е. et al. тест-система в настоящее время коммерциализована и выпускается фирмой Euroimmun - «Anti-Dsg3 ELISA (IgG)» (Medizinische Labordiagnostika AG, Germany). Недостатком данной тест системы также является отсутствие возможности охарактеризовать специфичность аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека у больных вульгарной пузырчаткой.

Указанный недостаток рассматриваемых тест-систем имеет принципиальное значение, поскольку имеются сообщения о возможности преобладания в разные фазы заболевания аутоантител класса IgG, специфичных к разным (проксимальным С-концевым или дистальным N-концевым) фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3. При этом аутоантитела к дистальному фрагменту ЕС1, имея более низкую активность в ELISA, обладают большей патогенностью, в то время как более реакционно-активные антитела к проксимальным доменам ЕС4 и ЕС5 менее патогенны (Amagai М, Karpati S, Prussick R, Klaus-Kovtun V, Stanley J R. Autoantibodies against the amino-terminal cadherin-like binding domain of pemphigus vulgaris antigen are pathogenic. J Clin Invest 1992; 90: 919-926).

Другим аргументом в пользу необходимости анализа индивидуальных профилей иммунореактивности на способность взаимодействия с тем или иным фрагментом экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека является т.н. «теория распространения эпитопов» (Lehmann, P.V., Forsthuber, Т., Miller, A. and Sercarz, Е.Е. Spreading of T-cell autoimmunity to cryptic determinants of an autoantigen. Nature 1992; 358: 155-157. The first description of epitope spreading in an autoimmune disease). Согласно данным представлениям, у пациентов с обыкновенной пузырчаткой клинический переход от слизистого фенотипа к слизисто-кожному происходит из-за смены мишеней для аутореактивных антител. По данным Salato V. et al. (Salato V.K., Hacker-Foegen M.K., Zelmira Lazarova Z., Fairley J.A., Lin M-S. Role of intramolecular epitope spreading in pemphigus vulgaris. Clinical Immunology 2005; 116: 54-66), у большинства пациентов со слизистой формой пузырчатки аутоантитела направлены к проксимальной (С-концевой) части экстрацеллюлярного домена Dsg3, в то время как для развития повреждений кожи характерно появление антител к дистальным (N-концевым) эпитопам. В связи с этим возникает задача персонализированного наблюдения уровня аутоантител к различным фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека у пациентов с различным клиническим фенотипом вульгарной пузырчатки ( R., Svoboda V., Wenzel E et al. IgG against extracellular subdomains of desmoglein 3 relates to clinical phenotype of pemphigus vulgaris Exp Dermatol 2008; 17: 35-43).

Доступные технические решения, обеспечивающие возможность определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3 у больных обыкновенной пузырчаткой, из уровня техники не известны.

Техническая проблема, на решение которой направлен заявляемый способ, заключается в определении антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3 у больных обыкновенной пузырчаткой.

Техническим результатом заявляемого изобретения является возможность полуколичественной оценки аутоантител к полному экстрацеллюлярному домену десмоглеина 3-го типа и его наиболее иммуногенным отдельным фрагментам ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4, а также ЕС2-ЕС5 в сыворотке крови пациентов с вульгарной пузырчаткой.

Для решения заявленной технической проблемы и достижения технического результата предлагается применение рекомбинатного белка-антигена, содержащего рекомбинантный полноразмерный экстрацеллюлярный домен Dsg3full-His с последовательностью SEQ ID NO: 1 и его отдельные рекомбинантные фрагменты ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, имеющие последовательности SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно, для определения наличия аутореактивных антител к десмоглеину 3-го типа человека в крови больных обыкновенной пузырчаткой.

Предлагается способ определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, включающий исследование взаимодействия сыворотки крови с данным белком с использованием твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигенов для ИФА применяют белки-антигены, при этом исследование осуществляют в два этапа, на первом из которых осуществляют конкурентное истощение аутоантител к Dsg3full-His, ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно, и контрольному материалу - БСА, сорбированным на твердой фазе, а на втором осуществляют определение остаточных (непрореагировавших) аутоантител по отношению к Dsg3full-His с последовательностью SEQ ID NO: 1 с последующим расчетом коэффициента конкуренции по отношению к отдельным рекомбинантным белкам по формуле:

где AR - активность сыворотки после преинкубации в контакте с иммобилизованным рекомбинантным белком - ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His;

APos - активность сыворотки после преинкубации с полноразмерным Dsg3full-His;

ANeg - активность сыворотки после преинкубации в контрольной лунке с иммобилизированным БСА.

Предлагается тест-система для определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой способом по п. 5, содержащая сорбент, набор реагентов, концентрат конъюгата для определения содержания IgG-антител к Dsg3, отличающаяся тем, что в качестве сорбента выбран иммуносорбент.

Набор реагентов указанной тест-системы содержит положительную (+k) сыворотку, представляющую собой индивидуальную сыворотку от пациента с обыкновенной пузырчаткой с предварительно охарактеризованной активностью в отношении Dsg3 и профилем антигенной специфичности в отношении фрагментов экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека, и отрицательную (-k) сыворотку, сформированную из пула сывороток здоровых доноров.

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее: двухэтапный иммуноферментный анализ, включающий конкурентное «истощение» аутоантител к рекомбинантным белкам ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, сорбированным на твердой фазе, с последующим определением остаточных (непрореагировавших) аутоантител по отношению к полноразмерному экстрацеллюлярному домену десмоглеина 3-го типа человека, Dsg3full-His, позволяет охарактеризовать профиль антигенной специфичности аутореактивных антител с их выражением полуколичественной величиной (%) от общего значения аутореактивности.

Актуальность изобретения определяется ключевой патогенетической ролью в развитии обыкновенной пузырчатки, установленной для аутоантител класса IgG, направленных против основного структурного белка десмосом кожи человека - десмоглеина 3-го типа. Его экстрацеллюлярный домен, в котором выделяют 5 фрагментов (ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4, ЕС5) (англ. - extracellular domain; ЕС), вовлечен в формирование гомофильного контакта между соседствующими эпителиальными клетками. Результатом взаимодействия аутоантител с экстрацеллюлярным доменом Dsg3 является разрушение десмосом и развитие так называемого «акантолиза» - дегенеративного изменения шиповатого слоя эпидермиса, проявляющееся разрушением межклеточных мостиков и приводящего к образованию интраэпидермальных пузырей.

Изобретательский уровень заявляемого технического решения определяется применением двухэтапного иммуноферментного анализа на твердой фазе, позволяющим на первом этапе (за счет иммобилизованных в лунках полистироловых планшетов рекомбинантных белков - Dsg3full-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2), ЕС1-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4), EC2-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6), ЕС3-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8), EC4-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10), EC2-EC5-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12) осуществить специфическую сорбцию IgG, а на втором этапе определить количество остаточных (непрореагировавших) аутоантител к Dsg3-His с расчетом по оригинальной формуле полуколичественных показателей индивидуального профиля антигенной специфичности сыворотки крови больных вульгарной пузырчаткой.

Способ получения обозначенных выше рекомбинантных белков (ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, Dsg3rull-His), не является предметом настоящего изобретения и является самостоятельным техническим решением.

Соответственно, при реализации заявляемого способа характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления представляются следующим образом:

1) Исследуемая сыворотка крови разводится 1:100 в буфере (1% БСА в PBS), после чего аликвотами по 100 мкл вносится в лунки полистиролового планшета А, в одной из которых предварительно сорбирован рекомбинантный Dsg3full-His домен в количестве 1 мкг/лунку, в других - рекомбинантные EC1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His в количестве 1 мкг/лунку, а также БСА в той же концентрации для контроля неспецифической сорбции;

2) В аналогичные лунки планшета А вносятся положительная (+k) сыворотка, представляющая собой индивидуальную сыворотку от пациента с обыкновенной пузырчаткой с предварительно охарактеризованной активностью в отношении полноразмерного экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека и профилем антигенной специфичности в отношении отдельных фрагментов экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека, а также отрицательная (-k), сформированная из пула сывороток здоровых доноров;

3) Планшет А инкубируется в течение 18 часов при +24°С и встряхивании 200 rpm; сущностью этапа является конкурентное связывание (истощение) аутоантител определенной специфичности при взаимодействии с соответствующими рекомбинантными белками;

4) После завершения инкубации опытные и контрольные образцы исследуемых сывороток в полном объеме переносятся в лунки полистиролового планшета Б (табл. 1), сорбированного Dsg3full-His в количестве 1 мкг/лунку;

5) В дополнительные лунки планшета Б вносятся калибровочные образцы с активностями 20 и 200 RU/мл, сформированные на основе пула сывороток больных вульгарной пузырчаткой и предварительно количественно охарактеризованные по данной активности с использованием внешней (референсной) тест-системы;

6) Планшет Б заклеивается и инкубируется в том же режиме (18 час; +24°С; 200 rpm); сущностью этапа является связывание оставшихся после конкурентного «истощения» аутоантител с Dsg3full-His;

7) Планшет Б трехкратно промывается PBST;

8) В лунки планшета Б вносятся антитела к IgG человека, коньюгированные с пероксидазой хрена, после чего планшет инкубируется 60 мин при 22-24°С, затем 3-кратно промывается PBST;

9) В лунки планшета Б вносится субстратный раствор тетраметилбензидин (ТМБ) и инкубируется 30 мин;

10) Реакция останавливается внесением 4N раствора серной кислоты;

11) Оптическая плотность (ОП) результата ИФА регистрируется при 450 нм;

12) На основе ОП калибровочных образцов с активностями 20 и 200 RU/мл планшета Б строится калибровочная кривая, позволяющая определить активность каждой исследуемой сыворотки; активность выражается количественной величиной RU/мл;

13) На основе сравнения значений RU/мл каждой индивидуальной сыворотки, инкубированной в контрольной и опытных лунках планшета А и в дальнейшем анализируемой в планшете Б, рассчитывается степень ее специфического связывания (коэффициент конкуренции) по отношению к отдельным рекомбинантным белкам по формуле:

где AR - активность сыворотки после преинкубации в лунке планшета А, иммобилизованной рекомбинантным белком - ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His;

APos - активность сыворотки после преинкубации в лунке планшета А с Dsg3full-His;

ANeg - активность сыворотки после преинкубации в контрольной лунке планшета А с иммобилизированным БСА.

14) Качество проведенного исследования контролируется на основе значений ОП в лунках планшета Б, заполненных (-k) сывороткой (отсутствие детектируемых аутоантител) и (+k) сывороткой (наличие активности в отношении Dsg3full-His с отклонением ±10% от ранее охарактеризованного значения RU/мл; а также соответствие предварительно охарактеризованному профилю антигенной специфичности к ЕС1-His, ЕС2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, %).

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами и рисунками.

Фиг. 1 и Фиг. 2 Профиль антигенной специфичности образцов (коэффициенты конкуренции исследуемой сыворотки);

Фиг. 3. Схема экспрессионной кассеты;

Фиг. 4. Электрофореграмма (14% SDS-ПААГ для А, Б, Г, Д, Е и 10% SDS-ПААГ для В) элюированных фракций после металл-аффинной хроматографии на Ni2+-ИДА-сефарозе, нанесенных в присутствии β-меркаптоэтанола.

Пример 1.

Объектом исследования послужила сыворотка крови №0X11 из Коллекции сывороток крови от пациентов с клинически подтвержденным диагнозом «Пузырчатка обыкновенная» (L10.0 по МКБ-10), сформированной в ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России. Предварительно охарактеризованная (с использованием референсной тест-системы) суммарная активность данной сыворотки к полноразмерному внеклеточному домену Dsg3 человека характеризовалась величиной 200 RU/ml.

Конкурентное истощение аутоантител из данной сыворотки проводили на планшете А в отношении рекомбинантных белков Dsg3full-His, EC2-EC5-His, ЕС1-His, EC2-His, каждый из которых был сорбирован в дозе 1 мкг/лунку, а также БСА (контроль неспецифической сорбции) в такой же концентрации. Взаимодействие тестируемой сыворотки в объеме 100 мкл и рекомбинантных белков в планшете А проводилось при +24°С в течение 18 часов в условиях непрерывного перемешивания на шейкере при 200 rpm. После завершения инкубации образцы сыворотки в полном объеме были перенесены в лунки планшета Б, сорбированного белком Dsg3full-His в дозе 1 мкг/лунку. В дополнительные лунки планшета Б были внесены калибровочные образцы с активностями 20 и 200 RU/ml. Заполненный подобным образом планшет Б инкубировался при +24°С в течение 18 часов на шейкере при 200 rpm. Содержимое лунок было удалено и лунки трижды промыты PBS с 0,05% Tween 20 (PBST), после чего в лунки были внесены по 100 мкл антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. После часовой инкубации при +24°С лунки были отмыты, как описано выше, после чего в них было внесено по 100 мкл раствора тетраметилбензидина (субстрата для пероксидазы хрена) и через 30 мин реакция была остановлена добавлением 100 мкл серной кислоты. Оптическую плотность результатов реакции регистрировали при 450 нм.

На основе ОП калибровочных образцов с активностями 20 и 200 RU/мл строили калибровочный график, по которому определяли остаточную (после преинкубации в планшете А) активность образцов исследуемой сыворотки в каждой лунке планшета Б; активность выражали количественной величиной RU/мл. На основании полученных значений активности, пользуясь формулой 1, рассчитывалась коэффициент конкуренции сыворотки с каждым представленным на планшете А рекомбинантным белком. Полученный профиль антигенной специфичности представлен на Фиг. 1.

Как следует из представленных данных, исследуемая сыворотка интенсивно взаимодействовала с Dsg3full-His (100%). При этом особенностью профиля ее антигенной специфичности являлось отсутствие детектируемого аутоиммунного ответа на наиболее «патогенный» дистальный N-концевой домен ЕС1, при выраженном реагировании с доменом ЕС2, а также проксимальными (С-концевыми) эпитопами, присутствующими в составе EC2-EC5-His конструкта.

Полученный результат позволяет оценить прогноз течения заболевания как достаточно благоприятный и ограничиться проведением традиционной консервативной терапии с использованием глюкокортикоидных гормонов.

Пример 2.

В качестве источника аутоантител к Dsg3 использована нативная сыворотка крови №0Z218, полученная от пациента с клинически подтвержденным диагнозом «Пузырчатка обыкновенная» (L10.0 по МКБ-10) в фазе обострения, находящегося на стационарном лечении в ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России. Предварительно охарактеризованная активность данной сыворотки в отношении полноразмерного внеклеточного домена Dsg3 человека характеризовалась величиной 150 RU/ml.

Конкурентное истощение аутоантител из данной сыворотки проводили на планшете А в отношении рекомбинантных белков Dsg3full-His, EC1-His, EC2-His, и EC4-His, использованных в дозе 1 мкг/лунку, а также БСА в такой же концентрации. Взаимодействие тестируемой сыворотки и рекомбинантных белков в планшете А проводилось в условиях, описанных в Примере 1. После завершения инкубации образцы сыворотки в полном объеме были перенесены в лунки планшета Б, сорбированного рекомбинантным белком Dsg3full-His. Последовательность внесения реагентов и условия проведения реакции на планшете Б соответствуют описанию в примере 1.

На основании полученных значений активности, пользуясь формулой 1, были рассчитаны коэффициенты конкуренции исследуемой сыворотки с каждым представленным на планшете А рекомбинантным белком. Полученные значения представлены на Фиг. 2.

Определенный подобным образом профиль антигенной специфичности характеризовался преимущественным аутоимунным ответом на дистальные экстрацеллюлярные фрагменты ЕС1 и ЕС2, что соответствует представлениям о них как о наиболее «патогенных» эпитопах, связанных с развитием тяжело протекающих случаев вульгарной пузырчатки.

Полученный результат свидетельствует о прогрессирующем течении заболевания, что определяет необходимость его терапии с использованием методов иммуносорбции, направленных на селективную элиминацию антител к ЕС1 и ЕС2 фрагментам.

Пример 3.

Нуклеотидные последовательности экстрацеллюлярного домена десмоглеина-3 человека (Dsg3full) и его фрагментов (ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4, ЕС2-ЕС5) были амплифицированы методом ПЦР с плазмиды pUC57, содержащей синтезированную нуклеотидную последовательность лидерного пептида (Р32926 из базы данных UniProt) - прелидерного пептида (Р32926 из базы данных UniProt) - полноразмерного экстрацеллюлярного домена (Р32926 из базы данных UniProt) - 6His с использованием специфических олигонуклеотидов (таблица 1). На первом этапе были наработаны нуклеотидные последовательности самих фрагментов экстрацеллюлярного домена Dsg3 (ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4, ЕС2-ЕС5), на втором - методом SOE-ПЦР они были объединены в одной рамке считывания с ДНК фрагментами лидерного и прелидерного пептидов на 5'-конце и 6His на 3'-конце. Нуклеотидная последовательность, кодирующая экспрессионную кассету Dsg3full-His, была наработана в один этап.

Экспрессионные кассеты были клонированы в вектор pcDNA3.4 (Invitrogen, США) по сайтам рестрикции NheI и XhoI (фиг. 3).

Правильность нуклеотидных последовательностей была подтверждена секвенированием по методу Сенгера. Полученые экспрессионные плазмиды (pcDNA 3.4_EC1-His, pcDNA 3.4_EC2-His, pcDNA 3.4_EC3-His, pcDNA 3.4_EC4-His, EC2-EC5-His и pcDNA 3.4_Dsg3 full-His) были использованы для наработки рекомбинантных белков в клетках СНО.

Трансфекцию проводили с использованием реагента Липофектамин (Invitrogen, США). Клетки СНО в количестве 4×106 клеток/мл были пересеяны в колбу Эрленмейера, содержащую 30 мл культуральной среды CD OptiCHO (Invitrogen, США). Через сутки к клеткам добавляли 18-20 мкг плазмидной ДНК, смешанной с трансфекционным агентом в пропорциях, указанных производителем. Культивирование продолжали до снижения количества живых клеток в культуре до уровня 0.3×106 клеток/мл, что составляло 10-14 суток при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 8% CO2, при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере со скоростью 130 об/мин.

После завершения культивирования Dsg3 full-His и отдельные его фрагменты ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His были выделены из культуральной жидкости с помощью металл-аффинной хроматографии на Ni2+-ИДА-сефарозе. Клетки осаждали центрифугированием при скорости вращения 1200 об/мин в течение 10 мин, затем супернатанты, содержащие целевые белки, центрифугировали в течение 15 мин при скорости вращения 4000 об/мин. До выделения супернатанты хранили при температуре 4°С.

Культуральную среду, полученную после удаления клеток, диализовали 0,02 М натрий-фосфатным буфером, рН 7.5, содержащем 0.25 М NaCl. Для подготовки носителя 1 мл ИДА-сефарозы помещали в колонку, промывали 12-15 мл mQ и наносили 200 мкл 0.2 M NiSO4. Далее промывали колонку от слабо связавшихся ионов раствором 0.02 М CH3COONa, содержащем 0.5 М NaCl, 10-12 мл mQ и уравновешивали буфером для нанесения (0.02 М натрий-фосфатным буфером, 0.25 M NaCl, рН 7.5). После чего смешивали с соответствующим диализованным супернатантом и инкубировали в течение 1 ч при 4°С и перемешивании. Полученную смесь пропускали через колонку, промывали 10 мл буфера для нанесения. Элюцию белка проводили 0.3 М имидазолом в натрий-фосфатном буфере (промывка осуществлялась последовательно 0.01 М имидазолом и 0.03 М имидазолом).

Молекулярную массу и чистоту выделенных целевых белков: EC-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His и Dsg3 full-His, проверяли методом электрофоретического анализа в 14% или 10% SDS-ПААГ по Лэммли (фиг. 4).

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.2//EN"

"ST26SequenceListing_V1_2.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="Тест система Dsg3"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0-beta1" productionDate="2021-

12-10">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2020144116/10(082584)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2021-05-27</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), RU</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Shemyakin-Ovchinnikov Institute of bioorganic

chemistry</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">РЕКОМБИНАТНЫЕ БЕЛКИ - АНТИГЕНЫ И СПОСОБ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭПИТОПНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ АУТОРЕАКТИВНЫХ АНТИТЕЛ К ОТДЕЛЬНЫМ ФРАГМЕНТАМ

ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОГО ДОМЕНА ДЕСМОГЛЕИНА 3-ГО ТИПА ЧЕЛОВЕКА У БОЛЬНЫХ ОБЫКНОВЕННОЙ

ПУЗЫРЧАТКОЙ, ТЕСТ-СИСТЕМА НА ИХ ОСНОВЕ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>572</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..572</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFVVDKNTGDI

NITAIVDREETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKILDINDNPPVFSQQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHL

NSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVKDVNDNFPM

FRDSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLAVYFFTSGNEGNWFEIQTDPRTNEGILKVVKALDYEQLQS

VKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINVREGIAFRPASKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKA

ASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTAEIKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLAIDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPT

AVLEKDAVCSSSPSVVVSARTLNNRYTGPYTFALEDQPVKLPAVWSITTLNATSALLRAQEQIPPGVYHISLVLTD

SQNNRCEMPRSLTLEVCQCDNRGICGTSYPTTSPGTRYGRPHSGRHHHHHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1716</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1716</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaatgggtgaaatttgccaaaccctgcagagaaggagaagataactcaaaaagaaacccaat

tgccaagattacttcagattaccaagcaacccagaaaatcacctaccgaatctctggagtgggaatcgatcagccgccttttg

gaatctttgttgttgacaaaaacactggagatattaacataacagctatagtcgaccgggaggaaactccaagcttcctgatc

acatgtcgggctctaaatgcccaaggactagatgtagagaaaccacttatactaacggttaaaattttggatattaatgata

atcctccagtattttcacaacaaattttcatgggtgaaattgaagaaaatagtgcctcaaactcactggtgatgatactaaa

tgccacagatgcagatgaaccaaaccacttgaattctaaaattgccttcaaaattgtctctcaggaaccagcaggcacaccc

atgttcctcctaagcagaaacactggggaagtccgtactttgaccaattctcttgaccgagagcaagccagcagctatcgtc

tggttgtgagtggtgcagacaaagatggagaaggactatcaactcaatgtgaatgtaatattaaagtgaaagatgtcaacga

taacttcccaatgtttagagactctcagtattcagcacgtattgaagaaaatattttaagttctgaattacttcgatttcaa

gtaacagatttggatgaagagtacaccgataattggcttgcagtatatttctttacctctgggaatgaaggaaattggtttg

aaatacaaactgatcctagaactaatgaaggcatcctgaaagtggtgaaggctctagattatgaacaactacaaagcgtgaa

acttagtattgctgtcaaaaacaaagctgaatttcaccaatcagttatctctcgataccgagttcagtcaaccccagtcacg

attcaggtaataaatgtaagagaaggaattgcattccgtcctgcttccaagacatttactgtgcaaaaaggcataagtagca

aaaaattggtggattatatcctgggaacatatcaagccatcgatgaggacactaacaaagctgcctcaaatgtcaaatatgt

catgggacgtaacgatggtggatacctaatgattgattcaaaaactgctgaaatcaaatttgtcaaaaatatgaaccgagat

tctactttcatagttaacaaaacaatcacagctgaggttctggccatagatgaatacacgggtaaaacttctacaggcacgg

tatatgttagagtacccgatttcaatgacaattgtccaacagctgtcctcgaaaaagatgcagtttgcagttcttcaccttc

cgtggttgtctccgctagaacactgaataatagatacactggcccctatacatttgcactggaagatcaacctgtaaagttg

cctgccgtatggagtatcacaaccctcaatgctacctcggccctcctcagagcccaggaacagatacctcctggagtatacc

acatctccctggtacttacagacagtcagaacaatcggtgtgagatgccacgcagcttgacactggaagtctgtcagtgtga

caacaggggcatctgtggaacttcttacccaaccacaagccctgggaccaggtatggcaggccgcactcagggaggcatcac

catcaccatcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFVVDKNTGDI

NITAIVDREETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKILDINDNPPVFSHHHHHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>345</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..345</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaatgggtgaaatttgccaaaccctgcagagaaggagaagataactcaaaaagaaacccaa

ttgccaagattacttcagattaccaagcaacccagaaaatcacctaccgaatctctggagtgggaatcgatcagccgccttttg

gaatctttgttgttgacaaaaacactggagatattaacataacagctatagtcgaccgggaggaaactccaagcttcctgatc

acatgtcgggctctaaatgcccaaggactagatgtagagaaaccacttatactaacggttaaaattttggatattaatgata

atcctccagtattttcacatcaccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>116</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..116</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEV

RTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVKDVNDNFPMFRHHHHHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>348</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..348</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caacaaattttcatgggtgaaattgaagaaaatagtgcctcaaactcactggtgatgatac

taaatgccacagatgcagatgaaccaaaccacttgaattctaaaattgccttcaaaattgtctctcaggaaccagcaggcaca

cccatgttcctcctaagcagaaacactggggaagtccgtactttgaccaattctcttgaccgagagcaagccagcagctatcg

tctggttgtgagtggtgcagacaaagatggagaaggactatcaactcaatgtgaatgtaatattaaagtgaaagatgtcaacg

ataacttcccaatgtttagacatcaccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLAVYFFTSGNEGNWFEIQTDPRTNEGI

LKVVKALDYEQLQSVKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINVREGIAFHHHHHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>363</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..363</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gactctcagtattcagcacgtattgaagaaaatattttaagttctgaattacttcgattt

caagtaacagatttggatgaagagtacaccgataattggcttgcagtatatttctttacctctgggaatgaaggaaattgg

tttgaaatacaaactgatcctagaactaatgaaggcatcctgaaagtggtgaaggctctagattatgaacaactacaaagc

gtgaaacttagtattgctgtcaaaaacaaagctgaatttcaccaatcagttatctctcgataccgagttcagtcaacccca

gtcacgattcaggtaataaatgtaagagaaggaattgcattccatcaccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>122</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..122</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RPASKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKAASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTAE

IKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLAIDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPTAVLEKHHHHHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>366</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..366</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgtcctgcttccaagacatttactgtgcaaaaaggcataagtagcaaaaaattggtggatt

atatcctgggaacatatcaagccatcgatgaggacactaacaaagctgcctcaaatgtcaaatatgtcatgggacgtaacgat

ggtggatacctaatgattgattcaaaaactgctgaaatcaaatttgtcaaaaatatgaaccgagattctactttcatagttaa

caaaacaatcacagctgaggttctggccatagatgaatacacgggtaaaacttctacaggcacggtatatgttagagtacccg

atttcaatgacaattgtccaacagctgtcctcgaaaaacatcaccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>463</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..463</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRT

LTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVKDVNDNFPMFRDSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLA

VYFFTSGNEGNWFEIQTDPRTNEGILKVVKALDYEQLQSVKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINVREGIAFRPA

SKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKAASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTAEIKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLA

IDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPTAVLEKDAVCSSSPSVVVSARTLNNRYTGPYTFALEDQPVKLPAVWSITTLNATSAL

LRAQEQIPPGVYHISLVLTDSQNNRCEMPRSLTLEVCQCDNRGICGTSYPTTSPGTRYGRPHSGRHHHHHH</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1389</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1389</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caacaaattttcatgggtgaaattgaagaaaatagtgcctcaaactcactggtgatgatac

taaatgccacagatgcagatgaaccaaaccacttgaattctaaaattgccttcaaaattgtctctcaggaaccagcaggcaca

cccatgttcctcctaagcagaaacactggggaagtccgtactttgaccaattctcttgaccgagagcaagccagcagctatcg

tctggttgtgagtggtgcagacaaagatggagaaggactatcaactcaatgtgaatgtaatattaaagtgaaagatgtcaacg

ataacttcccaatgtttagagactctcagtattcagcacgtattgaagaaaatattttaagttctgaattacttcgatttca

agtaacagatttggatgaagagtacaccgataattggcttgcagtatatttctttacctctgggaatgaaggaaattggttt

gaaatacaaactgatcctagaactaatgaaggcatcctgaaagtggtgaaggctctagattatgaacaactacaaagcgtga

aacttagtattgctgtcaaaaacaaagctgaatttcaccaatcagttatctctcgataccgagttcagtcaaccccagtcac

gattcaggtaataaatgtaagagaaggaattgcattccgtcctgcttccaagacatttactgtgcaaaaaggcataagtagc

aaaaaattggtggattatatcctgggaacatatcaagccatcgatgaggacactaacaaagctgcctcaaatgtcaaatatg

tcatgggacgtaacgatggtggatacctaatgattgattcaaaaactgctgaaatcaaatttgtcaaaaatatgaaccgaga

ttctactttcatagttaacaaaacaatcacagctgaggttctggccatagatgaatacacgggtaaaacttctacaggcacg

gtatatgttagagtacccgatttcaatgacaattgtccaacagctgtcctcgaaaaagatgcagtttgcagttcttcacctt

ccgtggttgtctccgctagaacactgaataatagatacactggcccctatacatttgcactggaagatcaacctgtaaagtt

gcctgccgtatggagtatcacaaccctcaatgctacctcggccctcctcagagcccaggaacagatacctcctggagtatac

cacatctccctggtacttacagacagtcagaacaatcggtgtgagatgccacgcagcttgacactggaagtctgtcagtgtg

acaacaggggcatctgtggaacttcttacccaaccacaagccctgggaccaggtatggcaggccgcactcagggaggcatca

ccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Похожие патенты RU2770444C1

название год авторы номер документа
СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПУЗЫРЧАТКИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЛИГАНДА Fas 2009
  • Пинчелли, Карло
  • Маркони, Алессандра
RU2556818C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АНТИТЕЛ-IgG К ДЕСМОГЛЕИНУ 3 ТИПА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПУЗЫРЧАТКОЙ 2015
  • Кубанова Анна Алексеевна
  • Кубанов Алексей Алексеевич
  • Карамова Арфения Эдуардовна
  • Абрамова Татьяна Валерьевна
RU2622005C2
Антитела к CD38 и фармацевтические композиции на их основе для лечения аутоиммунного заболевания, опосредованного аутоантителами 2020
  • Клункер Даниел
  • Боксхаммер Райнер
  • Хертле Штефан
  • Штайдль Штефан
  • Ярутат Тиантом
RU2809565C2
ПРИМЕНЕНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ДЕСМОГЛЕИНУ 3 ТИПА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ПУЗЫРЧАТКОЙ 2016
  • Кубанова Анна Алексеевна
  • Кубанов Алексей Алексеевич
  • Дерябин Дмитрий Геннадьевич
  • Карамова Арфения Эдуардовна
  • Абрамова Татьяна Валерьевна
  • Шпилевая Марина Валентиновна
RU2627652C1
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПЕМФИГУСА, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА К Fas-ЛИГАНДУ 2008
  • Пинчелли, Карло
  • Маркони, Алессандра
RU2558260C2
СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА 2012
  • Хеммер Бернхард
  • Сривастава Раджниш
RU2601298C2
ПОЛИПЕПТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ТРОМБОВ 2019
  • Чан, Тсе-Вэнь
  • Чу, Хсинг-Мао
  • Тиан, Вэй-Тин
  • Чан, Тин-Вэй
  • Се, Мин-Ю
RU2778566C1
Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела 2021
  • Щебляков Дмитрий Викторович
  • Есмагамбетов Ильяс Булатович
  • Фаворская Ирина Алексеевна
  • Должикова Инна Вадимовна
  • Лебедин Юрий Степанович
  • Деркаев Артем Алексеевич
  • Рябова Екатерина Игоревна
  • Прокофьев Владимир Владимирович
  • Алексеева Ирина Александровна
  • Воронина Дарья Владимировна
  • Зорков Илья Дмитриевич
  • Ковыршина Анна Витальевна
  • Илюхина Анна Алексеевна
  • Ботиков Андрей Геннадьевич
  • Карпов Андрей Павлович
  • Лубенец Надежда Леонидовна
  • Зубкова Ольга Вадимовна
  • Семихин Александр Сергеевич
  • Народицкий Борис Савельевич
  • Логунов Денис Юрьевич
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2769223C1
СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 2020
  • Костин Никита Николаевич
  • Бобик Татьяна Владимировна
  • Цабай Полина Николаевна
  • Скрябин Георгий Андреевич
  • Балмасова Ирина Петровна
  • Симонова Мария Александровна
  • Мокрушина Юлиана Анатольевна
  • Смирнов Иван Витальевич
  • Алешенко Наталья Леонидовна
  • Никитин Алексей Эдуардович
  • Быков Андрей Юрьевич
  • Чехонин Владимир Павлович
  • Габибов Александр Габибович
RU2730897C1
Рекомбинантная ДНК, обеспечивающая получение рекомбинантного белка Cov1, обладающего иммуногенными свойствами в отношении вируса SARS-CoV-2 2021
  • Королева Ирина Владимировна
  • Суворов Александр Николаевич
  • Леонтьева Галина Федоровна
  • Крамская Татьяна Анатольевна
  • Дешева Юлия Андреевна
  • Шведова Тамара Николаевна
RU2776484C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 770 444 C1

Реферат патента 2022 года РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ-АНТИГЕНЫ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭПИТОПНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ АУТОРЕАКТИВНЫХ АНТИТЕЛ К ОТДЕЛЬНЫМ ФРАГМЕНТАМ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОГО ДОМЕНА ДЕСМОГЛЕИНА 3-ГО ТИПА ЧЕЛОВЕКА У БОЛЬНЫХ ОБЫКНОВЕННОЙ ПУЗЫРЧАТКОЙ, ТЕСТ-СИСТЕМА НА ИХ ОСНОВЕ

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным антигенам десмоглеина человека, и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике пузырчатки обыкновенной. Изобретение обеспечивает возможность определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой за счет применения рекомбинатного белка-антигена, содержащего белки-антигены экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагментов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, соответственно. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 770 444 C1

1. Применение рекомбинатного белка-антигена, содержащего белки-антигены экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагментов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно, для определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой.

2. Способ определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, включающий исследование взаимодействия сыворотки крови с данным белком с использованием твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигенов для ИФА применяют белки-антигены экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагменты, при этом исследование осуществляют в два этапа, на первом из которых осуществляют конкурентное истощение аутоантител к белкам-антигенам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагментам, имеющим последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно, и контрольному материалу - БСА, сорбированным на твердой фазе, а на втором осуществляют определение непрореагировавших аутоантител по отношению к Dsg3full-His с последовательностью SEQ ID NO 1 с последующим расчетом коэффициента конкуренции по отношению к отдельным рекомбинантным белкам по формуле:

где AR - активность сыворотки после преинкубации в контакте с иммобилизованными рекомбинантными белками - ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, имеющими последовательности SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11;

APos - активность сыворотки после преинкубации с полноразмерным Dsg3full-His, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1;

ANeg - активность сыворотки после преинкубации в контрольной лунке с иммобилизированным БСА.

3. Тест-система для определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой способом по п. 2, содержащая иммуносорбент, включающий белки-антигены экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагменты, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно; набор реагентов, содержащий положительную (+k) сыворотку, представляющую собой индивидуальную сыворотку от пациента с обыкновенной пузырчаткой с предварительно охарактеризованной активностью в отношении Dsg3 и профилем антигенной специфичности в отношении фрагментов экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека, и отрицательную (-k) сыворотку, сформированную из пула сывороток здоровых доноров; и концентрат конъюгата антител к IgG человека с пероксидазой хрена для определения содержания IgG-антител к Dsg3.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2770444C1

WO 2016016654 A1, 04.02.2016
US 10301370 B2, 28.05.2019
US 7550562 A, 23.06.2009
СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 2020
  • Костин Никита Николаевич
  • Бобик Татьяна Владимировна
  • Цабай Полина Николаевна
  • Скрябин Георгий Андреевич
  • Балмасова Ирина Петровна
  • Симонова Мария Александровна
  • Мокрушина Юлиана Анатольевна
  • Смирнов Иван Витальевич
  • Алешенко Наталья Леонидовна
  • Никитин Алексей Эдуардович
  • Быков Андрей Юрьевич
  • Чехонин Владимир Павлович
  • Габибов Александр Габибович
RU2730897C1
ПРИМЕНЕНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ДЕСМОГЛЕИНУ 3 ТИПА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ПУЗЫРЧАТКОЙ 2016
  • Кубанова Анна Алексеевна
  • Кубанов Алексей Алексеевич
  • Дерябин Дмитрий Геннадьевич
  • Карамова Арфения Эдуардовна
  • Абрамова Татьяна Валерьевна
  • Шпилевая Марина Валентиновна
RU2627652C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АНТИТЕЛ-IgG К ДЕСМОГЛЕИНУ 3 ТИПА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПУЗЫРЧАТКОЙ 2015
  • Кубанова Анна Алексеевна
  • Кубанов Алексей Алексеевич
  • Карамова Арфения Эдуардовна
  • Абрамова Татьяна Валерьевна
RU2622005C2
FRANKEL A.E
et al
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
ARNAU J
et al
Current

RU 2 770 444 C1

Авторы

Кубанов Алексей Алексеевич

Дерябин Дмитрий Геннадьевич

Никоноров Александр Александрович

Шпилевая Марина Валентиновна

Карамова Арфеня Эдуардовна

Ларина Екатерина Николаевна

Алиев Теймур Кантамирович

Смирнов Иван Витальевич

Габибов Александр Габибович

Кирпичников Михаил Петрович

Даты

2022-04-18Публикация

2021-05-27Подача