Родственные заявки
В соответствии с данной заявкой испрашивается приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США № 60/141031, поданной 25 июня 1999 года. В соответствии с данной заявкой испрашивается также приоритет по заявке на выдачу патента Германии № 19931636.8, поданной 8 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932125.6, поданной 9 июля 1999 года, по заявке Германии на выдачу патента № 19932126.4, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932127.2, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932128.0, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932129.9, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932226.0, поданной 9 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932920.6, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932922.2, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932924.9, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932928.1, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932930.3, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932933.8, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932935.4, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19932973.7, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19933002.6, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19933003.4, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19933005.0, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19933006.9, поданной 14 июля 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19941378.9, поданной 31 августа 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19941379.7, поданной 31 августа 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19941390.8, поданной 31 августа 1999 года, по заявке на выдачу патента Германии № 19941391.6, поданной 31 августа 1999 года, и по заявке на выдачу патента Германии № 19942088.2, поданной 3 сентября 1999 года. Полные содержания всех вышеуказанных заявок специально включены здесь этой ссылкой.
Предпосылки изобретения
Определенные продукты и побочные продукты природных метаболических процессов в клетках имеют применение в широком круге отраслей промышленности, в том числе в пищевой, кормовой, косметической и фармацевтической промышленностях. Эти молекулы, совокупно называемые «химическими продуктами тонкого органического синтеза», включают в себя органические кислоты, как белковые, так и небелковые аминокислоты, нуклеотиды и нуклеозиды, липиды и жирные кислоты, двухатомные спирты, углеводы, ароматические соединения, витамины и кофакторы и ферменты. Их получение наиболее удобно выполнять посредством крупномасштабной культуры бактерий, разработанной для продуцирования и секреции больших количеств конкретной желаемой молекулы. Одним особенно применимым организмом для этой цели является Corynebacterium qlutamicum, грамположительная непатогенная бактерия. Посредством отбора штаммов был получен ряд мутантных штаммов, которые продуцируют ряд желаемых соединений. Однако, отбор штаммов, улучшенных в отношении продуцирования конкретной молекулы, является время- и трудоемким процессом.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к новым бактериальным молекулам нуклеиновых кислот, которые имеют множество применений. Эти применения включают в себя идентификацию микроорганизмов, которые могут быть использованы для получения химических продуктов тонкого органического синтеза, модуляции образования химических продуктов тонкого органического синтеза в С. qlutamicum или родственных бактериях, типирования или идентификации С. qlutamicum или родственных бактерий, в качестве ссылочных точек для картирования генома С. glutamicum и в качестве маркеров для трансформации. Эти новые молекулы нуклеиновых кислот кодируют белки, называемые здесь белками гомеостаза и адаптации (НА).
С. glutamicum является грамположительной, аэробной бактерией, которую обычно используют в промышленности для крупномасштабного производства множества химических продуктов тонкого органического синтеза, а также для разрушения углеводородов (например, в разливах нефти) и для окисления терпеноидов. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот НА данного изобретения могут быть использованы для идентификации микроорганизмов, которые могут быть использованы для производства химических продуктов тонкого органического синтеза, например, посредством ферментационных процессов. Модуляция экспрессии нуклеиновых кислот НА данного изобретения или модификация последовательности молекул нуклеиновых кислот НА данного изобретения может использоваться для модуляции образования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из микроорганизма (например, для улучшения выхода или производства одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из видов Corynebacterium или Brevibacterium).
Нуклеиновые кислоты НА данного изобретения могут быть также использованы для идентификации организма как являющегося Corynebacterium glutamicum или близкородственной бактерией или для идентификации присутствия С. glutamicum или родственной бактерии в смешанной популяции микроорганизмов. Данное изобретение относится к последовательности нуклеиновых кислот ряда генов С. glutamicum; зондированием экстрагированной геномной ДНК культуры уникальной или смешанной популяции микроорганизмов в жестких условиях зондом, охватывающим область гена С. glutamicum, которая является уникальной для данного организма, можно определить, присутствует ли данный организм. Хотя сама бактерия Corynebacterium glutamicum является непатогенной, она является родственной видам, патогенным в человеке, таким как Corynebacterium diphtheriae (возбудитель дифтерии); выявление таких организмов имеет важное клиническое значение.
Молекулы нуклеиновых кислот НА данного изобретения могут также служить в качестве точек сравнения для картирования генома С. glutamicum или геномов родственных организмов. Подобным образом, эти молекулы, или их варианты или части, могут служить в качестве маркеров для генетически сконструированных видов Corynebacterium или Brevibacterium.
Белки НА, кодируемые новыми молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения, способны, например, выполнять функцию, участвующую в поддержании гомеостаза в С. glutamicum, или участвовать в способности этого микроорганизма адаптироваться к различным условиям окружающей среды. При условии доступности клонирующих векторов для применения в Corynebacterium glutamicum, таких как векторы, описанные в патенте США 4 649 110, выданном Sinskey et al., и способов для генетической манипуляции С. glutamicum и родственных видов Brevibacterium (например, lactofermentum) (Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984) и Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)), молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть использованы в генетической инженерии этого организма, чтобы сделать его лучшим или более эффективным продуцентом одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза. Это улучшенное продуцирование или улучшенная эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза могут быть обусловлены прямым действием манипулирования геном данного изобретения или могут быть обусловлены непрямым действием такого манипулирования.
Существует ряд механизмов, при помощи которых изменение белка НА данного изобретения может непосредственно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из штамма С. glutamicum, включающего в себя такой измененный белок. Например, посредством конструирования ферментов, которые модифицируют или разрушают ароматические или алифатические соединения таким образом, что эти ферменты повышаются или уменьшаются в активности или числе, можно модулировать продуцирование одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза, которые являются продуктами модификации или разрушения этих соединений. Подобным образом, ферменты, участвующие в метаболизме неорганических соединений, относятся к ключевым молекулам (например, молекулы фосфора, серы и азота) для биосинтеза таких химических продуктов тонкого органического синтеза, как аминокислоты, витамины и нуклеиновые кислоты. Посредством изменения активности или числа этих ферментов в С. glutamicum можно повышать превращение этих неорганических соединений (или использовать другие неорганические соединения) для создания возможности улучшенных скоростей включения неорганических атомов в эти химические продукты тонкого органического синтеза. Генетическое конструирование ферментов С. glutamicum, участвующих в основных клеточных процессах, может также прямо улучшать продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза, так как многие из этих ферментов непосредственно модифицируют химические продукты тонкого органического синтеза (например, аминокислоты), или ферментов, которые участвуют в синтезе или секреции химических продуктов тонкого органического синтеза. Модулирование активности ряда клеточных протеаз может также оказывать прямое действие на продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза, так как многие протеазы могут разрушать химические продукты тонкого органического синтеза или ферменты, участвующие в продуцировании или распаде химических продуктов тонкого органического синтеза.
Далее, вышеуказанные ферменты, участвующие в модификации или разрушении ароматических/алифатических соединений, общем биокатализе, метаболизме или протеолизе неорганических соединений, сами могут быть химическими продуктами тонкого органического синтеза, активность которых является желательной в различных промышленных применениях in vitro. Посредством изменения числа копий гена для одного или нескольких из этих ферментов в С. glutamicum можно увеличивать число этих белков, продуцируемых клеткой, повышая тем самым потенциальный выход или эффективность продуцирования этих белков крупномасштабными культурами С. glutamicum или родственными бактериальными культурами.
Изменение белка НА данного изобретения может также опосредованно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из С. glutamicum, включающего в себя такой измененный белок. Например, посредством модулирования активности и/или числа белков, участвующих в построении или перестройке клеточной стенки, может стать возможной модификация структуры самой клеточной стенки таким образом, что эта клетка будет способна лучше противостоять механическому стрессу или другим стрессам, присутствующим во время крупномасштабного ферментационного культивирования. Кроме того, крупномасштабное культивирование С. glutamicum требует интенсивного продуцирования клеточных стенок. Модулирование активности или числа биосинтетических или разрушающих ферментов клеточной стенки может обеспечить более высокие скорости биосинтеза клеточных стенок, что, в свою очередь, может обеспечить более высокие скорости роста этого микроорганизма в культуре и посредством этого увеличить число клеток, продуцирующих желательный химический продукт тонкого органического синтеза.
Модификацией ферментов НА данного изобретения можно непосредственно влиять на выход, продуцирование или эффективность продуцирования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum. Например, многие основные ферменты в С. glutamicum могут оказывать значительное влияние на глобальные клеточные процессы (например, регуляторные процессы), которые, в свою очередь, оказывают сильное влияние на метаболизм химических продуктов тонкого органического синтеза. Подобным образом, протеазы, ферменты, которые модифицируют или разрушают токсические ароматические или алифатические соединения, и ферменты, которые стимулируют метаболизм неорганических соединений, - все могут служить для увеличения жизнеспособности С. glutamicum. Участие протеаз в селективном удалении белков с неправильной укладкой или неправильной регуляцией, таких как белки, которые могут появляться при относительно стрессовых условиях окружающей среды, встречающихся во время крупномасштабного культивирования в ферментере. Посредством изменения этих белков можно дополнительно повысить эту активность и улучшать жизнеспособность С. glutamicum в культуре. Белки модификации или разрушения ароматических/алифатических соединений не только служат для детоксикации этих соединений-отходов (которые могут встречаться в виде примесей в культуральной среде или в виде соединений-отходов из самих клеток), но также позволяют клеткам использовать альтернативные источники углерода, если оптимальный источник углерода является лимитирующим в данной культуре. Посредством увеличения их числа и/или активности может быть повышено выживание клеток С. glutamicum в культуре. Белки метаболизма неорганических соединений данного изобретения снабжают клетку неорганическими молекулами, необходимыми для синтеза всех белков и нуклеотидов (среди прочих), и, следовательно, являются критическими для общей жизнеспособности клетки. Увеличение в числе жизнеспособных клеток, продуцирующих один или несколько химических продуктов тонкого органического синтеза в крупномасштабной культуре, должно приводить к сопутствующему повышению выхода, продуцирования и/или эффективности продуцирования данного химического продукта тонкого органического синтеза в культуре.
Данное изобретение относится к новым молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, называемые здесь белками НА, которые способны, например, выполнять функцию, участвующую в поддержании гомеостаза в С. glutamicum, или участвовать в способности этого микроорганизма адаптироваться к различным условиям окружающей среды. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белок НА, называют здесь молекулами нуклеиновых кислот НА. В предпочтительном варианте белок НА участвует в биосинтезе или перестройках клеточной стенки С. glutamicum, метаболизме неорганических соединений, модификации или разрушения ароматических или алифатических соединений или обладает ферментативной или протеолитической активностью С. glutamicum. Примеры таких белков включают в себя белки, кодируемые генами, представленными в таблице 1.
Таким образом, один аспект данного изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот (например, кДНК, ДНК или РНК), содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую белок НА или его биологически активные части, а также фрагментам нуклеиновых кислот, пригодным в качестве праймеров или гибридизационных зондов для обнаружения или амплификации НА-кодирующей нуклеиновой кислоты (например, ДНК или мРНК). В особенно предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит одну из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...), или кодирующую область или ее комплемент одной из этих нуклеотидных последовательностей. В других особенно предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью или является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70%, 80% или 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности, представленной в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...), или ее части. В других предпочтительных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует одну из аминокислотных последовательностей, представленных в виде имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8...). Предпочтительные белки НА данного изобретения также предпочтительно имеют, по меньшей мере, одну из описанных здесь активностей НА.
В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок или его часть, причем этот белок или его часть включает в себя аминокислотную последовательность, которая является достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей), например, достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения, так что этот белок или его часть сохраняет активность НА. Предпочтительно, белок или его часть, кодируемые этой молекулой нуклеиновой кислоты, сохраняют способность участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. В одном варианте белок, кодируемый указанной молекулой нуклеиновой кислоты, является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60% и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70%, 80% или 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным аминокислотной последовательности данного изобретения (например, полной аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей, имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей). В другом предпочтительном варианте этот белок является полноразмерным белком С. glutamicum, который является существенно гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (кодируемой открытой рамкой считывания, показанной в соответствующих имеющих нечетные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...).
В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты происходит из С. glutamicum и кодирует белок (например, слитый белок НА), который включает в себя биологически активный домен, который, по меньшей мере, приблизительно на 50% или более гомологичен одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательности одной из имеющих четные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей) и способен участвовать в репарации или рекомбинации ДНК, в транспозиции генетического материала, в экспрессии генов (т.е. процессах транскрипции или трансляции), в укладке белков или в секреции белков Corynebacterium glutamicum, или имеет одну или несколько активностей, представленных в таблице 1, и также включает в себя гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие гетерологичные полипептид или регуляторные области.
В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты имеет длину, по меньшей мере, 15 нуклеотидов и гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность данного изобретения (например, последовательность, имеющая нечетный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей). Предпочтительно, выделенная молекула нуклеиновой кислоты соответствует нативной молекуле нуклеиновой кислоты. Более предпочтительно, выделенная нуклеиновая кислота кодирует нативный белок НА С. glutamicum или его биологически активную часть.
Другой аспект данного изобретения относится к векторам, например, рекомбинантным экспрессирующим векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения, и клеткам-хозяевам, в которые были введены такие векторы. В одном варианте такую клетку-хозяина используют для производства белка НА культивированием клетки-хозяина в подходящей среде. Затем белок НА может быть выделен из этой среды или из клетки-хозяина.
Еще один аспект данного изобретения относится к генетически измененному микроорганизму, в который ген НА был введен или изменен. В одном варианте геном микроорганизма был изменен введением молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения, кодирующей последовательность НА дикого типа или мутированную последовательность НА, в качестве трансгена. В другом варианте эндогенный ген НА в геноме микроорганизма был изменен, например, функционально нарушен, гомологичной рекомбинацией с измененным геном НА. В другом варианте эндогенный или введенный ген НА в микроорганизме был изменен одной или несколькими точковыми мутациями, делециями или инверсиями, но все еще кодирует функциональный ген белка НА. Еще в одном варианте один или несколько регуляторных областей (например, промотор, репрессор или индуктор) гена НА в микроорганизме были изменены (например, делецией, укорочением, инверсией или точковой мутацией), так что экспрессия гена НА является модулированной. В предпочтительном варианте этот микроорганизм принадлежит к роду Corynebacterium или Brevibacterium, причем особенно предпочтительным является Corynebacterium glutamicum. В предпочтительном варианте этот микроорганизм используют также для получения желаемого соединения, такого как аминокислота, причем особенно предпочтительным является лизин.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу идентификации присутствия или активности Corynebacterium diphtheriae в субъекте. Этот способ включает в себя обнаружение одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательностей, представленных в Списке последовательностей в виде SEQ ID NO:1-440) в субъекте, посредством чего определяют присутствие или активность Corynebacterium diphtheriae в субъекте.
Еще один аспект данного изобретения относится к выделенным белку НА или его части, например, его биологически активной части. В предпочтительном варианте выделенные белок НА или его часть может участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или может выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. В другом предпочтительном варианте выделенные белок НА или его часть являются достаточно гомологичными аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: в Списке последовательностей), так что этот белок или его часть сохраняет способность поддерживать гомеостаз в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды.
Данное изобретение относится также к получению выделенного белка НА. В предпочтительных вариантах белок НА содержит аминокислотную последовательность данного изобретения (например, последовательность, имеющую четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В другом предпочтительном варианте данное изобретение относится к выделенному полноразмерному белку, который является существенно гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей) (кодируемому открытой рамкой считывания, приведенной в соответствующих имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей). Еще в одном варианте этот белок является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60% и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70%, 80% или 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В других вариантах выделенный белок НА содержит аминокислотную последовательность, которая является, по меньшей мере, приблизительно на 50% или более гомологичной одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей) и способен участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды, или имеет одну или несколько активностей, приведенных в таблице 1.
Альтернативно, выделенный белок НА может содержать аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется, например, гибридизуется в жестких условиях, с нуклеотидной последовательностью, или является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70%, 80% или 90% и даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности одной из имеющих четные номера SEQ ID NO:, представленных в Списке последовательностей. Также предпочтительно, чтобы предпочтительные формы белков НА имели также одну или несколько из биологических активностей НА, описанных здесь.
Полипептид НА или его биологически активная часть могут быть функционально связаны с полипептидом не-НА с образованием слитого белка. В предпочтительных вариантах этот слитый белок имеет активность, которая отличается от активности одного белка НА. В других предпочтительных вариантах этот слитый белок участвует в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или выполняет функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. В особенно предпочтительных вариантах интеграция этого слитого белка в клетку-хозяина модулирует продуцирование желаемого соединения из данной клетки.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу скрининга молекул, которые модулируют активность белка НА, либо посредством взаимодействия с самим белком или субстратом или партнером связывания белка НА, либо посредством модуляции транскрипции или трансляции молекулы нуклеиновой кислоты НА данного изобретения.
Другой аспект данного изобретения относится к способу получения химического продукта тонкого органического синтеза. Этот способ предусматривает культивирование клетки, содержащей вектор, управляющий экспрессией молекулы нуклеиновой кислоты НА данного изобретения таким образом, что образуется химический продукт тонкого органического синтеза. В предпочтительном варианте этот способ дополнительно включает в себя стадию производства клетки, содержащей такой вектор, в которой клетку трансфицируют вектором, управляющим экспрессией нуклеиновой кислоты НА. В другом предпочтительном варианте этот способ дополнительно предусматривает стадию извлечения химических продуктов тонкого органического синтеза из культуры. В особенно предпочтительном варианте эта клетка является клеткой из рода Corynebacterium или Brevibacterium или выбрана из штаммов, приведенных в таблице 3.
Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции продуцирования молекулы из микроорганизма. Такие способы включают в себя контактирование клетки с агентом, который модулирует активность белка НА или экспрессию нуклеиновой кислоты НА, так что связанная с клеткой активность является измененной относительно той же самой активности в отсутствие этого агента. В предпочтительном варианте клетку модулируют в отношении одного или нескольких процессов, участвующих в биосинтезе или перестройке клеточных стенок С. glutamicum, в отношении метаболизма неорганических соединений, модификации или разрушения ароматических или алифатических соединений или ферментативных или протеолитических активностей. Агент, который модулирует активность белка НА, может быть агентом, стимулирующим активность белка НА или экспрессию нуклеиновой кислоты НА. Примеры агентов, стимулирующих активность белка НА или экспрессию нуклеиновой кислоты НА, включают в себя небольшие молекулы, активные белки НА и нуклеиновые кислоты, кодирующие белки НА, которые были введены в клетку. Примеры агентов, ингибирующих активность НА или экспрессию, включают в себя небольшие молекулы и антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот НА.
Другой аспект данного изобретения относится к способам модуляции выходов желаемого соединения из клетки, включающим в себя введение гена НА дикого типа или мутантного НА в клетку, либо сохраняемого на отдельной плазмиде, либо интегрируемого в геном клетки-хозяина. При интегрировании в геном такая интеграция может быть случайной или она может происходить посредством гомологичной рекомбинации, так что нативный ген заменяется вводимой копией, обусловливая модуляцию продуцирования желаемого соединения из этой клетки. В предпочтительном варианте указанные выходы повышаются. В другом предпочтительном варианте указанный химический продукт является химическим продуктом тонкого органического синтеза. В конкретном предпочтительном варианте указанный химический продукт тонкого органического синтеза является аминокислотой. В особенно предпочтительном варианте указанная аминокислота является L-лизином.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты и белка НА, которая участвует в биосинтезе или перестройках клеточных стенок С. glutamicum, метаболизме неорганических соединений, модификации или разрушении ароматических или алифатических соединений или имеет ферментативную или протеолитическую активность С. glutamicum. Молекулы данного изобретения могут быть использованы в модуляции производства химических продуктов тонкого органического синтеза из микроорганизмов, таких как С. glutamicum, непосредственно (например, когда сверхэкспрессия или оптимизация активности белка, участвующего в продуцировании химического продукта тонкого органического синтеза (например, фермента), оказывает прямое действие на выход, продуктивность и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из модифицированного С. glutamicum) или могут иметь опосредованное действие, которое тем не менее приводит к повышению выхода, продуцирования и/или эффективности продуцирования желаемого соединения (например, когда модуляция активности или числа копий белка модификации или разрушения ароматических или алифатических соединений С. glutamicum приводит к изменениям в жизнеспособности клеток С. glutamicum, что, в свою очередь, делает возможным увеличенное продуцирование в условиях крупномасштабной культуры. Аспекты данного изобретения дополнительно объясняются ниже.
I. Химические продукты тонкого органического синтеза
Термин «химический продукт тонкого органического синтеза» является признанным в данной области и включает в себя молекулы, продуцируемые организмом, которые имеют применения в различных отраслях промышленности, таких как, но не только, фармацевтическая, сельскохозяйственная и косметическая отрасли промышленности. Такие соединения включают в себя органические кислоты, такие как винная кислота, итаконовая кислота и диаминопимелиновая кислота, как белковые, так и небелковые аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды (описанные, например, в Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, p. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, и содержащихся в них ссылках), липиды, как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), двухатомные спирты (например, пропандиол и бутандиол), углеводы (например, гиалуроновую кислоту и трегалозу), ароматические соединения (например, ароматические амины, ванилин и индиго), витамины и кофакторы (описанные в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, «Vitamins», p. 443-613 (1996) VCH: Weinheim и ссылках в них; и Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) «Nutrition, Lipids, Health, and Disease» Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)), ферменты, поликетиды (Cane et al., (1998) Science 282: 63-68) и все другие химические продукты, описанные в Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 и имеющихся в этой работе ссылках. Метаболизм и применения некоторых из этих химических продуктов тонкого органического синтеза объясняются дополнительно ниже.
А. Метаболизм и применения аминокислот
Аминокислоты составляют основные структурные единицы всех белков и как таковые являются важными для нормального клеточного функционирования во всех организмах. Термин «аминокислота» является признанным в данной области. Белковые аминокислоты, которыми являются 20 видов, служат в качестве структурных единиц для белков, в которых они связаны пептидными связями, тогда как небелковые аминокислоты (сотни которых известны) обычно не входят в состав белков (см. ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Аминокислоты могут быть в D- или L-конфигурации, хотя L-аминокислоты являются, как правило, единственным типом, входящим в состав нативных белков. Биосинтетические пути и пути разрушения каждой из 20 белковых аминокислот были хорошо охарактеризованы как в прокариотических, так и в эукариотических клетках (см., например, Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pages 578-590 (1988)). Незаменимые аминокислоты (гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин), названные так, поскольку они обычно являются необходимыми в питании вследствие сложности их биосинтеза, легко превращаются посредством простых биосинтетических путей в остальные 11 заменимых аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамат, глутамин, глицин, пролин, серии и тирозин). Высшие животные действительно сохраняют способность синтезировать некоторые из этих аминокислот, но незаменимые аминокислоты должны присутствовать в рационе для того, чтобы нормально протекал синтез белков.
Помимо функции в биосинтезе белков, эти аминокислоты сами по себе представляют интерес, и было обнаружено, что многие из них имеют различные применения в пищевой, кормовой, химической, косметической, сельскохозяйственной и фармацевтической промышленностях. Лизин является важной аминокислотой в питании не только человека, но также животных с однокамерным желудком, таких как домашняя птица и свинья. Глутамат наиболее часто используется в качестве вкусовой добавки (мононатрий-глутамат, MSG) и широко применяется в пищевой промышленности, так же как и аспартат, фенилаланин, глицин и цистеин. Глицин, L-метионин и триптофан используются в фармацевтической промышленности. Глутамин, валин, лейцин, изолейцин, гистидин, аргинин, пролин, серин и аланин применяют как в фармацевтической, так и в косметической промышленности. Треонин, триптофан и D/L-метионин являются общепринятыми пищевыми добавками (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, p. 466-502 in Rehm et al., (eds.) Biotechnology vol.6, chapter 14a, VCH: Weinheim). Кроме того, было обнаружено, что эти аминокислоты применимы в качестве предшественников для синтеза синтетических аминокислот и белков, таких как N-ацетилцистеин, S-карбоксиметил-L-цистеин, (S)-5-гидрокситриптофан и другие, описанные в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p.57-97 VCH: Weinheim, 1985.
Биосинтез этих природных аминокислот в организмах, способных их продуцировать, таких как бактерии, хорошо охарактеризован (см. обзор бактериального биосинтеза аминокислот и его регуляции, например, в Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606). Глутамат синтезируется восстановительным аминированием α-кетоглутарата, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. Глутамин, пролин и аргинин, каждый, образуются затем из глутамата. Биосинтез серина является трехстадийным процессом, начинающимся с 3-фосфоглицерата (промежуточного продукта в гликолизе) и приводящим к этой аминокислоте после стадий окисления, переаминирования и гидролиза. Как цистеин, так и глицин образуются из серина; первый посредством конденсации гомоцистеина с серином, а последний переносом β-углеродного атома боковой цепи к тетрагидрофолату, в реакции, катализируемой серин-трансгидроксиметилазой. Фенилаланин и тирозин синтезируются из предшественников гликолитического и пентозофосфатного пути эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата в 9-стадийном биосинтетическом пути, который отличается только на конечных двух стадиях после синтеза префената. Триптофан также образуется из этих двух исходных молекул, но его синтез является 11-стадийным путем. Тирозин может быть также синтезирован из фенилаланина, в реакции, катализируемой фенилаланингидроксилазой. Аланин, валин и лейцин, - все являются биосинтетическими продуктами пирувата, конечного продукта гликолиза. Аспартат образуется из оксалоацетата, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. Аспарагин, метионин, треонин и лизин, каждый, образуются преобразованием аспартата. Изолейцин образуется из треонина. Сложный 9-стадийный путь приводит к образованию гистидина из 5-фосфорибозил-1-пирофосфата, активированного сахара.
Аминокислоты в превышающем потребности белкового синтеза клетки количестве не могут запасаться и вместо этого разрушаются с образованием промежуточных продуктов для основных метаболических путей клетки (в отношении обзора см. Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 21 «Amino Acid Degradation and the Urea Cycle» p.495-516 (1988)). Хотя клетка способна превращать нежелательные аминокислоты в полезные метаболические промежуточные продукты, получение аминокислот является дорогостоящим в отношении энергии, молекул предшественников и ферментов, необходимых для их синтеза. Таким образом, неудивительно, что биосинтез аминокислот регулируется ингибированием по типу обратной связи, в котором присутствие конкретной аминокислоты служит для замедления или полной остановки ее собственного образования (в отношении обзора механизмов по типу обратной связи в путях биосинтеза аминокислот см. Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 24: «Biosynthesis of Amino Acids and Heme» p. 575-600 (1988)). Таким образом, выход любой конкретной аминокислоты лимитирован количеством этой аминокислоты, присутствующим в клетке.
В. Метаболизм и применения витаминов, кофакторов и пищевых добавок (нутрицевтиков).
Витамины, кофакторы и пищевые добавки составляют другую группу молекул, которые высшие животные не синтезируют вследствие утраты способности их синтеза и которые, следовательно, должны приниматься животными с пищей, хотя они легко синтезируются другими организмами, такими как бактерии. Эти молекулы либо сами являются биологически активными веществами, либо они являются предшественниками биологически активных веществ, которые могут служить в качестве носителей электронов или промежуточных продуктов в многочисленных метаболических путях. Помимо их питательной ценности, эти соединения имеют также значительную промышленную ценность в качестве красящих агентов, антиоксидантов и катализаторов или других технологических вспомогательных средств. (В отношении обзора структуры, активности и промышленных применений этих соединений см., например, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, «Vitamins» vol. A27, p.443-613 VCH: Weinheim, 1996). Термин «витамин» является признанным в данной области и включает в себя питательные вещества, которые необходимы организму для нормального функционирования, но которые этот организм не может сам синтезировать. Группа витаминов может включать в себя кофакторы и добавочные питательные соединения. Термин «кофактор» включает в себя небелковые соединения, требуемые для того, чтобы имела место нормальная ферментативная активность. Такие соединения могут быть органическими или неорганическими; молекулы кофакторов данного изобретения являются предпочтительно органическими. Термин "пищевая добавка" включает в себя пищевые добавки, полезные для здоровья растений и животных, в частности, людей. Примерами таких молекул являются витамины, антиоксиданты и также некоторые липиды (например, полиненасыщенные жирные кислоты).
Биосинтез этих молекул в организмах, способных их продуцировать, таких как бактерии, был в значительной степени охарактеризован (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, «Vitamins» vol. A27, p.443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Ong, A.S., Niki, E and Packer, L. (1995) «Nutrition, Lipids, Health, and Disease» Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S).
Тиамин (витамин B1) образуется химическим связыванием пиримидиновой и тиазольной частей молекулы. Рибофлавин (витамин В2) синтезируется из гуанозин-5'-трифосфата (ГТФ) и рибозо-5'-фосфата. Рибофлавин, в свою очередь, используется для синтеза флавинмононуклеотида (FMN) и флавинадениндинуклеотида (FAD). Семейство соединений, совокупно называемых «витамином В6» (например, пиридоксин, пиридоксамин, пиридокса-5'-фосфат и коммерчески используемый пиридоксингидрохлорид), включает в себя соединения, являющиеся производными общей структурной единицы, 5-гидрокси-6-метилпиридина. Пантотенат (пантотеновая кислота, (R)-(+)-N-(2,4-дигидрокси-3,3-диметил-1-оксобутил)-β-аланин) может быть получен химическим синтезом или ферментацией. Конечные стадии в биосинтезе пантотената состоят из АТФ-управляемой конденсации β-аланина и пантоевой кислоты. Известны ферменты, ответственные за стадии биосинтеза для превращения в пантоевую кислоту, в β-аланин и для конденсации в пантотеновую кислоту. Метаболически активной формой пантотената является Кофермент А, биосинтез которого протекает в виде 5 ферментативных стадий. Пантотенат, пиридоксаль-5'-фосфат, цистеин и АТФ являются предшественниками Кофермента А. Эти ферменты катализируют не только образование пантотената, но также образование (R)-пантоевой кислоты, (R)-пантолактона, (R)-пантенола (провитамина B5), пантетеина (и его производных) и кофермента А.
Биосинтез биотина из молекулы-предшественника пимелоил-КоА был исследован подробно, и были идентифицированы несколько участвующих в нем генов. Было обнаружено, что многие из соответствующих белков участвуют также в синтезе Fe-кластера и являются членами белков nifS-класса. Липоевую кислоту получают из октановой кислоты, и она служит в качестве кофермента в энергетическом обмене, где становится частью пируватдегидрогеназного комплекса и α-кетоглутарат-дегидрогеназного комплекса. Фолаты являются группой веществ, которые все являются производными фолиевой кислоты, которая, в свою очередь, образуется из L-глутаминовой кислоты, п-аминобензойной кислоты и 6-метилптерина. Биосинтез фолиевой кислоты и ее производных, начинающийся из промежуточных продуктов метаболизма гуанозин-5'-трифосфата (ГТФ), L-глутаминовой кислоты и п-аминобензойной кислоты, был подробно исследован в некоторых микроорганизмах.
Корриноиды (такие как кобаламины и, в частности, витамин B12) и порфирины принадлежат к группе химических продуктов, характеризующихся системой тетрапирольного кольца. Биосинтез витамина B12 является достаточно сложным, так что он еще не был полностью охарактеризован, но многие участвующие в нем ферменты и субстраты в настоящее время известны. Никотиновая кислота (никотинат) и никотинамид являются производными пиридина, которые называют также «ниацином». Ниацин является предшественником важных коферментов НАД (никотинамидадениндинуклеотида) и НДДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфата) и их восстановленных форм.
Крупномасштабное производство этих соединений в значительной степени основано на бесклеточных химических синтезах, хотя некоторые из этих химических продуктов были также получены крупномасштабным культивированием микроорганизмов, такие как рибофлавин, витамин B6, пантотенат и биотин. Только витамин B12 получают исключительно ферментацией вследствие сложности его синтеза. Методологии in vitro требуют значительных затрат материалов и времени, часто при высокой стоимости.
С. Метаболизм и применения пуринов, пиримидинов, нуклеозидов и нуклеотидов
Гены метаболизма пуринов и пиримидинов и их соответствующие белки являются важными мишенями для терапии опухолевых заболеваниий и вирусных инфекций. Термины «пурин» или «пиримидин» включают в себя азотистые основания, которые являются составляющими нуклеиновых кислот, коферментов и нуклеотидов. Термин «нуклеотид» включает в себя основные структурные единицы молекул нуклеиновых кислот, которые состоят из азотистого основания, пентозного сахара (в случае РНК этот сахар является рибозой; в случае ДНК этот сахар является D-дезоксирибозой) и фосфорной кислоты. Термин «нуклеозид» включает в себя молекулы, которые служат в качестве предшественников для нуклеотидов, но которые не содержат части, являющейся фосфорной кислотой, которую имеют нуклеотиды. Ингибированием биосинтеза этих молекул или их мобилизации для образования молекул нуклеиновых кислот можно ингибировать синтез РНК и ДНК; ингибированием этой активности нацеленным на злокачественные клетки образом можно ингибировать способность опухолевых клеток делиться и размножаться. Кроме того, имеются нуклеотиды, которые не образуют молекул нуклеиновых кислот, а служат в качестве запасов энергии (т.е. АМФ) или в качестве коферментов (т.е. FAD и NAD).
В нескольких публикациях было описано применение этих химических продуктов для медицинских показаний, посредством влияния на метаболизм пуринов и/или пиримидинов (например, Christopherson, R.I. and Lyons, S.D. (1990) «Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents». Med. Res. Reviews 10: 505-548). Исследования ферментов, участвующих в метаболизме пуринов и пиримидинов, было сосредоточено на развитии новых лекарственных средств, которые могут быть использованы, например, в качестве иммунодепрессантов или антипролиферантов (Smith, J.L., (1995) «Enzymes in nucleotide synthesis». Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 752-757; (1995) Biochem. Soc. Transact. 23: 877-902). Однако, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды имеют другие применения: в качестве промежуточных продуктов в биосинтезе некоторых химических продуктов тонкого органического синтеза (например, тиамина, S-аденозилметионина, фолатов или рибофлавина), в качестве энергоносителей для клетки (например, АТФ или ГТФ) и для самих химических продуктов, обычно используемых в качестве усилителей аромата (например, ИМФ или ГМФ) или для некоторых медицинских применений (см., например, Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, p. 561-612). Кроме того, ферменты, участвующие в метаболизме пуринов, пиримидинов, нуклеозидов или нуклеотидов, все больше используются в качестве мишеней, против которых разрабатываются химические продукты для защиты урожая сельскохозяйственных культур, в том числе фунгициды, гербициды и инсектициды.
Метаболизм этих соединений в бактериях был охарактеризован (в отношении обзора см., например, Zalkin, Н. and Dixon, J.E. (1992) «de novo purine nucleotide biosynthesis», in: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press: p. 259-287 и Michal, G. (1999) «Nucleotides and Nucleosides», Chapter 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New York). Метаболизм пуринов был объектом интенсивного исследования, и он является существенным для нормального функционирования клетки. Нарушенный метаболизм пуринов у высших животных может вызывать серьезное заболевание, такое как подагра. Пуриновые нуклеотиды синтезируются из рибозо-5-фосфата, в ряде стадий через промежуточное соединение инозин-5'-фосфат (ИМФ), приводя к образованию гуанозин-5'-монофосфата (ГМФ) или аденозин-5'-монофосфата (АМФ), из которых легко образуются трифосфатные формы, используемые в качестве нуклеотидов. Эти соединения используются также в качестве энергозапасов, и таким образом их разрушение относится к энергии для многих различных биохимических процессов в клетке. Биосинтез пиримидинов протекает посредством образования уридин-5'-монофосфата (УМФ) из рибозо-5-фосфата. УМФ, в свою очередь, превращается в цитидин-5'-трифосфат (ЦТФ). Дезоксиформы всех этих нуклеотидов образуются в одностадийной реакции восстановления из дифосфатрибозной формы нуклеотида в дифосфатную дезоксирибозную форму этого нуклеотида. При фосфорилировании эти молекулы способны участвовать в синтезе ДНК.
D. Метаболизм и применения трегалозы
Трегалоза состоит из двух молекул глюкозы, связанных в α,α-1,1-связи. Ее обычно используют в пищевой промышленности в качестве подсластителя, добавки для высушенных или замороженных пищевых продуктов и в напитках. Однако, она применяется также в фармацевтической, косметической и биотехнологической промышленностях (см., например, Nishimoto et al., (1998) U.S. Patent No. 5759610; Singer, M.A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460-467; Paiva, C.L.A. and Panek, A.D. (1996) Biotech. Ann. Rev. 2: 293-314; и Shiosaka, M. (1997) J. Japan. 172: 97-102). Трегалоза синтезируется ферментами многих микроорганизмов и природно высвобождается в окружающую среду, из которой она может быть собрана с использованием способов, известных в данной области.
II. Поддержание гомеостаза в С. glutamicum и адаптация к условиям окружающей среды
Метаболические и другие биохимические процессы, при помощи которых клетка функционирует, являются чувствительными к условиям окружающей среды, таким как температура, давление, концентрация растворенных веществ и доступность кислорода. При нарушении или изменении одного или нескольких таких условий окружающей среды таким образом, что это условие является несовместимым с нормальным функционированием этих клеточных процессов, клетка должна действовать так, чтобы сохранить внутриклеточную среду, которая позволит этим процессам иметь место, несмотря на неблагоприятную окружающую среду. Грамположительные бактериальные клетки, такие как клетки С. glutamicum, имеют ряд механизмов, посредством которых может поддерживаться внутренний гомеостаз, несмотря на неблагоприятные внеклеточные условия. Эти механизмы включают в себя клеточную стенку, белки, которые способны разрушать возможные токсические ароматические и алифатические соединения, механизмы протеолиза, посредством которых белки с неправильной укладкой или с неправильной регуляцией могут быть быстро разрушены, и катализаторы, которые позволяют протекать внутриклеточным реакциям, которые обычно не происходят в условиях, оптимальных для роста клеток.
Помимо просто выживания во враждебной окружающей среде, бактериальные клетки (например, клетки С. glutamicum) часто способны также адаптироваться таким образом, что они способны использовать преимущество таких условий. Например, клетки в среде, не имеющей желательных источников углерода, могут быть способными адаптироваться к росту на менее пригодном источнике углерода. Клетки могут быть также способными утилизировать менее желательные неорганические соединения, когда обычно используемые соединения являются недоступными. Клетки С. glutamicum имеют ряд генов, которые позволяют им адаптироваться для использования неорганических и органических молекул, которые они обычно не встречали бы при оптимальных условиях выращивания, в качестве питательных веществ и предшественников для метаболизма. Аспекты клеточных процессов, участвующих в гомеостазе и адаптации, объясняются более подробно ниже.
А. Модификация и разрушение ароматических и алифатических соединений
Бактериальные клетки рутинно подвергаются действию разнообразных ароматических и алифатических соединений в природе. Ароматические соединения являются органическими молекулами, имеющими циклическую кольцевую структуру, тогда как алифатические соединения являются органическими молекулами, имеющими структуры с открытой цепью (ациклические структуры), а не кольцевые структуры. Такие соединения могут возникать как побочные продукты промышленных процессов (например, бензол или толуол), но могут также продуцироваться некоторыми микроорганизмами (например, спирты). Многие из этих соединений являются токсичными для клеток, в частности, ароматические соединения, которые являются высоко реакционноспособными вследствие высокоэнергетической структуры кольца. Таким образом, некоторые бактерии развили механизмы, посредством которых они способны модифицировать или разрушать эти соединения, так что они уже не являются вредными для клетки. Клетки могут иметь ферменты, которые способны, например, гидроксилировать, изомеризовать или метилировать ароматические или алифатические соединения таким образом, что они становятся менее токсичными, или таким образом, что модифицированная форма способна перерабатываться стандартными путями обработки и разрушения клеточных «отходов». Клетки могут также содержать ферменты, которые способны специфически разрушать одно или несколько таких потенциально вредных веществ, защищая посредством этого клетку. Принципы и примеры этих типов процессов модификации и разрушения в бактериях описаны в нескольких публикациях, например, Sahm, H. (1999) «Procaryotes in Industrial Production» in Lengeler J.W. et al., eds. Biology of the Procarysotes, Thieme Verlag: Stuttgart; и Schlegel. H.G. (1992) Allgemeine Mikrobiologie, Thieme: Stuttgart).
Помимо простой инактивации вредных ароматических или алифатических соединений, многие бактерии эволюционировали таким образом, что они способны использовать эти соединения в качестве источников углерода для непрерывного метаболизма, когда предпочтительные источники углерода клетки являются недоступными. Например, известно, что штаммы Pseudomonas способны использовать толуол, бензол и 1,10-дихлордекан в качестве источников углерода (Chang, B.V. et ai. (1997 Chemosphere 35(12): 2807-2815; Wischnak, С. et al. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64(9): 3507-3511; Churchill, S.A. et al. (1999) Apll. Environ. Microbiol. 65(2): 549-552). Имеются подобные примеры из многих других бактериальных видов, которые известны в данной области.
Способность некоторых бактерий модифицировать или разрушать ароматические и алифатические соединения начали эксплуатировать. Нефть является сложной смесью химических продуктов, которая включает в себя алифатические молекулы и ароматические соединения. Посредством использования бактерий, обладающих способностью разрушать или модифицировать эти токсические соединения в разливах нефти, например, можно элиминировать большую часть повреждения окружающей среды с высокой эффективностью и низкой стоимостью (см., например, Smith, M.R. (1990) «The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria» Biodegradation 1(2-3): 191-206; и Suyama, Т. et al., (1998) «Bacterial isolates degrading aliphatic polycarbonates», FEMS Microbiol. Lett. 161(2): 255-261).
В. Метаболизм неорганических соединений
Клетки (например, бактериальные клетки) содержат большие количества различных молекул, таких как вода, не органические ионы и органические субстраты (например, белки, сахара и другие макромолекулы). Основная часть массы типичной клетки состоит только из атомов 4 элементов: углерода, кислорода, водорода и азота. Хотя они представляют меньший процент содержимого клетки, неорганические вещества являются равным образом важными для правильного функционирования клетки. Такие молекулы включают в себя фосфор, серу, кальций, магний, железо, цинк, марганец, медь, молибден, вольфрам и кобальт. Многие из этих соединений являются критическими для построения важных молекул, таких как нуклеотиды (фосфор) и аминокислоты (азот и сера). Другие из этих неорганических ионов служат в качестве кофакторов для ферментативных реакций или вносят вклад в осмотическое давление. Все такие молекулы должны поглощаться бактерией из окружающей среды.
В случае каждого из этих неорганических соединений для бактерии удобно поглощать форму, которая может быть наиболее легко использована с использованием стандартного метаболического аппарата клетки. Однако, бактерия может столкнуться с условиями окружающей среды, в которых эти предпочтительные формы не являются легко доступными. Для выживания в этих условиях, важно, чтобы бактерии имели дополнительные биохимические механизмы, которые способны превращать менее метаболически активные, но легко доступные формы этих неорганических соединений в формы, которые могут быть использованы в клеточном метаболизме. Бактерии часто обладают рядом генов, кодирующих ферменты для этой цели, которые не экспрессируются до тех пор, пока желательные неорганические формы не становятся недоступными. Таким образом, эти гены для метаболизма различных неорганических соединений служат в качестве другого инструмента, который бактерии могут использовать для адаптации к субоптимальным условиям окружающей среды.
После углерода наиболее важным элементом в клетке является азот. Типичная бактериальная клетка содержит 12-15% азота. Он является компонентом аминокислот и нуклеотидов, а также многих других важных молекул в клетке. Далее, азот может служить в качестве заменителя для кислорода в качестве конечного акцептора электрона в энергетическом обмене. Хорошие источники азота включают в себя многие органические и неорганические соединения, такие как газообразный аммиак или соли аммония (например, NH4Cl, (NH4)2SO4 или NH4OH), нитраты, мочевина, аминокислоты или комплексные источники азота, такие как жидкий кукурузный экстракт, соевая мука, соевый белок, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и другие. Аммиачный азот фиксируется действием конкретных ферментов: глутаматдегидрогеназы, глутаминсинтазы и глутамин-2-оксоглутаратаминотрансферазы. Перенос амино-азота от одной органической молекулы к другой выполняется аминотрансферазами, классом ферментов, которые переносят одну аминогруппу от альфа-аминокислоты к альфа-кетокислоте. Нитрат может восстанавливаться посредством нитратредуктазы, нитритредуктазы и дополнительных окислительно-восстановительных ферментов, пока он не превращается в молекулярный азот или аммиак, которые могут быть легко использованы клеткой в стандартных метаболических путях.
Фосфор обычно встречается в клетке как в органической, так и в неорганической формах и может также поглощаться клеткой в любой из этих форм, хотя большинство микроорганизмов предпочтительно поглощают неорганический фосфат. Превращение органического фосфата в форму, которую клетка может использовать, требует действия фосфатаз (например, фитаз, которые гидролиэуют фитат-обраэующий фосфат и производные инозита). Фосфат представляет собой ключевой элемент в синтезе нуклеиновых кислот, а также играет важную роль в клеточном энергетическом обмене (например, в синтезе АТФ, АДФ и АМФ).
Сера является необходимой для синтеза аминокислот (например,
метионина и цистеина), витаминов (например, тиамина, биотина и липоевой кислоты) и железо-серусодержащих белков. Бактерии получают серу первично из неорганического сульфата, хотя обычно используют также тиосульфат, сульфит и сульфид. В условиях, в которых эти соединения не могут быть легко доступными, многие бактерии экопрессируют гены, которые позволяют им использовать сульфонатные соединения, такие как 2-аминосульфонат (таурин) (Kertesz, M.A. (1993) «Proteins induced by suifate limitation in Escherichia coli, Pseudomonas putida or Staphylococcus aureus». J.Bacteriol. 175: 1187-1190).
Другие неорганические атомы, например, ионы металлов или кальция, также являются критическими для жизнеспособности клеток. Железо, например, играет ключевую роль в окислительно-восстановительных реакциях и является кофактором железо-серосодержащих белков, белков гема и цитохромов. Поглощение железа в бактериальные клетки может выполняться действием сидерофоров, хелатирующих агентов, которые связывают внеклеточные ионы железа и перемещают их во внутреннее пространство клетки. В отношении ссылки по метаболизму железа и других неорганических соединений см.: Lengeler et al. (1999) Biology of Prokariotes, Thieme Verlag: Stuttgart; Neidhardt, F.C. et al., eds. Escherichia coli and Salmonella. ASM Press: Washington, D.C.; Sonenshein, A.L. et al. / eds. (1993) Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, ASM Press: Washington, D.C.; Voet, D. and Voet, J.G. (1992) Biochemie, VCH: Weinheim; Brock, T.D. and Madigan, M.T. (1991) Biology of Microorganisms, 6th ed. Prentice Hall: Englewood Cliffs, p. 267-269; Rhodes, P.M. and Stanbury, P.F. Applied Microbial Physiology - A Practical Approach, Oxford Univ. Press: Oxford.
С. Ферменты и протеолиз
Внутриклеточные условия, в отношении которых такие бактерии, как С. glutamicum, оптимизированы, часто не являются условиями, при которых многие биохимические реакции обычно имели бы место. Для того, чтобы заставить такие реакции протекать при физиологических условиях, клетки используют ферменты. Ферменты являются белковыми биологическими катализаторами, пространственно ориентирующими реагирующие молекулы или относящимся к специализированной среде, так что энергетический барьер для биохимической реакции понижается. Различные ферменты катализируют различные реакции, и каждый фермент может быть объектом транскрипционной, трансляционной или посттрансляционной регуляции, так что эта реакция будет иметь место только при подходящих условиях и в точно определенные моменты времени. Ферменты могут способствовать разрушению (например, протеазы), синтезу (например, синтазы) или модификации (например, трансферазы или изомеразы) соединений, все из которых делают возможным продуцирование необходимых соединений в клетке. Это, в свою очередь, способствует поддержанию клеточного гомеостаза.
Однако, тот факт, что ферменты оптимизированы в отношении активности в физиологических условиях, при которых данная бактерия является наиболее жизнеспособной, означает, что, при нарушении условий окружающей среды существует существенная вероятность того, что активность фермента будет также нарушена. Например, изменения в температуре могут приводить к аберрантно уложенным белкам, и то же самое верно для изменений рН - укладка белка сильно зависит от электростатических и гидрофобных взаимодействий аминокислот в полипептидной цепи, так что любое изменение зарядов на индивидуальных аминокислотах (что может быть вызвано изменением клеточного рН) может иметь сильное действие на способность белка правильно укладываться. Изменения в температуре эффективно изменяют количество кинетической энергии, которой обладает молекула полипептида, что влияет на способность полипептида укладываться в правильно уложенную, энергетически стабильную конфигурацию. Неправильно уложенные белки могут быть вредными для клетки по двум причинам. Во-первых, аберрантно уложенный белок может иметь также аберрантную (отклоняющуюся от нормы) активность или может вообще не иметь активности. Во-вторых, неправильно уложенный белок может не иметь конформационных областей, необходимых для правильной регуляции другими клеточными системами и, следовательно, может продолжать оставаться активным, но неконтролируемым образом.
Клетка имеет механизм, при помощи которого неправильно уложенные ферменты и регуляторные белки могут быстро разрушаться до того, как произойдет какое-либо повреждение в отношении клетки: протеолиз. Белки, такие как белки семейства la/lon и белки семейства Clp, специфически узнают и разрушают неправильно уложенные белки (см., например, Sherman, M.Y., Goldberg, A.L. (1999) EXS 77: 57-58 и ссылки в этой работе и Porankiewicz J. (1999) Molec. Microbiol. 32(3): 449-58 и ссылки в этой работе; Neidhardt, F.C., et al., (1996) E. coli and Salmonella, ASM Press: Washington, D.C. и ссылки в этой работе и Pritchard, G.G. and Coolbear, Т. (1993) FEMS Microbiol. Rev. 12(1-3): 179-206 и ссылки в ней). Эти ферменты связываются с неправильно уложенными или неуложенными белками и разрушают их АТФ-зависимым образом. Таким образом, протеолиз служит в качестве важного механизма, используемого клеткой для предупреждения повреждения нормальных клеточных функций при изменениях окружающей среды, и он дополнительно позволяет клеткам выживать в условиях и в окружающей среде, которые в ином случае были бы токсичными вследствие неправильно регулируемого и/или аберрантного фермента или неправильной регуляторной активности.
Протеолиз также имеет важные функции в клетке при оптимальных условиях окружающей среды. В нормальных метаболических процессах протеазы помогают в гидролизе пептидных связей, в катаболизме комплексных молекул для обеспечения необходимых продуктов разрушения и в модификации белков. Секретируемые протеазы играют важную роль в катаболизме наружных питательных веществ даже перед вхождением этих соединений в клетку. Далее, сама протеолитическая активность может служить в качестве регуляторных функций; известно, что споруляция в В. subtilis и прогрессирование клеточного цикла в Caulobacter spp. регулируются ключевыми протеолитическими событиями в каждом из этих видов (Gottesman, S. (1999) Curr. Opin. Microbiol. 2(2): 142-147). Таким образом, протеолитические процессы являются основным принципом для клеточного выживания как при субоптимальных, так и при оптимальных условиях окружающей среды и способствуют общему поддержанию гомеостаза в клетках.
D. Образование и перестройки клеточных стенок
Хотя биохимический аппарат клетки может быть способен легко адаптироваться к различным и возможно неблагоприятным условиям окружающей среды, клетки все еще требуют общего механизма, при помощи которых они могут быть защищены от окружающей среды. Для многих бактерий такую защиту предоставляет клеточная стенка, и она играет также роль в адгезии, росте и делении клеток и транспорте желаемых растворенных веществ и отходов.
Для функционирования клетки требуют внутриклеточных концентраций метаболитов и других молекул, которые являются существенно более высокими, чем концентрации окружающей среды. Так как оставление клетки этими метаболитами в значительной степени предотвращается вследствие присутствия гидрофобной мембраны, тенденцией данной системы является то, что молекулы воды входят в клетку из наружной среды таким образом, что внутренние концентрации растворенных веществ соответствуют наружным концентрациям. Молекулы воды способны легко пересекать клеточную мембрану, и эта мембрана неспособна противостоять возникающему набуханию и давлению, которые могут привести к осмотическому лизису клетки. Жесткость клеточной стенки сильно улучшает способность клетки выносить эти давления и предоставляет дополнительный барьер для нежелательной диффузии этих метаболитов и желательных растворенных веществ из клетки. Подобным образом, клеточная стенка служит также для предотвращения вхождения нежелательного материала в клетку.
Клеточная стенка участвует также в ряде других клеточных процессов, таких как адгезия и рост и деление клеток. Вследствие того факта, что клеточная стенка полностью окружает клетку, любое взаимодействие клетки с ее окружением должно быть опосредовано клеточной стенкой. Таким образом, клеточная стенка должна участвовать в любом прикреплении клетки к другим клеткам и к желательным поверхностям. Далее, клетка не может расти или делиться без сопутствующих изменений в клеточной стенке. Поскольку защита, которую предоставляет стенка, требует ее присутствия во время роста, морфогенеза и размножения, одной их ключевых стадий в делении клеток является синтез клеточной стенки в клетке, так что новая клетка отделяется от старой. Таким образом, биосинтез клеточной стенки регулируется в тандеме с клеточным ростом и клеточным делением (см., например, Sonenshein, A.L. et al., eds. (1993) Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bacteria, ASM: Washington, D.C.).
Структура клеточной стенки варьируется между грамположительными и грамотрицательными бактериями. Однако, в обоих типах фундаментальная структурная единица стенки остается одинаковой: перекрывающаяся решетчатая структура двух полисахаридов, N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты (NAM), которые сшиты аминокислотами (наиболее обычно L-аланином, D-глутаматом, диаминопимелиновой кислотой и D-аланином), называемая «пептидогликаном». Процессы, участвующие в синтезе клеточной стенки, являются известными (см., например, Michal, G., ed. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New York).
В грамотрицательных бактериях внутренняя клеточная мембрана покрыта однослойным пептидогликаном (с толщиной приблизительно на 10 нм), называемым муреиновым пептидогликановым каркасом. Эта пептидогликановая структура является очень жесткой, и ее структура определяет форму этого организма. Наружная поверхность муреинового пептидогликанового каркаса покрыта наружной мембраной, содержащей порины и другие мембранные белки, фосфолипиды и липополисахариды. Для поддержания прочной связи с наружной мембраной стенка грамотрицательной клетки также имеет вставленные в нее липидные молекулы, которые служат для прикрепления ее к окружающей мембране.
В грамположительных бактериях, таких как Corynebacterium glutamicum, цитоплазматическая мембрана покрыта многослойным пептидогликаном, который имеет толщину от 20 до 80 нм (см., например, Lengeler et al. (1999) Biology of Prokariotes, Thieme Verlag: Stuttgart, p. 913-918, p. 875-899 and p. 88-109 и ссылки в ней). Стенка грамположительной клетки также содержит тейхоевую кислоту, полимер глицерина или рибита, связанных через фосфатные группы. Тейхоевая кислота способна также связываться с аминокислотами и образует ковалентные связи с мурамовой кислотой. В клеточной стенке могут также присутствовать липотейхоевые кислоты и тейхуроновые кислоты. В случае их присутствия, структуры клеточной поверхности, такие как жгутики или капсулы, будут также прикреплены в этом слое.
III. Элементы и способы изобретения
Данное изобретение основывается, по меньшей мере, частично, на обнаружении новых молекул, называемых здесь молекулами нуклеиновых кислот и белковыми молекулами НА, которые участвуют в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или которые выполняют функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. В одном варианте молекулы НА участвуют в биосинтезе или перестройках клеточной стенки С. glutamicum, в метаболизме неорганических соединений, в модификации или разрушении ароматических или алифатических соединений или имеют ферментативную или протеолитическую активность. В предпочтительном варианте активность молекул НА данного изобретения в отношении биосинтеза или перестроек клеточной стенки С. glutamicum, метаболизма неорганических соединений, модификации или разрушения ароматических или алифатических соединений или ферментативной или протеолитической активности оказывает воздействие на продуцирование желательного химического продукта тонкого органического синтеза этим организмом. В особенно предпочтительном варианте молекулы НА данного изобретения модулируются в активности таким образом, что клеточные процессы С.glutamicum, в которых участвуют молекулы НА (например, биосинтез или перестройки клеточной стенки С. glutamicum, метаболизм неорганических соединений, модификация или разрушение ароматических или алифатических соединений или ферментативная или протеолитическая активность), являются также измененными в их активности, что приводит прямо или опосредованно к модуляции выхода, продуцирования и/или эффективности продуцирования желаемого химического продукта тонкого органического синтеза С. glutamicum.
Выражение «белок НА» или «полипептид НА» включает в себя белки, которые участвуют в ряде клеточных процессов, связанных с гомеостазом С. glutamicum или способностью клеток С. glutamicum адаптироваться к неблагоприятным условиям окружающей среды. Например, белок НА может участвовать в биосинтезе или перестройках клеточной стенки С. glutamicum, в метаболизме неорганических соединений в С. glutamicum, в модификации или разрушении ароматических или алифатических соединений в С. glutamicum или имеет ферментативную или протеолитическую активность С. glutamicum. Примеры белков НА включают в себя белки, кодируемые генами НА, представленными в таблице 1 и имеющими нечетные номера SEQ ID NO:. Термины «ген НА» или «последовательность нуклеиновой кислоты НА» включают в себя последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белок НА, которые состоят из кодирующей области, а также из соответствующих 5'- и 3'-областей последовательности. Примеры генов НА включают в себя гены, приведенные в таблице 1. Термины «продуцирование» или «продуктивность» являются признанными в данной области и включают в себя концентрацию продукта ферментации (например, желаемого химического продукта тонкого органического синтеза), полученного за единицу времени и в конкретном объеме ферментации (например, кг продукта в час на литр). Термин «эффективность продуцирования» включает в себя время, необходимое для конкретного уровня продуцирования, который должен быть достигнут (например, время, которое необходимо для клетки для достижения конкретной скорости выхода химического продукта тонкого органического синтеза). Термин «выход» или «выход продукт/углерод» является признанным в данной области и включает в себя эффективность превращения источника углерода в продукт (т.е. в химический продукт тонкого органического синтеза). Это обычно выражается как, например, кг продукта на кг источника углерода. Посредством увеличения выхода или продуцирования соединения количество извлеченных молекул этого соединения в конкретном количестве культуры на протяжении конкретного периода времени увеличивается. Термины «биосинтез» или «биосинтетический путь» являются признанными в данной области и включают в себя синтез соединения, предпочтительно органического соединения, клеткой из промежуточных соединений, который может включать в себя многостадийный и четко регулируемый процесс. Термины «разрушение» или «путь разрушения» являются признанными в данной области и включают в себя распад соединения, предпочтительно органического соединения, клеткой до продуктов разрушения (говоря в общем, меньших по размеру или менее сложных молекул), который может включать в себя многостадийный и четко регулируемый процесс. Термин «метаболизм» является признанным в данной области и включает в себя всю сумму биохимических реакций, которые имеют место в организме. Тогда метаболизм конкретного соединения (например, метаболизм аминокислоты, например, глицина) включает в себя общие биосинтетические пути, пути модификации и разрушения в клетке, связанные с этим соединением. Термин «гомеостаз» является признанным в данной области и включает в себя все механизмы, используемые клеткой для поддержания константной внутриклеточной среды вопреки преобладающим условиям внеклеточной окружающей среды. Неограничительным примером таких процессов является использование клеточной стенки для предотвращения осмотического лизиса вследствие высоких внутриклеточных концентраций растворенных веществ. Термин «адаптация» или «адаптация к условиям окружающей среды» является признанным в данной области и включает в себя механизмы, используемые клеткой для придания клетке способности выживать при непредпочтительных условиях окружающей среды (говоря в общем, в тех условиях, в которых отсутствуют одно или несколько благоприятных питательных веществ или в которых условие окружающей среды, например, температура, рН, осмолярность, процент кислорода и т.п., находится вне оптимального диапазона выживания данной клетки). Многие клетки, в том числе клетки С. glutamicum, обладают генами, кодирующими белки, которые экспрессируются при таких условиях окружающей среды и которые делают возможным непрерывный рост в таких субоптимальных условиях.
В другом варианте молекулы НА данного изобретения способны модулировать продуцирование желаемой молекулы, такой как химический продукт тонкого органического синтеза в микроорганизме, таком как С. glutamicum. Существует ряд механизмов, при помощи которых изменение белка НА данного изобретения может непосредственно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из штамма С. glutamicum, включающего в себя такой измененный белок. Например, посредством конструирования ферментов, которые модифицируют или разрушают ароматические или алифатические соединения таким образом, что эти ферменты увеличиваются или уменьшаются в активности или числе, можно модулировать продуцирование одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза, которые являются продуктами модификации или разрушения этих соединений. Подобным образом, ферменты, участвующие в метаболизме неорганических соединений, относятся к ключевым молекулам (например, молекулы фосфора, серы и азота) для биосинтеза таких химических продуктов тонкого органического синтеза, как аминокислоты, витамины и нуклеиновые кислоты. Посредством изменения активности или числа этих ферментов в С. glutamicum можно увеличивать превращение этих неорганических соединений (или использовать другие неорганические соединения) для создания возможности повышенных скоростей включения неорганических атомов в эти химические продукты тонкого органического синтеза. Генетическое конструирование ферментов С. glutamicum, участвующих в основных клеточных процессах, может также прямо улучшать продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза, так как многие из этих ферментов непосредственно модифицируют химические продукты тонкого органического синтеза (например, аминокислоты), или ферментов, которые участвуют в синтезе или секреции химических продуктов тонкого органического синтеза. Модулирование активности или ряда клеточных протеаз может также оказывать прямое действие на продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза, так как многие протеазы могут разрушать химические продукты тонкого органического синтеза или ферменты, участвующие в продуцировании или распаде химических продуктов тонкого органического синтеза.
Далее, вышеуказанные ферменты, участвующие в модификации или разрушении ароматических/алифатических соединений, общем биокатализе, метаболизме или протеолизе неорганических соединений, сами могут быть химическими продуктами тонкого органического синтеза, активность которых является желательной в различных промышленных применениях in vitro. Посредством изменения числа копий гена для одного или нескольких из этих ферментов в С. glutamicum можно повышать число этих белков, продуцируемых клеткой, увеличивая тем самым потенциальный выход или эффективность продуцирования этих белков из крупномасштабных культур С. glutamicum или родственных бактериальных культур.
Изменение белка НА данного изобретения может также опосредованно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования химического продукта тонкого органического синтеза из С. glutamicum, включающего в себя такой измененный белок. Например, посредством модулирования активности и/или числа белков, участвующих в построении или перестройке клеточной стенки, может быть модифицирована структура самой клеточной стенки таким образом, что эта клетка будет способна лучше противостоять механическому стрессу или другим стрессам, присутствующим во время крупномасштабного ферментационного культивирования. Кроме того, крупномасштабное культивирование С. glutamicum требует существенного продуцирования клеточных стенок. Модулирование активности или числа биосинтетических или разрушающих ферментов клеточной стенки может позволить более высокие скорости биосинтеза клеточных стенок, что, в свою очередь, может сделать возможными более высокие скорости роста этого микроорганизма в культуре и посредством этого повысить число клеток, продуцирующих желательный химический продукт тонкого органического синтеза.
Модификацией ферментов НА данного изобретения можно непосредственно влиять на выход, продуцирование или эффективность продуцирования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum. Например, многие основные ферменты в С. glutamicum могут оказывать значительное влияние на глобальные клеточные процессы (например, регуляторные процессы), которые, в свою очередь, оказывают сильное влияние на метаболизм химических продуктов тонкого органического синтеза. Подобным образом, протеазы, ферменты, которые модифицируют или разрушают токсические ароматические или алифатические соединения, и ферменты, которые стимулируют метаболизм неорганических соединений, - все могут служить для повышения жизнеспособности С. glutamicum. Участие протеаз в селективном удалении белков с неправильной укладкой или неправильной регуляцией, таких как белки, которые могут появляться при относительно стрессовых условиях окружающей среды, встречающихся во время крупномасштабного культивирования в ферментере. Посредством изменения этих белков можно дополнительно повышать эту активность и улучшать жизнеспособность С. glutamicum в культуре. Белки модификации или разрушения ароматических/алифатических соединений не только служат для детоксикации этих соединений-отходов (которые могут встречаться в виде примесей в культуральной среде или в виде соединений-отходов из самих клеток), но также позволяют клеткам использовать альтернативные источники углерода, если оптимальный источник углерода является лимитирующим в данной культуре. Посредством увеличения их числа и/или активности может быть повышено выживание клеток С. glutamicum в культуре. Белки метаболизма неорганических соединений данного изобретения снабжают клетку неорганическими молекулами, необходимыми для синтеза всех белков и нуклеотидов (среди прочих), и, следовательно, являются критическими для общей жизнеспособности клетки. Увеличение в числе жизнеспособных клеток, продуцирующих один или несколько химических продуктов тонкого органического синтеза в крупномасштабной культуре, должно приводить к сопутствующему повышению выхода, продуцирования и/или эффективности продуцирования данного химического продукта тонкого органического синтеза в культуре.
Выделенные последовательности нуклеиновых кислот данного изобретения содержатся в геноме штамма Corynebacterium glutamicum, доступного из American Type Culture Collection, имеющего обозначение АТСС 13032. Нуклеотидная последовательность выделенных ДНК НА С. glutamicum и предсказанные аминокислотные последовательности белков НА Corynebacterium glutamicum показаны в Списке последовательностей в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO: и имеющих четные номера SEQ ID NO:, соответственно. Были проведены вычислительные анализы, которые классифицировали и/или идентифицировали эти нуклеотидные последовательности как последовательности, кодирующие белки, которые кодируют белки, участвующие в биосинтезе или перестройках клеточных стенок в С. glutamicum, метаболизме неорганических соединений, модификации или разрушении ароматических или алифатических соединений или имеющие ферментативную или протеолитическую активность С. glutamicum.
Данное изобретение относится также к белкам, имеющим аминокислотную последовательность, которая является существенно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей). В применении здесь, белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая является существенно гомологичной выбранной аминокислотной последовательности, является, по меньшей мере, приблизительно на 50% гомологичным выбранной аминокислотной последовательности, например, полной выбранной аминокислотной последовательности. Белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая является существенно гомологичной выбранной аминокислотной последовательности, может также быть, по меньшей мере, приблизительно на 50-60%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60-70% и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70-80%, 80-90% или 90-95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным выбранной аминокислотной последовательности.
Белок НА или его биологически активная часть или биологически активный фрагмент данного изобретения может участвовать в поддержании гомеостаза в С.glutamicum или может выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды, или может иметь одну или несколько активностей, приведенных в таблице 1.
Различные аспекты данного изобретения описаны с дополнительными подробностями в следующих подразделах:
А. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот
Один аспект данного изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды НА или их биологически активные части, а также фрагментам нуклеиновых кислот, достаточным для применения в качестве гибридизационных зондов или праймеров для идендификации или амплификации кодирующей НА нуклеиновой кислоты (например, ДНК НА). В применении здесь, термин «молекула нуклеиновой кислоты» включает в себя молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием нуклеотидных аналогов. Этот термин включает в себя также не транслируемую последовательность, локализованную при обоих 3'- и 5'-концах кодирующей области этого гена: по меньшей мере, приблизительно на 100 нуклеотидов последовательности левее от 5'-конца кодирующей области и, по меньшей мере, приблизительно на 20 нуклеотидов правее от 3'-конца кодирующей области этого гена. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. «Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновых кислот, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, которые присутствуют в природном источнике этой нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, «выделенная» нуклеиновая кислота не содержит последовательностей, которые природно фланкируют эту нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, локализованных при 5'- и 3'-концах этой нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена эта нуклеиновая кислота. Например, в различных вариантах выделенная молекула нуклеиновой кислоты НА может содержать менее, чем приблизительно на 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые природно фланкируют эту молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена эта нуклеиновая кислота (например, клетки С. glutamicum). Кроме того, «выделенная» молекула нуклеиновой кислоты, например, молекула ДНК, может по существу не содержать другого клеточного материала или культуральной среды при получении рекомбинантными способами или при химическом синтезе химических предшественников или других химических продуктов.
Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, например, молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность, имеющую нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей, или ее часть, может быть выделена с использованием стандартных способов молекулярной биологии и информации последовательности, обеспеченной здесь. Например, ДНК НА С. glutamicum может быть выделена из библиотеки С. glutamicum с использованием всей или части одной из имеющих нечетные номера SEQ ID NO: последовательностей Списка последовательностей в качестве гибридизационного зонда и стандартных способов гибридизации (например, описанных в Sambrook J., Fritsh, E.F., and Maniatis, Т. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты, включающая в себя полную последовательность или часть одной из последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения (например, имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей), может быть выделена полимеразной цепной реакцией с использованием олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе этой последовательности (например, молекула нуклеиновой кислоты, включающая в себя всю последовательность или часть одной из последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения (например, имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей), может быть выделена полимеразной цепной реакцией с использованием олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе той же самой последовательности). Например, мРНК может быть выделена из нормальных эндотелиальных клеток (например, процедурой экстракции гуанидинийтиоцианатом Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299), а ДНК может быть получена с использованием обратной транскриптазы (например, обратной транскриптазы Moloney MLV, доступной из Gibco/BRL, Bethesda, MD; или обратной транскриптазы AMV, доступной из Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Синтетические олигонуклеотидные праймеры для амплификации при помощи полимеразной цепной реакции могут быть сконструированы на основе одной из нуклеотидных последовательностей, показанных в Списке последовательностей. Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть амплифицирована с использованием кДНК или, альтернативно, геномной ДНК, в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована анализом последовательности ДНК. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидной последовательности НА, могут быть получены стандартными синтетическими способами, например, с использованием автоматического ДНК-синтезатора.
В предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит одну из нуклеотидных последовательностей, показанных в Списке последовательностей. Последовательности нуклеиновых кислот данного изобретения, приведенные в Списке последовательностей, соответствуют ДНК НА Corynebacterium glutamicum данного изобретения. Эта ДНК содержит последовательности, кодирующие белки НА (т.е. «кодирующая область», показанный в каждой имеющей нечетный номер SEQ ID NO: последовательности в Списке последовательностей), а также 5'-нетранслируемые последовательности и 3'-нетранслируемые последовательности, также показанные в каждой имеющей нечетный номер SEQ ID NO: последовательности в Списке последовательностей. Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты может содержать только кодирующую область любой из последовательностей нуклеиновых кислот Списка последовательностей.
Для целей по данной заявке должно быть понятно, что каждая из последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, приведенных в Списке последовательностей, имеет идентифицирующий номер RXA, RXN, RXS или RXC, имеющий обозначение «RXA», «RXN», «RXS» или «RXC», с последующими 5 цифрами (т.е. RXA02458, RXN00249, RXS00153 или RXC00963). Каждая из этих последовательностей нуклеиновых кислот содержит до трех частей: 5'- концевая область, кодирующая область и 3'- концевая область. Каждая из этих трех областей идентифицирована тем же самым обозначением RXA, RXN, RXS или RXC для исключения путаницы. Тогда ссылка на "одну из имеющих нечетные номера последовательностей Списка последовательностей" относится к любой из последовательностей нуклеиновых кислот в Списке последовательностей, которые могут быть также различены отличающимися обозначениями RXA, RXN, RXS или RXC. Кодирующая область каждой из этих последовательностей транслируется в соответствующую аминокислотную последовательность, которая также изображена в Списке последовательностей, в виде имеющих четные номера SEQ ID NO: непосредственно после соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты. Например, кодирующая область для RXA02548 представлена в SEQ ID NO:1, тогда как аминокислотная последовательность, которую он кодирует, представлена в виде SEQ ID NO:2. Последовательности молекул нуклеиновых кислот данного изобретения идентифицируются теми же самыми обозначениями RXA, RXN, RXS или RXC, что и молекулы аминокислот, которые они кодируют, так что они могут быть легко соотнесены друг с другом. Например, аминокислотные последовательности, обозначенные RXA02458, RXN00249, RXS00153 и RXC00963, являются трансляциями кодирующих областей нуклеотидной последовательности молекул нуклеиновых кислот RXA02458, RXN00249, RXS00153 и RXC00963, соответственно. Соответствие между нуклеотидными и аминокислотными последовательностями RXA, RXN, RXS и RXC данного изобретения и их приписанными SEQ ID NO: показано в таблице 1.
Несколько генов данного изобретения являются «F-обозначенными генами». F-обозначенный ген включает в себя гены, представленные в таблице 1, которые имеют «F» перед обозначением RXA, RXN, RXS или RXC. Например, последовательность SEQ ID NO:5, обозначенная, как указано в таблице 1, как «F RXA00249», является F-обозначенным геном, как и SEQ ID NO:11, 15 и 33 (обозначенные в таблице 1 как «F RXA02264», «F RXA02274» и «F RXA00675», соответственно).
В одном варианте молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения не включают в себя молекулы нуклеиновых кислот С. glutamicum, собранные в таблице 2. В случае гена dapD, последовательность для этого гена была опубликована Wehrmann, A., et al., (1998) J. Bacteriol. 180(12): 3159-3165. Однако, последовательность, полученная авторами данной заявки, является значительно более длинной, чем опубликованная версия. Авторы считают, что опубликованная версия основывается на неправильном стартовом (инициирующем) кодоне и, следовательно, представляет только фрагмент истинной кодирующей области.
В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом одной из нуклеотидных последовательностей данного изобретения (например, последовательности, имеющей нечетный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей), или ее часть. Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна одной из нуклеотидных последовательностей данного изобретения, является последовательностью, которая достаточно комплементарна одной из нуклеотидных последовательностей в Списке последовательностей (например, последовательности, имеющей нечетный номер SEQ ID NO:), так что она может гибридизоваться с одной из нуклеотидных последовательностей данного изобретения с образованием в результате стабильного дуплекса.
Еще в одном предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит нуклеотидную последовательность, которая является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% или 60%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% или 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% или 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90%, или 91%, 92%, 93%, 94%, или даже более предпочтительно на, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей нечетный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей), или ее часть. Подразумевается, что диапазоны и величины идентичности, промежуточные относительно указанных выше диапазонов (например, идентичные на 70-90% или идентичные на 80-95%), также охватываются данным изобретением. Например, подразумевается, что включены также диапазоны величин идентичности, использующие комбинацию любых из указанных выше величин в качестве верхнего и/или нижнего пределов). В дополнительном предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения содержит нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется, например, гибридизуется в жестких условиях, с одной из нуклеотидных последовательностей данного изобретения (например, последовательностью, имеющей нечетный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей), или ее часть.
Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения может содержать только часть кодирующей области последовательности одной из имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей, например, фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий биологически активную часть белка НА. Эти нуклеотидные последовательности, определенные из клонирования генов НА из С. glutamicum, позволяют получать зонды и праймеры, сконструированные для применения в идентификации и/или клонировании НА-гомологов в других клеточных типах и организмах, а также НА-гомологов из других Corynebacteria или родственных видов. Зонд/праймер обычно содержит существенно чистый олигонуклеотид. Олигонуклеотид обычно содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях, по меньшей мере, с приблизительно 12, предпочтительно приблизительно 25, более предпочтительно приблизительно 40, 50 или 75 последовательными нуклеотидами смысловой цепи одной из нуклеотидных последовательностей данного изобретения (например, последовательностью, имеющей нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей), антисмысловой последовательностью одной из этих последовательностей или их природными мутантами. Праймеры на основе нуклеотидной последовательности данного изобретения могут быть использованы в ПЦР-реакциях для клонирования НА-гомологов. Зонды на основе нуклеотидной последовательности НА могут быть использованы для детектирования транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих те же самые или гомологичные белки. В предпочтительных вариантах такой зонд дополнительно содержит группу метки, присоединенную к нему, например, эта группа метки может быть радиоактивным изотопом, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента. Такие зонды могут быть использованы как часть диагностического тест-набора для идентификации клеток, которые имеют нарушенную экспрессию белка НА, например, измерением уровня кодирующей НА нуклеиновой кислоты в пробе клеток, например, детектированием уровней мРНК НА, или определением, был ли геномный ген НА мутирован или делетирован.
В одном варианте молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения кодирует белок или его часть, которые включают в себя аминокислотную последовательность, которая является достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей), так что этот белок или его часть сохраняет способность участвовать в поддержании гомеостаэа в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. Как используется здесь, термин "достаточно гомологичный" относится к белкам или их частям, которые имеют аминокислотные последовательности, включающие минимальное количество идентичности или эквивалента (например, остаток аминокислоты, который имеет подобную боковую цепь в качестве остатка аминокислоты в последовательности одного из четных номеров SEQ ID NO: Списка последовательностей) аминокислотных остатков, аминокислотных последовательностей данного изобретения, так что этот белок или его часть сохраняет способность участвовать в поддержании гомеостаза в С.glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. Белки, участвующие в биосинтезе или перестройках клеточных стенок в С. glutamicum, метаболизме неорганических соединений, модификации или разрушении ароматических или алифатических соединений, или имеющие ферментативную или протеолитическую активность С. glutamicum, как описано здесь, могут играть роль в продуцировании и секреции одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза. Примеры активностей белка НА представлены в таблице 1. Таким образом, «функция белка НА» вносит вклад, прямо или опосредованно, в выход, продуктивность и/или эффективность продуцирования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза. Примеры активностей белков НА приведены в таблице 1.
В другом варианте этот белок является, по меньшей мере, приблизительно на 50-60%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60-70% и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70-80%, 80-90%, 90-95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, имеющей четные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей).
Части белков, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот НА данного изобретения, являются предпочтительно биологически активными частями одного из белков НА. В применении здесь, термин «биологически активная часть белка НА» включает в себя часть, например, домен/мотив, белка НА, которая способна участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или может выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды, или имеет активность, приведенную в таблице 1. Для определения, может ли белок НА или его биологически активная часть участвовать в биосинтезе или перестройках клеточных стенок в С. glutamicum, метаболизме неорганических соединений, модификации или разрушении ароматических или алифатических соединений или имеет ферментативную или протеолитическую активность С. glutamicum, может быть выполнен анализ ферментативной активности. Такие способы анализов хорошо известны в данной области среднему специалисту в данной области, как подробно описано в примере 8 раздела иллюстрации примерами.
Дополнительные фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие биологически активные части белка НА, могут быть получены выделением части одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательности, имеющей четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей), экспрессией кодируемой части белка или пептида НА (например, рекомбинантной экспрессией in vitro) и оценкой активности кодируемой части этого белка или пептида НА.
Далее, данное изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые отличаются от нуклеотидных последовательностей данного изобретения (например, последовательности, имеющей нечетный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей) (или их части) вследствие вырожденности генетического кода, и, следовательно, кодируют тот же самый белок НА, что и кодируемый нуклеотидными последовательностями данного изобретения. В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в Списке последовательностей (например, имеющую четный номер SEQ ID NO:). Еще в одном варианте молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения кодирует полноразмерный белок С. glutamicum, который является существенно гомологичным аминокислотной последовательности данного изобретения (кодируемой открытой рамкой считывания, показанной в имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей).
Среднему специалисту в данной области должно быть понятно, что в одном варианте последовательности данного изобретения не должны включать в себя последовательности предыдущего уровня техники, такие как последовательности Genbank, приведенные в таблицах 2 или 4, которые были доступны до данного изобретения. В одном варианте данное изобретение включает в себя нуклеотидные и аминокислотные последовательности, имеющие процентную идентичность относительно нуклеотидной или аминокислотной последовательности данного изобретения, которая является больше идентичности последовательности предыдущего уровня техники (например, последовательности Genbank (или белка, кодируемого такой последовательностью), приведенных в таблицах 2 или 4). Например, данное изобретение включает в себя нуклеотидную последовательность, которая является более, чем на 44%, и/или, по меньшей мере, на 44% идентичной нуклеотидной последовательности, обозначенной RXA00471 (SEQ ID NO:293), нуклеотидную последовательность, которая является более, чем на 41%, и/или, по меньшей мере, на 41% идентичной нуклеотидной последовательности, обозначенной RXA00500 (SEQ ID NO:143), и нуклеотидную последовательность, которая является более, чем на 35%, и/или, по меньшей мере, на 35% идентичной нуклеотидной последовательности, обозначенной RXA00502 (SEQ ID NO:147). Средний специалист в данной области сможет рассчитать низший предел процентной идентичности для любой конкретной последовательности данного изобретения исследованием оценок рассчитанной с использованием программы GAP процентной идентичности, приведенных в таблице 4 для каждого из трех наивысших совпадений для конкретной последовательности, и вычитанием наивысшей рассчитанной с использованием программы GAP процентной идентичности из 100 процентов. Специалисту в данной области будет также понятно, что последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, имеющие процентные идентичности, большие, чем нижний предел, рассчитанный таким образом (например, по меньшей мере, на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% или 60%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% или 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% или 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90%, или 91%, 92%, 93%, 94%, или даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичные), также включены в данное изобретение.
Среднему специалисту в данной области должно быть понятно, что, кроме нуклеотидных последовательностей НА С. glutamicum, приведенных в Списке последовательностей в виде имеющих нечетные номера SEQ ID NO:, в популяции (например, в популяции С. glutamicum) могут существовать полиморфизмы последовательности ДНК, которые приводят к заменам в аминокислотных последовательностях белков НА. Такой генетический полиморфизм в гене НА может существовать среди индивидуумов в популяции вследствие природной изменчивости. В применении здесь, термины "ген" и "рекомбинантный ген" относятся к молекулам нуклеиновых кислот, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую белок НА, предпочтительно белок НА С. glutamicum. Такие природные вариации могут обычно приводить к 1-5% дисперсии в нуклеотидной последовательности гена НА. Подразумевается, что любые и все такие вариации нуклеотидов и полученные полиморфизмы аминокислот в НА, которые являются результатом природной изменчивости и которые не изменяют функциональную активность белков НА, входят в объем данного изобретения.
Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие природным вариантам и не относящимся к С. glutamicum гомологам ДНК НА С. glutamicum данного изобретения, могут быть выделены на основе их гомологии описанной здесь нуклеиновой кислоте НА С. glutamicum с использованием ДНК С. glutamicum или ее части в качестве гибридизационного зонда в соответствии со стандартными способами гибридизации в жестких условиях гибридизации. Таким образом, в другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения имеет длину, по меньшей мере, 15 нуклеотидов и гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, имеющую нечетный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей. В других вариантах эта нуклеиновая кислота имеет длину, по меньшей мере, 30, 50, 100, 250 или более нуклеотидов. В применении здесь, термин "гибридизуется в жестких условиях" относится к условиям гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности, по меньшей мере, на 60% гомологичные друг другу, обычно остаются гибридизованными друг с другом. Предпочтительно, эти условия являются такими, что последовательности, по меньшей мере, приблизительно на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70% и даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 75% или более гомологичные друг другу, обычно остаются гибридизованными друг с другом. Такие жесткие условия известны среднему специалисту в данной области и могут быть найдены в Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Предпочтительным, неограничительным примером жестких условий гибридизации является гибридизация в 6Х смеси хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при примерно 45°С с последующими одной или несколькими промывками в 0,2×SSC, 0,1 ДСН при 50-65°С. Предпочтительно, выделенная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью данного изобретения, соответствует природной молекуле нуклеиновой кислоты. В применении здесь, "природной" молекулой нуклеиновой кислоты называют молекулу РНК или ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе (например, кодирует природный белок). В одном варианте эта нуклеиновая кислота кодирует белок НА С. glutamicum.
Специалисту в данной области будет также понятно, что кроме природных вариантов последовательности НА, которые могут существовать в популяции, в нуклеотидную последовательность данного изобретения могут быть введены изменения посредством мутации, что приведет к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого белка НА, без изменения функциональной способности этого белка НА. Например, в нуклеотидной последовательности данного изобретения могут быть произведены замены нуклеотидов, приводящие к заменам аминокислот в «заменимых» аминокислотных остатках. «Заменимым» аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен в сравнении с последовательностью дикого типа одного из белков НА (например, имеющих четные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей) без изменения активности указанного белка НА, тогда как «незаменимый» аминокислотный остаток является необходимым для активности белка НА. Однако, другие аминокислотные остатки (например, остатки, которые являются неконсервативными или только полуконсервативными в домене, имеющем активность НА) могут не быть незаменимыми для активности и, следовательно, будут, вероятно, доступными для изменения без изменения активности НА.
Таким образом, другой аспект данного изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим белки НА, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, которые являются заменимыми для активности НА. Такие белки НА отличаются по аминокислотной последовательности от последовательности, имеющей четные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей, но все еще сохраняют, по меньшей мере, одну из описанных здесь активностей НА. В одном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, где этот белок содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, приблизительно на 50% гомологичную аминокислотной последовательности данного изобретения, и способен участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды, или имеет одну или несколько активностей, приведенных в таблице 1. Предпочтительно, белок, кодируемый этой молекулой нуклеиновой кислоты, является, по меньшей мере, приблизительно на 50-60% гомологичным аминокислотной последовательности одной из имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60-70% гомологичным одной из этих последовательностей, даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 70-80%, 80-90%, 90-95% гомологичным одной из этих последовательностей, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 96%, 97%, 98% или 99% гомологичным одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения.
Для определения процентной гомологии двух аминокислотных последовательностей (например, одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения и ее мутантной формы) или двух нуклеиновых кислот, эти последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, в последовательности одного белка или нуклеиновой кислоты могут быть введены гэпы (пропуски) для оптимального выравнивания с другим белком или другой нуклеиновой кислотой). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Когда положение в одной последовательности (например, в одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения) занято тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение в другой последовательности (например, в мутантной форме этой аминокислотной последовательности), тогда эти молекулы являются гомологичными в данном положении (т.е., в применении здесь, «гомология» аминокислоты или нуклеиновой кислоты эквивалентна «идентичности» аминокислоты или нуклеиновой кислоты). Процентная гомология между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих у двух последовательностей (т.е. %-ная гомология = число идентичных положений/общее число положений ×100).
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок НА, гомологичный последовательности белка данного изобретения (например, последовательности, имеющие четные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей), может быть создана введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в нуклеотидную последовательность данного изобретения, так что одна или несколько замен, добавлений или делеций аминокислот вводятся в кодируемый белок. Мутации могут быть введены в одну из нуклеотидных последовательностей данного изобретения стандартными способами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Предпочтительно, производят консервативные замены аминокислот в одном или нескольких предсказанных заменимых аминокислотных остатках. «Консервативной заменой аминокислоты» является замена, в которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный заменимый аминокислотный остаток в белке НА предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же самого семейства боковых цепей. Альтернативно, в другом варианте мутации могут быть введены случайным образом вдоль всей или части кодирующей последовательности НА, например, насыщающим мутагенезом, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на активность НА, описанную здесь, для идентификации мутантов, которые сохраняют активность НА. После мутагенеза одной из нуклеотидных последовательностей, имеющих нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей, кодируемый белок может быть экспрессирован рекомбинантно и активность этого белка может быть определена с использованием, например, анализов, описанных здесь (см. пример 8 раздела иллюстрации примерами).
Кроме молекул нуклеиновых кислот, кодирующих описанные выше белки НА, другой аспект данного изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые являются антисмысловыми по отношению к ним. «Антисмысловая» нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна «смысловой» нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, например, комплементарна кодирующей цепи двухцепочечной молекулы ДНК или комплементарна последовательности мРНК. Таким образом, антисмысловая нуклеиновая кислота может связываться водородной связью со смысловой нуклеиновой кислотой. Антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарной полной кодирующей цепи НА или только ее части. В одном варианте антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты является антисмысловой относительно «кодирующей области» кодирующей цепи нуклеотидной последовательности, кодирующей белок НА. Термин «кодирующая область» относится к области нуклеотидной последовательности, содержащей кодоны, которые транслируются в аминокислотные остатки (например, полная кодирующая область SEQ ID N0:3 (RXN00249) содержит нуклеотиды 1-957). В другом варианте антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты является антисмысловой относительно «некодирующей области» кодирующей цепи нуклеотидной последовательности, кодирующей НА. Термин «некодирующая область» относится к 5'- и 3' -последовательностям, которые фланкируют кодирующую область, которые не транслируются в аминокислоты (т.е. их называют также 5'- и 3'-нетранслируемыми областями).
При наличии последовательностей кодирующей цепи, кодирующих НА, описанных здесь (например, последовательности, представленные в имеющих нечетные номера SEQ ID NO: в Списке последовательностей), антисмысловые нуклеиновые кислоты данного изобретения могут быть сконструированы согласно правилам спаривания оснований Уотсона и Крика. Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты может быть комплементарна полному кодирующей области мРНК НА, но более предпочтительно она является олигонуклеотидом, который является антисмысловым относительно только части кодирующей или некодирующей области мРНК НА. Например, антисмысловой олигонуклеотид может быть комплементарным области, окружающей стартовый сайт трансляции мРНК НА. Антисмысловой олигонуклеотид может иметь длину, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов. Антисмысловая нуклеиновая кислота данного изобретения может быть сконструирована при помощи химического синтеза и реакциями ферментативного лигирования с использованием процедур, известных в данной области. Например, антисмысловая нуклеиновая кислота (например, антисмысловой олигонуклеотид) может быть химически синтезирована с использованием природных нуклеотидов или разнообразно модифицированных нуклеотидов, сконструированных для повышения биологической стабильности этих молекул или для увеличения физической стабильности дуплекса, образуемого между антисмысловой и смысловой нуклеиновыми кислотами, например, могут быть использованы фосфоротиоатные производные и замещенные акридином нуклеотиды. Примеры модифицированных нуклеотидов, которые могут быть использованы для производства антисмысловой нуклеиновой кислоты, включают в себя 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-иодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбокси-гидроксиметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламино-метилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеозин, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метил-гуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбокси-метилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентенил-аденин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3-амино-3-N-2-карбоксипропил)урацил, (acp3)w и 2,6-диаминопурин. Альтернативно, антисмысловая нуклеиновая кислота может быть получена биологически с использованием экспрессирующего вектора, в который была субклонирована нуклеиновая кислота в антисмысловой ориентации (т.е. РНК, транскрибированная с инсертированной нуклеиновой кислоты, будет иметь антисмысловую ориентацию относительно представляющей интерес нуклеиновой кислоты-мишени, описанной далее в следующем подразделе).
Молекулы антисмысловых нуклеиновых кислот данного изобретения обычно вводят в клетку или генерируют in situ таким образом, что они гибридизуются или связываются с клеточной мРНК и/или геномной ДНК, кодирующей белок НА, для ингибирования посредством этого экспрессии этого белка, например, посредством ингибирования транскрипции и/или трансляции. Гибридизация может происходить посредством общепринятой комплементарности нуклеотидов с образованием стабильного дуплекса или, например, в случае антисмысловой молекулы нуклеиновой кислоты, которая связывается с дуплексами ДНК, через специфические взаимодействия в большой бороздке двойной спирали. Антисмысловая молекула может быть модифицирована таким образом, что она специфически связывается с рецептором или антигеном, экспрессируемым на поверхности выбранной клетки, например, посредством связывания молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты с пептидом или антителом, которые связываются с рецептором поверхности клетки или антигеном. Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты может также доставляться в клетки с использованием описанных здесь векторов. Для производства достаточных внутриклеточных концентраций антисмысловых молекул предпочтительными являются векторные конструкции, в которые молекулу антисмысловой нуклеиновой кислоты помещают под контроль сильного прокариотического, вирусного или эукариотического промотора.
Еще в одном варианте молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты данного изобретения является α-аномерной молекулой нуклеиновой кислоты, α-аномерная молекула нуклеиновой кислоты образует специфические двухцепочечные гибриды с комплементарной РНК, в которых, в противоположность обычным β-единицам, цепи идут параллельно друг другу (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты может также содержать 2'-о-метилрибонуклеотид (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) или химерный аналог РНК-ДНК (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).
Еще в одном варианте антисмысловая нуклеиновая кислота данного изобретения является рибозимом. Рибозимы являются каталитическими молекулами РНК с рибонуклеазной активностью, которые способны расщеплять одноцепочечную нуклеиновую кислоту, такую как мРНК, к которой они имеют комплементарную область. Таким образом, рибозимы (например, молотоголовые рибозимы (описанные в Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)) могут быть использованы для каталитического расщепления мРНК-транскриптов НА с ингибированием тем самым трансляции мРНК НА. Рибозим, имеющий специфичность в отношении кодирующей НА нуклеиновой кислоты, может быть сконструирован на основе нуклеотидной последовательности описанной здесь ДНК НА (т.е. SEQ ID NO:3 (RXN00249)). Например, может быть сконструировано производное РНК Tetrahymena L-19 IVS, в котором нуклеотидная последовательность активного сайта является комплементарной нуклеотидной последовательности, которая должна быть расщеплена в кодирующей НА мРНК. См., например, Cech et al. U.S. Patent No. 4 987 071 и Cech et al. U.S. Patent No. 5 116 742. Альтернативно, мРНК НА может быть использована для отбора каталитической РНК, имеющей специфическую рибонуклеазную активность, из пула молекул РНК. См., например, Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.
Альтернативно, экспрессия гена НА может ингибироваться нацеливающими нуклеотидными последовательностями, комплементарными регуляторной области нуклеотидной последовательности НА (например, промотору и/или энхансерам НА) с образованием тройных спиральных структур, которые препятствуют транскрипции гена НА в клетках-мишенях. См., в общем, Helene, С. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, С. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; и Maher, L.J. (1992) Bioassays 14 (12):807-15.
В. Рекомбинантные экспрессирующие векторы и клетки-хозяева
Другой аспект данного изобретения относится к векторам, предпочтительно экспрессирующим векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок НА (или его часть). В применении здесь, термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Одним типом вектора является «плазмида», которая является кольцевой двухцепочечной ДНК-петлей, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, причем дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в который их вводят (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, не-эписомные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют здесь «экспрессирующими векторами». Обычно, экспрессирующие векторы, используемые в способах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В данном описании термины «плазмида» и «вектор» используются взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее обычно используемой формой вектора. Однако, данное изобретение предполагает включение таких других форм экспрессирующих векторов, как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения содержат нуклеиновую кислоту данного изобретения в форме, пригодной для экспрессии этой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что эти рекомбинантные экспрессирующие векторы включают в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе используемых для экспрессии клеток-хозяев, которые функционально связаны с экспрессируемой последовательностью нуклеиновой кислоты. В рекомбинантном экспрессирующем векторе, «функционально связанные» означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью (регуляторными последовательностями) таким образом, что возможна экспрессия этой нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине, при введении этого вектора в клетку-хозяина). Термин «регуляторная последовательность» включает в себя промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают в себя последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клетки-хозяина и которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах. Предпочтительными регуляторными последовательностями являются например, промоторы, такие как cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, lpp-lac-, ladq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, λ-PR- или λ PL, которые используют предпочтительно в бактериях. Дополнительными регуляторными последовательностями являются, например, промоторы из дрожжей и грибов, такие как ADC1, MFα, AC, Р-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, промоторы из растений, такие как CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos или убиквитин- или фазеолин-промоторы. Можно также использовать синтетические промоторы. Среднему специалисту в данной области будет понятно, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор трасформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Экспрессирующие векторы данного изобретения могут быть введены в клетки-хозяева для получения при помощи них белков или пептидов, в том числе слитых белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, описанными здесь (например, белков НА, мутантных форм белков НА, слитых белков и т.д.).
Рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения могут быть сконструированы для экспрессии белков НА в прокариотических или эукариотических клетках. Например, гены НА могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как С. glutamicum, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжах и других грибных клетках (см. Romanes, M.A. et al. (1992) «Foreign gene expression in yeast: a review». Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) «Heterologous gene expression in filamentous fungi» in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet and L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; и van den Hondel, C.A.M.J.J. and Punt, P.J. (1991) «Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), водорослях и клетках многоклеточных растений (см. Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants» Plant Cell Rep.: 583-586) или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждаются дополнительно в Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может быть транскрибирован и транслирован in vitro, например, с использованием промоторных регуляторных последовательностей Т7 и полимеразы Т7.
Экспрессию белков в прокариотах наиболее часто проводят с векторами, содержащими конститутивные или индуцируемые промоторы, направляющие экспрессию слитых или неслитых белков. Слитые векторы добавляют ряд аминокислот к кодируемому в них белку, обычно к амино-концу рекомбинантного белка, но также и к С-концу или сливаются в пределах подходящих областей в белках. Такие слитые векторы обычно служат для достижения трех целей: 1) для повышения экспрессии рекомбинантного белка; 2) для повышения растворимости рекомбинантного белка и 3) для того, чтобы способствовать очистке рекомбинантного белка посредством действия в качестве лиганда в аффинной очистке. Часто, в слитых экспрессирующих векторах, вводится сайт протеолитического расщепления в месте соединения слитой части молекулы и рекомбинантного белка для обеспечения возможности отделения рекомбинантного белка от слитой части молекулы после очистки слитого белка. Такие ферменты и их родственные последовательности узнавания включают в себя фактор Ха, тромбин и энтерокиназу.
Типичные слитые экспрессирующие векторы включают в себя pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) и pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), которые сливают глутатион S-трансферазу (GST), мальтозу Е-связывающий белок, или протеин А, соответственно, с рекомбинантным белком-мишенью. В одном варианте кодирующую последовательность белка НА клонируют в экспрессирующий вектор pGEX для создания вектора, кодирующего слитый белок, содержащий, от N-конца к С-концу, GST-сайт расщепления тромбином-Х белок. Этот слитый белок может быть очищен аффинной хроматографией с использованием глутатион-агарозной смолы. Рекомбинантный белок НА, не слитый с GST, может быть извлечен расщеплением слитого белка тромбином.
Примеры подходящих индуцируемых неслитых экспрессирующих векторов Е. coli включают в себя pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315), pLG338, pACYCl84, pBR322, pUC18, pUC19, рКС30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgtll, pBdC1 и pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; и Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0 444 904018). Экспрессия гена-мишени из вектора pTrc основана на транскрипции РНК-полимеразой хозяина от гибридного trp-lac слитого промотора. Экспрессия гена-мишени из вектора pET 11d основана на транскрипции от слитого промотора gn10-lac T7, опосредованной коэкспрессируемой вирусной РНК-полимеразой (gnl T7).Эта вирусная полимераза поставляется штаммами-хозяевами BL21(DE3) или HMS174(DE3) из резидентного профага λ, несущего ген gnl T7 под транскрипционным контролем промотора lacUV 5. Для трансформации других разновидностей бактерий, могут быть выбраны соответствующие векторы. Например, известно, что плазмиды pIJl0l, pIJ364, pIJ702 и pIJ361 применимы в трансформации Streptomyces, тогда как плазмиды pUB110, pC194 или pBD214 пригодны для трансформации видов Bacillus. Несколько плазмид, применимых в переносе генетической информации в Corynebacterium, включают в себя рНМ1519, pBL1, pSA77 или pAJ667 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0 444 904018).
Одна стратегия максимизации экспрессии рекомбинантного белка состоит в экспрессии этого белка в бактерии-хозяине с нарушенной способностью протеолитически расщеплять рекомбинантный белок (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Другая стратегия состоит в изменении последовательности нуклеиновой кислоты, которая должна быть встроена в экспрессирующий вектор, таким образом, что индивидуальные кодоны для каждой аминокислоты являются кодонами, предпочтительно используемыми в бактерии, выбранной для экспрессии, такой как С. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Такое изменение последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения может проводиться стандартными способами синтеза ДНК.
В другом варианте экспрессирующий белок НА вектор является дрожжевым экспрессирующим вектором. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах S. cerevisiae включают в себя pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) EMBO J. 6:229-234), 2 μ, pAG-1, Yep 6, Yepl3, pEMBLYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schuiz et al., (1987) Gene 54:113-123) и pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Векторы и способы конструирования векторов, пригодных для применения в других грибах, таких как нитчатые грибы, включают в себя способы и векторы, подробно описанные в van den Hondel, C.A.M.J.J. and Punt, P.J. (1991) «Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi», in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, и Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0 444 904018).
Альтернативно, белки НА данного изобретения могут экспрессироваться в клетках насекомых с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов. Бакуловирусные векторы, пригодные для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых (например, в клетках Sf9), включают в себя ряд рАс (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) и ряд pVL (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39).
В другом варианте белки НА данного изобретения могут экспрессироваться в клетках одноклеточных растений (таких как водоросли) и в растительных клетках из высших растений (например, семенных растений, таких как сельскохозяйственные культуры). Примеры экспрессирующих векторов растений включают в себя векторы, подробно описанные в Becker, D., Kemper, E., Schell. J. and Masterson, R. (1992) «New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border», Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; и Bevan, M.W. (1984) «Binary Agrobacterium vectors for plant transformation», Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721, и включают в себя pLGV23, pGHlac+, pBIN19, рАК2004 и pDH51 (Pouwels et al., (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0 444 904018).
Еще в одном варианте нуклеиновая кислота данного изобретения экспрессируется в клетках млекопитающих с использованием экспрессирующего вектора млекопитающего. Примеры экспрессирующих векторов млекопитающих включают в себя pCDM8 (Seed, В. (1987) Nature 329: 840) и рМТ2РС (Kaufman et al., (1987) EMBO J. 6:187-195). При использовании в клетках млекопитающего регуляторные функции этого экспрессирующего вектора часто относятся к вирусным регуляторным элементам. Например, обычно используемые промоторы происходят из полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса и вируса обезьян 40. В отношении подходящих экспрессирующих векторов для прокариотических и эукариотических клеток см. главы 16 и 17 Sambrook J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
В другом варианте рекомбинантный экспрессирующмй вектор млекопитающих способен направлять экспрессию нуклеиновой кислоты преимущественно (преферентивно) в конкретном типе клеток (например, используют тканеспецифические регуляторные элементы для экспрессии нуклеиновой кислоты). Тканеспецифические регуляторные элементы известны в данной области. Неограничивающие примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают в себя промотор альбумина (печень-специфический; Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277), лимфоид-специфические промоторы (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), в частности, промоторы Т-клеточных рецепторов (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) и иммуноглобулинов (Banerji et al., (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), нейрон-специфические промоторы (например, промотор нейрофиламента; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), специфические для поджелудочной железы промоторы (например, промотор молочной сыворотки; Патент США № 4 873 316 и Публикация по заявке на выдачу Европейского патента № 264 166). Включены также регулируемые стадией развития промоторы, например, мышиные промоторы hox (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) и промотор α-фетопротеина (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
Далее, данное изобретение относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору, содержащему молекулу ДНК данного изобретения, клонированную в этот экспрессирующий вектор в антисмысловой ориентации. То есть, эта молекула ДНК функционально связана с регуляторной последовательностью таким образом, что возможна экспрессия (транскрипцией этой молекулы ДНК) молекулы РНК, которая является антисмысловой относительно мРНК НА. Могут быть выбраны регуляторные последовательности, функционально связанные с нуклеиновой кислотой, клонированной в антисмысловой ориентации, которые направляют непрерывную экспрессию этой антисмысловой молекулы РНК в многочисленных клеточных типах, например, вирусные промоторы и/или энхансеры, или могут быть выбраны регуляторные последовательности, которые направляют конститутивную, тканеспецифическую или специфическую для определенного типа клеток экспрессию антисмысловой РНК. Антисмысловой экспрессирующий вектор может быть в форме рекомбинантной плазмиды, фагмиды или аттенуированного вируса, в котором антисмысловые нуклеиновые кислоты продуцируются под контролем высокоэффективной регуляторной области, активность которой может определяться типом клеток, в которые вводят этот вектор. В отношении обсуждения регуляции экспрессии генов с использованием антисмысловых генов см. Weintraub, Н. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis. Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.
Другой аспект данного изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые вводили рекомбинантный экспрессирующий вектор данного изобретения. Термины «клетка-хозяин» и «рекомбинантная клетка-хозяин» используются здесь взаимозаменяемо. Понятно, что такие термины относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут встречаться в последующих генерациях вследствие мутации или влияний окружающей среды, такое потомство на самом деле может не быть идентичным родительской клетке, но оно все-таки включено в рамки этого термина, в применении здесь.
Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например, белок НА может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как С. glutamicum, клетках насекомых, клетках дрожжей или млекопитающих (таких как клетки яичника Китайского хомячка (СНО) или клетки COS). Другие подходящие клетки-хозяева известны среднему специалисту в данной области. Микроорганизмы, родственные Corynebacterium glutamicum, которые могут быть легко использованы в качестве клеток-хозяев для молекул нуклеиновых кислот и белков данного изобретения, приведены в таблице 3.
Вектор ДНК может быть введен в прокариотические или эукариотические клетки посредством общепринятых способов трансформации или трансфекции. В применении здесь, термины «трансформация» и «трансфекция» относятся к различным признанным в данной области способам введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, линейной ДНК или РНК (например, линеаризованного вектора или генной конструкции отдельно без вектора) или нуклеиновой кислоты в форме вектора (например, плазмиды, фага, фазмиды, фагмиды, транспозона или другой ДНК) в клетку-хозяина, в том числе копреципитации фосфатом кальция или хлоридом кальция, опосредованной ДЭАЭ-декстраном трансфекции, липофекции, природной компетентностью, химически опосредованной трансфекции или электропорации. Подходящие способы для трансформации или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в Sambrook, et al., (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) и других лабораторных руководствах-справочниках.
В отношении стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что, в зависимости от экспрессирующего вектора и способа трансфекции, только небольшая фракция клеток может интегрировать чужеродную ДНК в их геном. Для идентификации и отбора этих интегрирующих ДНК клеток (интегрантов) ген, который кодирует селектируемый маркер (например, ген устойчивости к антибиотикам), вводят обычно в клетки-хозяева вместе с представляющим интерес геном. Предпочтительные селектируемые маркеры включают в себя маркеры, придающие устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селектируемый маркер, может быть введена в клетку-хозяина на том же самом векторе, что и вектор, кодирующий белок НА, или может быть введена на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы отбором с лекарственным средством (например, клетки, которые включили ген селектируемого маркера, будут выживать, тогда как другие клетки погибают).
Для создания гомологичного рекомбинантного микроорганизма готовят вектор, который содержит, по меньшей мере, часть гена НА, в который была введена делеция, добавление или замена, для изменения посредством этого, например, функционального нарушения, гена НА. Предпочтительно, этот ген является геном НА Corynebacterium glutamicum, но он может быть гомологом из родственной бактерии или даже из млекопитающего, дрожжей или насекомого. В предпочтительном варианте этот вектор конструируют таким образом, что, при гомологичной рекомбинации, эндогенный ген НА функционально разрушается (т.е. уже больше не кодирует функциональный белок; этот вектор называют также «нокаут»-вектором). Альтернативно, вектор может быть сконструирован таким образом, что, при гомологичной рекомбинации, эндогенный ген НА мутируется или иным образом изменяется, но все еще кодирует функциональный белок (например, регуляторная область против хода транскрипции может быть изменена для изменения посредством этого экспрессии эндогенного белка НА). В векторе гомологичной рекомбинации, изменяемая часть гена НА фланкирована на ее 5'- и 3'-концах дополнительной нуклеиновой кислотой гена НА, чтобы сделать возможной гомологичную рекомбинацию между экзогенным геном НА, переносимым этим вектором, и эндогенным геном НА в микроорганизме. Дополнительная фланкирующая нуклеиновая кислота НА имеет достаточную длину для успешной гомологичной рекомбинации с эндогенным геном. Обычно, несколько т.п.н. фланкирующей ДНК (как на 5'-, так и на 3'-концах) включают в этот вектор (см., например, Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 в отношении описания векторов гомологичной рекомбинации). Вектор вводят в микроорганизм (например, электропорацией), и клетки, в которых введенный ген НА был гомологично рекомбинирован с эндогенным геном НА, отбирают с использованием известных в данной области способов.
В другом варианте могут быть получены рекомбинантные микроорганизмы, которые содержат выбранные системы, которые делают возможной регулируемую экспрессию введенного гена. Например, включение гена НА на векторе, с помещением его под контроль lac-оперона делает возможной экспрессию гена НА только в присутствии IPTG (изопропилтиогалактозида). Такая регуляторная система хорошо известна в данной области.
В другом варианте эндогенный ген НА в клетке-хозяине разрушают (например, гомологичной рекомбинацией или другими генетическими способами, известными в данной области), так что экспрессия его белкового продукта не происходит. В другом варианте эндогенный или введенный ген НА в клетке-хозяине был изменен одной или несколькими точковыми мутациями, делециями или инверсиями, но все еще кодирует функциональный белок НА. Еще в одном варианте одна или несколько регуляторных областей (например, промотор, репрессор или индуктор) гена НА в микроорганизме была изменена (например, делецией, укорочением, инверсией или точковой мутацией), так что экспрессия гена НА является модулированной. Среднему специалисту в данной области будет понятно, что клетки-хозяева, содержащие более чем одну из описанных модификаций гена и белка НА, могут быть легко получены с использованием способов данного изобретения, и подразумевается, что они включены в данное изобретение.
Клетка-хозяин данного изобретения, например, прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин в культуре, может быть использована для продуцирования (т.е. экспрессии) белка НА. Таким образом, данное изобретение далее относится к способам получения белков НА с использованием клеток-хозяев данного изобретения. В одном варианте этот способ предусматривает культивирование клетки-хозяина данного изобретения (в которую был введен рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий белок НА, или в геном которой был введен ген, кодирующий белок НА дикого типа или измененный белок НА) в подходящей среде до тех пор, пока не продуцируется белок НА. В другом варианте этот способ дополнительно предусматривает выделение белков НА из среды или из клетки-хозяина.
С. Выделенные белки НА
Другой аспект данного изобретения относится к выделенным белкам НА и их биологически активным частям. «Выделенный» или «очищенный» белок или его биологически активная часть по существу не содержит клеточного материала при получении способами рекомбинантных ДНК или при химическом синтезе химических предшественников или других химических продуктов. Выражение «по существу не содержащие клеточного материала» включает в себя препараты белка НА, в которых белок отделен от клеточных компонентов клеток, в которых он природно или рекомбинантно продуцировался. В одном варианте выражение «по существу не содержащие клеточного материала» включает в себя препараты белка НА, имеющие менее, чем приблизительно 30% (по сухому весу) белка не-НА (называемого здесь также «загрязняющим (примесным) белком»), более предпочтительно менее, чем приблизительно 20% белка не-НА, еще более предпочтительно менее, чем приблизительно 10% белка не-НА, и наиболее предпочтительно менее, чем приблизительно 5% белка не-НА. При рекомбинантном получении белка НА или его биологически активной части он предпочтительно является по существу не содержащим культуральной среды, т.е. культуральная среда представляет менее, чем приблизительно 20%, более предпочтительно менее, чем приблизительно 10%, и наиболее предпочтительно менее, чем приблизительно 5% объема препарата белка. Выражение «по существу не содержащие химических предшественников или других химических продуктов» включает в себя препараты белка НА, в которых этот белок отделен от химических предшественников или других химических продуктов, которые участвуют в синтезе этого белка. В одном варианте выражение «по существу не содержащие химических предшественников или других химических продуктов» включает в себя препараты белка НА, имеющие менее, чем приблизительно 30% (по сухому весу) химических предшественников или химических продуктов не-НА, более предпочтительно менее, чем приблизительно 20% химических предшественников или химических продуктов не-НА, еще более предпочтительно менее, чем приблизительно 10% химических предшественников или химических продуктов не-НА, и наиболее предпочтительно менее, чем приблизительно 5% химических предшественников или химических продуктов не-НА. В предпочтительных вариантах выделенные белки или их биологически активные части не содержат загрязняющих (примесных) белков из того же самого организма, из которого получен белок НА. Обычно такие белки получают рекомбинантной экспрессией, например, белка НА С. glutamicum, в микроорганизме, например, С. glutamicum.
Выделенный белок НА или его часть данного изобретения может участвовать в репарации или рекомбинации ДНК, в транспозиции генетического материала, в экспрессии генов (т.е. процессах транскрипции или трансляции), в укладке белка или в секреции белка в С. glutamicum, или имеет одну или несколько активностей, приведенных в таблице 1. В предпочтительных вариантах этот белок или его часть содержит аминокислотную последовательность, которая является достаточно гомологичной аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей), так что этот белок или его часть сохраняет способность участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды. Часть этого белка является предпочтительно биологически активной частью, как описано здесь. В другом предпочтительном варианте белок НА данного изобретения имеет аминокислотную последовательность, представленную в виде имеющих четные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей. Еще в одном предпочтительном варианте белок НА имеет аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется, например, гибридизуется в жестких условиях, с нуклеотидной последовательностью данного изобретения (например, последовательностью, имеющей нечетные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей). Еще в одном предпочтительном варианте белок НА имеет аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% или 60%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% или 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% или 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90%, или 91%, 92%, 93%, 94%, или даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной нуклеотидной последовательности данного изобретения или ее части. Подразумевается, что диапазоны и величины идентичности, промежуточные относительно указанных выше диапазонов (например, идентичные на 70-90% или идентичные на 80-95%), также охватываются данным изобретением. Например, подразумевается, что включены также диапазоны величин идентичности, использующие комбинацию любых из указанных выше величин в качестве верхнего и/или нижнего пределов. Предпочтительные белки НА данного изобретения также предпочтительно обладают, по меньшей мере, одной из описанных здесь активностей НА. Например, предпочтительный белок НА данного изобретения включает в себя аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется, например, гибридизуется в жестких условиях, с нуклеотидной последовательностью данного изобретения, и может участвовать в поддержании гомеостаза в С. glutamicum или может выполнять функцию, участвующую в адаптации этого микроорганизма к различным условиям окружающей среды, или имеет одну или несколько активностей, приведенных в таблице 1.
В других вариантах белок НА является существенно гомологичным аминокислотной последовательности данного изобретения (например, последовательности, имеющей четные номера SEQ ID NO: Списка последовательностей) и сохраняет функциональную активность белка одной из аминокислотных последовательностей данного изобретения, несмотря на то, что он отличается по аминокислотной последовательности вследствие природной изменчивости или мутагенеза, как описано подробно в подразделе I выше. Таким образом, в другом варианте белок НА является белком, который содержит аминокислотную последовательность, которая является, по меньшей мере, приблизительно на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% или 60%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% или 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% или 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90%, или 91%, 92%, 93%, 94%, или даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичной полной аминокислотной последовательности данного изобретения, и который имеет, по меньшей мере, одну из описанных здесь активностей НА. Подразумевается, что диапазоны и величины идентичности, промежуточные относительно указанных выше диапазонов (например, идентичные на 70-90% или идентичные на 80-95%), также охватываются данным изобретением. Например, подразумевается, что включены также диапазоны величин идентичности, использующие комбинацию любых из указанных выше величин в качестве верхнего и/или нижнего пределов. В другом варианте данное изобретение относится к полноразмерному белку С. qlutamicum, который является существенно гомологичным полной аминокислотной последовательности данного изобретения.
Биологически активные части белка НА включают в себя пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, полученные из аминокислотной последовательности белка НА, например, аминокислотную последовательность, имеющую четный номер SEQ ID NO: Списка последовательностей, или аминокислотную последовательность белка, гомологичного белку НА, которая содержит меньше аминокислот, чем полноразмерный белок НА или полноразмерный белок, который гомологичен белку НА, и проявляют, по меньшей мере, одну активность белка НА. Обычно, биологически активные части (пептиды, например, пептиды, которые имеют длину, например, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 или более аминокислот) содержат домен или мотив с, по меньшей мере, одной активностью белка НА. Кроме того, другие биологически активные части, в которых делетированы другие области этого белка, могут быть получены рекомбинантными способами и оценены на одну или несколько описанных здесь активностей. Предпочтительно, биологически активные части белка НА включают в себя один или несколько доменов/мотивов или их частей, имеющих биологическую активность.
Белки НА предпочтительно получают способами рекомбинантных ДНК. Например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую этот белок, клонируют в экспрессирующий вектор (как описано выше), экспрессирующий вектор вводят в клетку-хозяина (как описано выше) и белок НА экспрессируется в клетке-хозяине. Затем белок НА может быть выделен из этих клеток с использованием подходящей схемы очистки при помощи стандартных способов очистки белков. Альтернативно рекомбинантной экспрессии, белок, полипептид или пептид НА может быть синтезирован химически при помощи стандартных способов синтеза пептидов. Кроме того, нативный белок НА может быть выделен из клеток (например, эндотелиальных клеток), например, с использованием анти-НА-антитела, которое может быть получено стандартными способами, использующими белок НА или его фрагмент данного изобретения.
Данное изобретение также относится к химерным или слитым белкам НА. В применении здесь, «химерный белок» или «слитый белок» НА содержит полипептид НА, функционально связанный с полипептидом не-НА. «Полипептид НА» обозначает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую НА, тогда как «полипептид не-НА» обозначает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который не является существенно гомологичным белку НА, например, белку, который отличается от белка НА и который получен из того же самого или другого организма. В слитом белке, термин «функционально связанный» означает, что полипептид НА и полипептид не-НА слиты в одной рамке считывания друг с другом. Полипептид не-НА может быть слит с N-концом или С-концом полипептида НА. Например, в одном варианте слитый белок является слитым белком GST-HA, в котором последовательности НА слиты с С-концом последовательностей GST. Такие слитые белки могут облегчать очистку рекомбинантных белков НА. В другом варианте слитый белок является белком НА, содержащим гетерологичную сигнальную последовательность на его N-конце. В некоторых клетках-хозяевах (например, в клетках-хозяевах млекопитающих) экспрессия и/или секреция белка НА может быть повышена посредством применения гетерологичной сигнальной последовательности.
Предпочтительно, химерный или слитый белок НА данного изобретения получают стандартными способами рекомбинантных ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные полипептидные последовательности, лигируют вместе в рамке считывания в соответствии с общепринятыми способами, например, посредством использования тупых концов или ступенчатых концов для лигирования, расщепления рестриктазами для обеспечения подходящих концов, достраивания липких концов, если нужно, обработки щелочной фосфатазой для избежания нежелательного связывания и ферментативного лигирования. В другом варианте слитый ген может быть синтезирован общепринятыми способами, в том числе с использованием автоматических синтезаторов ДНК. Альтернативно, может быть проведена ПЦР-амплификация фрагментов гена с использованием якорных праймеров, которые вызывают появление выступов между двумя последовательными генными фрагментами, которые могут быть затем подвергнуты отжигу (гибридизованы) и повторно амплифицированы с образованием химерной последовательности гена (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Aucubel et al., John Wiley and Sons: 1992). Кроме того, коммерчески доступными являются многие экспрессирующие векторы, которые уже кодируют необходимую для слияния часть (например, полипептид GST). Кодирующая НА нуклеиновая кислота может быть клонирована в такой экспрессирующий вектор таким образом, что сливаемая часть связывается в рамке считывания с белком НА.
Гомологи белка НА могут быть получены мутагенезом, например, дискретной точковой мутацией или укорочением белка НА. В применении здесь, термин «гомолог» относится к вариантной форме белка НА, которая действует как агонист или антагонист активности белка НА. Агонист белка НА может сохранять по существу те же самые биологические активности или субпопуляцию биологических активностей белка НА. Антагонист белка НА может ингибировать одну или несколько активностей природной формы белка НА, например, конкурентным связыванием со стоящим ниже или выше по ходу процесса членом биохимического каскада НА, который включает в себя белок НА, посредством связывания с молекулой-мишенью, с которой взаимодействует белок НА, так что функциональное взаимодействие не является возможным, или посредством связывания непосредственно с белком НА и ингибирования его нормальной активности.
В альтернативном варианте гомологи белка НА могут быть идентифицированы скринингом комбинаторных библиотек мутантов, например, укороченных мутантов, белка НА на агонистическую или антагонистическую активность относительно белка НА. В одном варианте смешанная библиотека вариантов НА генерируется комбинаторным мутагенезом на уровне нуклеиновых кислот и кодируется библиотекой смешанных (разнообразных) генов. Смешанная библиотека вариантов НА может быть получена, например, ферментативным лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательности генов таким образом, что вырожденный набор потенциальных последовательностей НА может экспрессироваться в виде индивидуальных полипептидов, или альтернативно в виде набора более крупных слитых белков (например, для фагового дисплея), содержащих в них ряд последовательностей НА. Существуют различные способы, которые могут быть использованы для получения библиотек потенциальных гомологов НА из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной последовательности гена может проводиться в автоматическом синтезаторе ДНК, и синтетический ген затем лигируют в подходящий экспрессирующий вектор. Применение вырожденного набора генов позволяет обеспечить, в одной смеси, все последовательности, кодирующие желаемый набор потенциальных последовательностей НА. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.
Кроме того, библиотеки фрагментов кодирующей белок НА последовательности могут быть использованы для генерирования смешанной популяции фрагментов НА для скрининга и последующего отбора гомологов белка НА. В одном варианте библиотека фрагментов кодирующей последовательности может быть получена обработкой двухцепочечного ПЦР-фрагмента кодирующей НА последовательности нуклеазой в условиях, в которых происходит образование одноцепочечных разрывов только приблизительно один раз на молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией этой ДНК с образованием двухцепочечной ДНК, которая может включать в себя смысловые/антисмысловые пары из различных разорванных продуктов, удалением одноцепочечных частей из повторно образованных дуплексов обработкой нуклеазой S1 и лигированием полученной библиотеки фрагментов в экспрессирующий вектор. При помощи этого способа может быть получена экспрессионная библиотека, которая кодирует N-концевые, С-концевые и внутренние фрагменты различного размера белка НА.
Несколько способов известны в данной области для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, приготовленных с использованием точковых мутаций или укорочения, и для скрининга библиотек кДНК на генные продукты, имеющие выбранное свойство. Такие способы можно приспособить для быстрого скрининга библиотек генов, генерируемых комбинаторным мутагенезом гомологов НА. Наиболее широко распространенные способы, которые поддаются высокопроизводительному анализу, для скрининга больших библиотек генов, обычно включают в себя клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, в которых детектирование желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был детектирован. Возвратный комплексный мутагенез (recursive ensemble mutagenesis, REM), новый способ, который усиливает частоту встречаемости функциональных мутантов в библиотеках, может быть использован в сочетании с анализами скрининга для идентификации гомологов НА (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al., (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
В другом варианте анализы на основе клеток могут быть использованы для анализа смешанной библиотеки НА с применением способов, хорошо известных в данной области.
D. Применения и способы изобретения
Молекулы нуклеиновых кислот, белки, белковые гомологи, слитые белки, праймеры, векторы и клетки-хозяева, описанные здесь, могут быть использованы в одном или нескольких из следующих способов: идентификации С. glutamicum и родственных организмов; картировании геномов организмов, родственных С. glutamicum; идентификации и локализации представляющих интерес последовательностей С. glutamicum; эволюционных исследованиях; определении областей белка НА, необходимых для функции; модуляции активности белка НА, модуляции метаболизма одного или нескольких неорганических соединений; модуляции модификации или разрушения одного или нескольких ароматических или алифатических соединений; модуляции синтеза или перестроек клеточных стенок; модуляции активности ферментов или протеолиза и модуляции клеточного продуцирования желаемого соединения, такого как химический продукт тонкого органического синтеза.
Молекулы нуклеиновых кислот НА данного изобретения имеют множество применений. Во-первых, они могут быть использованы для идентификации организма как являющегося Corynebacterium glutamicum или близкородственным ему организмом. Они могут быть также использованы для идентификации присутствия С. glutamicum или родственного ему организма в смешанной популяции микроорганизмов. Данное изобретение относится к последовательности нуклеиновых кислот ряда генов С. glutamicum; зондированием экстрагированной геномной ДНК культуры уникальной или смешанной популяции микроорганизмов в жестких условиях зондом, охватывающим область гена С. glutamicum, которая является уникальной в отношении этого организма, можно определить, присутствует ли данный организм. Хотя сама бактерия Corynebacterium glutamicum является непатогенной, она является родственной патогенным видам, таким как Corynebacterium diphtheriae. Corynebacterium diphtheriae является возбудителем дифтерии, быстро развивающейся, острой, протекающей с повышением температуры инфекции, которая включает в себя как местную, так и системную патологию. В этом заболевании местное повреждение развивается в верхних дыхательных путях и включает в себя некротическое повреждение эпителиальных клеток; бациллы секретируют токсин, который диссеминируется через это повреждение к дистальным чувствительным тканям тела. Дегенеративные изменения, вызываемые ингибированием белкового синтеза в этих тканях, которые включают в себя сердце, мышцы, периферические нервы, надпочечники, почки, печень и селезенку, приводят к системной патологии этого заболевания. Дифтерия продолжает встречаться с высокой частотой во многих частях света, в том числе в Африке, Азии, Восточной Европе и независимых государствах бывшего Советского Союза. Продолжающиеся эпидемии дифтерии в двух последних районах привели, по меньшей мере, к 5000 случаям со смертельным исходом с 1990 года.
В одном варианте данное изобретение относится к способу идентификации присутствия или активности Corynebacterium diphtheriae в субъекте. Этот способ включает в себя обнаружение одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей данного изобретения (например, последовательностей, приведенных в имеющих нечетные или четные номера SEQ ID NO:, соответственно, в Списке последовательностей) в субъекте, с детектированием посредством этого присутствия или активности Corynebacterium diphtneriae в этом субъекте. С. glutamicum и С. diphtneriae являются родственными бактериями, и многие из молекул нуклеиновых кислот и белковых молекул в С. glutamicum являются гомологичными молекулам нуклеиновых кислот и белковым молекулам Corynebacterium diphtneriae, и, следовательно, могут быть использованы для обнаружения Corynebacterium diphtheriae в субъекте.
Молекулы нуклеиновых кислот и белковые молекулы данного изобретения могут также служить в качестве маркеров для специфических областей генома. Это находит применение не только в картировании генома, но также для функциональных исследований белков С. glutamicum. Например, для идентификации области генома, с которым связывается конкретный связывающий ДНК С. glutamicum белок, геном С. glutamicum можно было бы подвергнуть расщеплению и фрагменты можно было бы инкубировать с ДНК-связывающим белком. Фрагменты, которые связывают этот белок, могут быть дополнительно зондированы молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения, предпочтительно с легко детектируемыми метками; связывание такой молекулы нуклеиновой кислоты с фрагментом генома позволяет определить местоположение этого фрагмента на карте генома С. glutamicum и, при проведении этого много раз с различными ферментами, облегчает быстрое определение последовательности нуклеиновой кислоты, с которой связывается данный белок. Далее, молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть достаточно гомологичными последовательностям родственных видов, так что эти молекулы нуклеиновых кислот могут служить в качестве маркеров для конструирования геномной карты в родственных бактериях, таких как Brevibacterium lactofermentum.
Молекулы нуклеиновых кислот НА данного изобретения применимы также для эволюционных исследований и исследований структуры белков. Процессы, участвующие в адаптации и поддержании гомеостаза, в которых участвуют молекулы данного изобретения, используются в большом разнообразии видов; посредством сравнения последовательностей молекул нуклеиновых кислот данного изобретения с молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими сходные ферменты из других организмов, может оцениваться эволюционное родство этих организмов. Подобным образом, такое сравнение позволяет оценить, какие области этой последовательности являются консервативными, а какие не являются консервативными, что может способствовать определению тех областей этого белка, которые являются незаменимыми для функционирования данного фермента. Этот тип определения является ценным для исследований по конструированию белков и может дать указание на то, какой белок может выносить условия мутагенеза без утраты функции.
Манипулирование молекулами нуклеиновых кислот НА данного изобретения может приводить к получению белков НА, имеющих функциональные различия в сравнении с белками НА дикого типа. Эти белки могут быть улучшены по эффективности или активности, могут присутствовать в более высоких количествах в клетке, чем обычно, или могут иметь уменьшенную эффективность или активность.
Данное изобретение относится к способам для скрининга молекул, которые модулируют активность белка НА, либо посредством взаимодействия с самим этим белком или субстратом или партнером связывания белка НА, либо модуляцией транскрипции или трансляции молекулы нуклеиновой кислоты НА данного изобретения. В таких способах микроорганизм, экспрессирующий один или несколько белков НА данного изобретения, контактируют с одним или несколькими испытуемыми соединениями и оценивают действие каждого тест-соединения на активность или на уровень экспрессии данного белка НА.
Модуляция активности или числа белков НА, участвующих в биосинтезе или перестройках клеточной стенки, может влиять на продуцирование, выход и/или эффективность продуцирования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из клеток С. glutamicum. Например, посредством изменения активности этих белков может быть возможна модуляция структуры или толщины клеточной стенки. Клеточная стенка служит в значительной степени в качестве защитного приспособления против осмотического лизиса и наружных источников повреждения; посредством модификации клеточной стенки может быть возможным увеличение способности С. glutamicum противостоять механическим или сдвиговым стрессам, с которыми этот микроорганизм встречается во время крупномасштабного культивирования в ферментере. Далее, каждая клетка С. glutamicum окружена толстой клеточной стенкой и, следовательно, значительная часть биомассы, присутствующей в крупномасштабной культуре, состоит из материала клеточной стенки. Посредством увеличения скорости, при которой синтезируется клеточная стенка, или посредством активации синтеза клеточной стенки (через генетическое конструирование белков клеточной стенки НА данного изобретения) может быть возможным улучшение скорости роста данного микроорганизма. Подобным образом, посредством уменьшения активности или числа белков, участвующих в разрушения клеточной стенки, или посредством уменьшения репрессии биосинтеза клеточной стенки может быть достигнуто общее увеличение образования клеточной стенки. Повышение числа жизнеспособных клеток С. glutamicum (которое может достигаться любым из предыдущих описанных изменений белков) должно приводить к повышенным числам клеток, продуцирующих желаемый химический продукт тонкого органического синтеза в крупномасштабной культуре ферментера, что должно сделать возможными повышенные выходы или повышенную эффективность продуцирования этих соединений из данной культуры.
Модуляция активности или числа белков НА С. glutamicum, которые участвуют в модификации или разрушении ароматических или алифатических соединений, может также иметь прямое или опосредованное влияние на продуцирование одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из этих клеток. Некоторые продукты модификации или разрушения ароматических или алифатических соединений являются желательными химическими продуктами тонкого органического синтеза (например, органические кислоты или модифицированные ароматические и алифатические соединения); таким образом, модификацией ферментов, которые выполняют эти модификации (например, гидроксилирование, метилирование или изомеризацию) или реакции разрушения, можно повысить выходы этих желательных соединений. Подобным образом, уменьшением активности или числа белков, участвующих в путях, которые дополнительно разрушают модифицированные продукты или продукты распада вышеуказанных реакций, можно улучшать выходы этих химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum в культуре.
Эти ферменты модификации и разрушения ароматических и алифатических соединений сами являются химическими продуктами тонкого органического синтеза. В очищенной форме эти ферменты могут быть использованы для разрушения ароматических и алифатических соединений (например, токсических химических продуктов, таких как продукты нефти), либо для биологической очистки загрязненных участков, для разрушения отходов с использованием продуктов генной инженерии, либо для крупномасштабного и экономично осуществимого продуцирования желаемых модифицированных ароматических или алифатических соединений или продуктов их распада, некоторые из которых могут быть выгодно использованы в качестве источников углерода и энергии для других продуцирующих химические продукты тонкого органического синтеза соединений в культуре (см., например, Faber, К. (1995) Biotransformations in Organic Chemistry, Springer: Berlin и ссылки в этой работе; и Roberts, S.M., ed. (1992-1996) Preparative Biotransformations, Wiley: Chichester и приведенные в этой работе ссылки). Генетическим изменением этих белков таким образом, что их регуляция другими клеточными механизмами ослабляется или устраняется, можно повышать общее число или активность этих белков, улучшая посредством этого не только выход этих химических продуктов тонкого органического синтеза, но также активность этих получаемых белков.
Модификация ферментов, модифицирующих и разрушающих ароматические и алифатические соединения, может иметь также непрямое действие на продуцирование одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза. Многие ароматические и алифатические соединения (такие как соединения, которые могут встречаться в качестве загрязнений в культуральной среде или в качестве отходов клеточного метаболизма) являются токсичными для клеток; посредством модификации и/или разрушения этих соединений, так что они могут быть легко удалены или разрушены, может быть повышена жизнеспособность клеток. Далее, эти ферменты могут модифицировать или разрушать эти соединения таким образом, что полученные продукты могут входить в нормальные пути метаболизма углерода клетки, делая эту клетку способной использовать эти соединения в качестве альтернативных источников углерода или энергии. В ситуациях крупномасштабных культур, когда могут быть ограниченные количества оптимальных источников углерода, эти ферменты относятся к способу, при помощи которого клетки могут продолжать расти и делиться с использованием ароматических или алифатических соединений в качестве питательных веществ. В любом случае, полученное увеличение числа клеток С. glutamicum в культуре, продуцирующей желательный химический продукт тонкого органического синтеза, должно, в свою очередь, приводить к повышенным выходам или повышенной эффективности продуцирования химического продукта (химических продуктов) тонкого органического синтеза.
Модификации в активности или числе белков НА, участвующих в метаболизме неорганических соединений, может также прямо или опосредованно влиять на продуцирование одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum или родственных бактериальных культур. Например, многие желаемые химические продукты тонкого органического синтеза, такие как нуклеиновые кислоты, аминокислоты, кофакторы и витамины (например, тиамин, биотин и липоевая кислота) не могут синтезироваться без неорганических молекул, таких как фосфор, нитрат, сульфат и железо. Белки метаболизма неорганических соединений позволяют клетке получать эти молекулы из разнообразных неорганических соединений и отводить их в различные пути биосинтеза химических продуктов тонкого органического синтеза. Таким образом, посредством повышения активности или числа ферментов, участвующих в метаболизме этих неорганических соединений, можно увеличивать поставку этих возможно лимитирующих неорганических молекул, увеличивая посредством этого продуцирование или эффективность продуцирования различных химических продуктов тонкого органического синтеза из клеток С. glutamicum, содержащих такие измененные белки. Модификация активности или числа ферментов метаболизма неорганических соединений данного изобретения может также сделать С. glutamicum способной к лучшему использованию ограниченных запасов неорганических соединений или к использованию неоптимальных неорганических соединений для синтеза аминокислот, витаминов, кофакторов или нуклеиновых кислот, все из которых являются необходимыми для непрерывного роста и размножения клетки. Посредством улучшения жизнеспособности этих клеток в крупномасштабной культуре число клеток С.glutamicum, продуцирующих один или несколько химических продуктов тонкого органического синтеза в культуре, может также увеличиваться, повышая, в свою очередь, выходы или эффективность продуцирования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза.
Сами ферменты С.glutamicum для общих процессов являются желательными химическими продуктами тонкого органического синтеза. Специфические свойства ферментов (т.е. регио- и стереоспецифичность, среди прочих) делают их полезными катализаторами для химических реакций in vitro. Либо целые клетки С.glutamicum могут инкубироваться с подходящим субстратом, так что желательный продукт продуцируется ферментами в клетке, либо желательные ферменты могут быть сверхпродуцированы и очищены из культур С.glutamicum (или культур родственной бактерии) и затем использованы в реакциях in vitro в промышленных условиях (либо в растворе, либо при иммобилизации на подходящей неподвижной фазе). В любой ситуации, фермент либо может быть природным белком С.glutamicum, либо он может быть мутирован, чтобы иметь измененную активность; типичные промышленные применения для таких ферментов включают в себя применения в качестве катализаторов в химической промышленности (например, для синтетической органической химии), в качестве пищевых добавок, в качестве кормовых компонентов, для технологической переработки фруктов, для обработки кожи, в детергентах, в анализе и медицине и в текстильной промышленности (см., например, Yamada, H. (1993) «Microbial reactions for the production of useful organic compounds,» Chimica 47: 5-10; Roberts, S.M. (1998) «Preparative biotransformations: the employment of enzymes and whole-cells in synthetic chemistry», J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 157-169; Zaks, A. and Dodds, D.R. (1997) «Applications of biocatalysis and biotransformations to the synthesis of pharmaceuticals», DDT2: 513-531; Roberts, S.M. and Williamson, N.M. (1997) «The use of enzymes for the preparations of biologically active natural products and analogues in optically active form», Curr. Organ. Chemistry 1: 1-20; Faber, К. (1995) Biotransformations in Organic Chemistry, Springer: Berlin; Roberts, S.M., ed. (1992-96) Preparative Biotransformations, Wiley: Chichester; Cheetham, P.S.J. (1995) «The applications of enzymes in industry» in: Handbook of Enzyme Biotechnology, 3rd ed., Wiseman, A., ed., Elis: Horwood, p. 419-552; и Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987), vol. A9, Enzymes, p. 390-457). Таким образом, посредством повышения активности или числа этих ферментов можно увеличивать также способность клетки превращать подаваемые субстраты в желаемые продукты или сверхпродуцировать эти ферменты для повышения выходов в крупномасштабной культуре. Далее, посредством мутагенизации этих белков можно удалять ингибирование по типу обратной связи или другие репрессивные клеточные регуляторные контроли, так что более высокие количества этих ферментов могут продуцироваться и активироваться клеткой, приводя посредством этого к более высоким выходам, более высоким продуцированию или эффективности продуцирования этих белков, являющихся химическими продуктами тонкого органического синтеза из крупномасштабных культур. Кроме того, манипулирование этими ферментами может изменять активность одного или нескольких метаболических путей С. glutamicum, например, путей биосинтеза или секреции одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза.
Мутагенез протеолитических ферментов данного изобретения таким образом, что они изменяются по активности или в числе, может также прямо или косвенно влиять на выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования одного или нескольких химических продуктов тонкого органического синтеза из С. glutamicum. Например, посредством увеличения активности или числа этих белков можно повысить способность бактерии выживать в крупномасштабной культуре вследствие повышенной способности данной клетки быстро разрушать белки, имеющие неправильную укладку, в ответ на высокие температуры, неоптимальный рН и другие стрессы, встречающиеся во время культивирования в ферментере. Повышенные количества клеток в этих культурах могут приводить к повышенным выходам или эффективности продуцирования одного или нескольких желаемых химических продуктов тонкого органического синтеза вследствие относительно более высокого числа клеток, продуцирующих эти соединения в культуре. Клетки С. glutamicum имеют также множественные протеазы на поверхности клеток, которые служат для разрушения питательных веществ на молекулы, которые могут легко включаться клетками в качестве источников углерода/энергии или питательных веществ другого типа. Повышение активности и числа этих ферментов может улучшать этот круговорот и повышать уровни доступных питательных веществ, улучшая посредством этого рост или продуктивность клеток. Таким образом, модификации протеаз данного изобретения могут косвенно влиять на продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза С. glutamicum.
Более прямое влияние на продуцирование химических продуктов тонкого органического синтеза в ответ на модификацию одной или нескольких протеаз данного изобретения может иметь место, когда эти протеазы участвуют в продуцировании или разрушении желаемого химического продукта тонкого органического синтеза. Посредством снижения активности протеазы, которая разрушает химический продукт тонкого органического синтеза или белок, участвующий в синтезе химического продукта тонкого органического синтеза, можно повышать содержания этого химического продукта тонкого органического синтеза (вследствие пониженного разрушения или повышенного синтеза этого соединения). Подобным образом, посредством повышения активности протеазы, которая участвует в разрушении химического продукта тонкого органического синтеза, должен достигаться такой же результат: повышенные содержания желательного химического продукта тонкого органического синтеза из клеток С. glutamicum, содержащих указанные выше сконструированные белки.
Вышеупомянутый список стратегий для белков НА с целью производства повышенных выходов химического продукта тонкого органического синтеза не является ограничивающим; вариации в этих стратегиях будут вполне очевидными для среднего специалиста в данной области. При помощи таких стратегий и с использованием описанных здесь механизмов молекулы нуклеиновых кислот и белков данного изобретения могут быть использованы для генерирования С. glutamicum или родственных штаммов бактерий, экспрессирующих мутированные молекулы нуклеиновых кислот и белков НА, так что выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования желаемого соединения улучшается. Это желаемое соединение может быть любым продуктом, продуцируемым С. glutamicum, который включает в себя конечные продукты путей биосинтеза и промежуточные продукты природных метаболических путей, а также молекулы, которые не встречаются в природе в метаболизме С. glutamicum, но которые продуцируются штаммом С. glutamicum данного изобретения.
Данное изобретение иллюстрируется далее следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие. Содержания всех ссылок, заявок на патенты, патентов, опубликованных патентных заявок, таблиц и Списка последовательностей, указанные в данной заявке, включены здесь в качестве ссылки.
Иллюстрация примерами
Пример 1: Получение общей геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Культуру Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) выращивали в течение ночи при 30°С с сильным встряхиванием в среде BHI (Difco). Клетки собирали центрифугированием, супернатант выбрасывали и клетки ресуспендировали в 5 мл буфера-1 (5% исходного объема культуры - все указанные объемы рассчитывали для 100 мл объема культуры). Состав буфера-1: 140,34 г/л сахарозы, 2,46 г/л MgSO4 × 7H2O, 10 мл/л раствор KH2PO4 (100 г/л, доведенный до рН 6,7 КОН), 50 мл/л концентрата М12 (10 г/л (NH4)2SO4, 1 г/л NaCl, 2 г/л MgSO4 × 7Н2О, 0,2 г/л CaCl2, 0,5 г/л дрожжевого экстракта (Difco), 10 мл/л смеси микроэлементов (200 мг/л FeSO4 × H2O, 10 мг/л ZnSO4 × 7H20, 3 мг/л MnCl2 × 4H2O, 30 мг/л Н3ВО3, 20 мг/л CoCl2 × 6Н2О, 1 мг/л NiCl2 × 6H2O, 3 мг/л Na2MoO4 × 2H2O, 500 мг/л комплексообразующего агента (ЭДТА или лимонная кислота), 100 мл/л смеси витаминов (0,2 мг/л биотина, 0,2 мг/л фолиевой кислоты, 20 мг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мг/л рибофлавина, 40 мг/л Са-пантотената, 140 мг/л никотиновой кислоты, 40 мг/л пиридоксолгидрохлорида, 200 мг/л миоинозита). К этой суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 2,5 мг/мл. После приблизительно 4 часов инкубации при 37°С клеточную стенку разрушали и полученные протопласты собирали центрифугированием. Осадок промывали один раз 5 мл буфера-1 и один раз 5 мл ТЭ-буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8). Осадок ресуспендировали в 4 мл ТЭ-буфера и добавляли 0,5 мл раствора ДСН (10%) и 0,5 мл раствора NaCl, (5 М). После добавления протеиназы К до конечной концентрации 200 мкг/мл суспензию инкубировали в течение приблизительно 18 часов при 37°С. ДНК очищали экстракцией фенолом, смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт и смесью хлороформ-изоамиловый спирт с использованием обычных процедур. Затем ДНК осаждали добавлением 1/50 объема 3 М ацетата натрия и 2 объемов этанола с последующими 30-минутной инкубацией при -20°С и 30-минутным центрифугированием при 12000 об/мин в высокоскоростной центрифуге с использованием ротора SS34 (Sorval). ДНК растворяли в 1 мл ТЭ-буфера, содержащего 20 мкг/мл РНКазы А, и диализовали при 4°С против 1000 мл ТЭ-буфера в течение, по меньшей мере, 3 часов. Во время этого периода времени буфер заменяли 3 раза. К аликвотам 0,4 мл диализованного раствора ДНК добавляли 0,4 мл 2 М LiCl и 0,8 мл этанола. После 30 мин инкубации при -20°С ДНК собирали центрифугированием (13000 об/мин, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Germany). Осадок ДНК растворяли в ТЭ-буфере. ДНК, полученную этой процедурой, можно было использовать для всех целей, в том числе для блоттинга по Саузерну или конструирования геномных библиотек.
Пример 2: Конструирование геномных библиотек Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 в Escherichia coli
С использованием ДНК, полученной, как описано в примере 1, космидные и плазмидные библиотеки конструировали в соответствии с известными и хорошо установленными способами (см., например, Sambrook et al. (1989) «Molecular Cloning. A Laboratory Manual», Cold Spring Harbor Laboratory Press или Ausubel, F.M. et al. (1994) «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley and Sons).
Можно использовать любую плазмиду или космиду. Особенно применимыми были плазмиды pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3737-3741); pACYC177 (Change and Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156), плазмиды ряда pBS (pBSSK+, pBSSK- и другие; Stratagene, La Jolla, USA) или космиды в виде SuperCosl (Stratagene, La Jolla, USA) или Lorist6 (Gibson, T.J., Rosenthal A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53:283-286. Библиотеки генов специально для применения в С. glutamicum могут быть сконструированы с использованием плазмиды pSL109 (Lee, H.-S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4: 256-263).
Пример 3: Секвенирование и вычислительный функциональный анализ ДНК
Геномные библиотеки, описанные в примере 2, использовали для секвенирования ДНК в соответствии со стандартными способами, в частности, при помощи способа терминации цепи с использованием установки для секвенирования ABI377 (см., например, Fleischman, R.D. et al., (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science, 269:496-512). Использовали следующие секвенирующие праймеры: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' (SEQ ID NO: 441) или 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NO:442).
Пример 4: Мутагенез in vivo
Мутагенез in vivo Corynebacterium glutamicum может проводиться пассажем ДНК плазмиды (или другого вектора) через Е. coli или другие микроорганизмы (например. Bacillus spp. или дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae), у которых была нарушена их способность поддерживать целостность их генетической информации. Типичные мутированные штаммы имеют мутации в генах для системы репарации ДНК (например, mutHLS, mutD, mutT, и т.д.; в отношении ссылки см. Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM, Washington). Такие штаммы хорошо известны среднему специалисту в данной области. Применение таких штаммов иллюстрируется, например, в Greener, A. and Callahan, М. (1994) Strategies 7: 32-34.
Пример 5: Перенос ДНК между Escherichia coli и Corynebacterium glutamicum
Некоторые виды Corynebacterium и Brevibacterium содержат эндогенные плазмиды (например, рНМ1519 или pBLl), которые реплицируются автономно (в отношении обзора см, например, Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146). Челночные векторы для Escherichia coil и Corynebacterium glutamicum могут быть легко сконструированы с использованием стандартных векторов для Е. coli (Sambrook J. et al. (1989) «Molecular Cloning. A Laboratory Manual», Cold Spring Harbor Laboratory Press или Ausubel, F.M. et al. (1994) «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley and Sons), к которым добавляют сайт инициации репликации (ориджин) и подходящий маркер из Corynebacterium glutamicum. Такие сайты инициации репликации предпочтительно берутся из эндогенных плазмид, выделенных из видов Corynebacterium и Brevibacterium. Особенно применимы в качестве маркеров трансформации для этих видов гены устойчивости к канамицину (такие, как полученные из транспозонов Тn5 или Тn903) или к хлорамфениколу (Winnacker, E.L. (1987) «From Genes to Clones Introduction to Gene Technology», VCH, Weinheim). В литературе имеются многочисленные примеры конструирования большого разнообразия челночных векторов, которые реплицируются как в Е. coli, так и в С. glutamicum и которые могут быть использованы для нескольких целей, в том числе для сверхэкспрессии генов (в отношении ссылки см., например, Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146 и Eikmanns, B.J. et al. (1991) Gene, 102:93-98).
С использованием стандартных способов можно клонировать представляющий интерес ген в один из описанных выше челночных векторов и вводить такие гибридные векторы в штаммы Corynebacterium glutamicum. Трансформация С. glutamicum может быть достигнута трансформацией протопластов (Kastsumata, R. et al. (1984) J. Bacteriol. 159306-311), электропорацией (Liebl, E. et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53:399-403) и в случаях, когда используют специальные векторы, также конъюгацией (как описано, например, в Schafer, A. et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 1662-1666). Можно также переносить челночные векторы для С. glutamicum в Е. coli получением плазмидной ДНК из С. glutamicum (с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области) и трансформацией ее в Е. coli. Эту стадию трансформации можно проводить с использованием стандартных способов, но предпочтительно использовать Mcr-недостаточный штамм Е. coli, такой как NM522 (Gough and Murray (1983) J. Mol. Biol. 166:1-19).
Гены могут быть сверхэкспрессированы в штаммах С. glutamicum с использованием плазмид, содержащих pCGl (патент США № 4 617 267) или ее фрагменты, и необязательно ген устойчивости к канамицину из TN903 (Grindley, N.D. and Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12): 7176-7180). Кроме того, гены могут быть сверхэкспрессированы в штаммах С. glutamicum с использованием плазмиды pSL109 (Lee, H.-S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4: 256-263).
Помимо применения реплицирующихся плазмид, сверхэкспрессия генов может быть также достигнута интеграцией их в геном. Геномная интеграция в С. glutamicum или других видах Corynebacterium или Brevibacterium может выполняться хорошо известными способами, такими как гомологичная рекомбинация с областью (областями) генома, опосредованная рестрикционными эндонуклеазами интеграция (REMI) (см., например, DE Patent 19823834), или посредством применения транспозонов. Можно также модулировать активность представляющего интерес гена модификацией регуляторных областей (например, промотора, репрессора и/или энхансера) посредством модификации последовательности, инсерцией или делецией с использованием сайт-направленных способов (таких как гомологичная рекомбинация) или способов на основе случайных событий (таких как транспозонный мутагенез или REMI). Последовательности нуклеиновых кислот, которые функционируют как терминаторы транскрипции, могут быть также вставлены 3' (справа) от кодирующей области одного или нескольких генов данного изобретения; такие терминаторы хорошо известны в данной области и описаны, например, в Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology", VCH, Weinheim.
Пример 6: Оценка экспрессии мутантного белка
Наблюдения активности мутированного белка в трансформированной клетке-хозяине основываются на том факте, что мутантный белок экспрессируется сходным образом и в сходном количестве в сравнении с белком дикого типа. Применимым способом для определения уровня транскрипции мутантного гена (индикатора количества мРНК, доступного для трансляции генного продукта) является проведение Нозерн-блоттинга (в отношении ссылки см., например, Ausubel, F.M. et al. (1994) «Current Protocols in Molecular Biology», Wiley; New York), в котором праймер, сконструированный для связывания с представляющим интерес геном, метят детектируемой меткой (обычно радиоактивной или хемилюминесцентной), так что при экстракции общей РНК культуры организма, подвергании ее электрофорезу на геле, переносе на стабильный матрикс и инкубировании с этим зондом связывание и количество связывания этого зонда указывает на присутствие, а также показывает количество мРНК для этого гена. Эта информация показывает степень транскрипции мутантного гена. Общая клеточная РНК может быть получена из Corynebacterium glutamicum при помощи нескольких способов, которые хорошо известны в данной области, например, описанных в Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
Для оценки присутствия или относительного количества белка, транслируемого из этой мРНК, могут быть использованы стандартные способы, такие как Вестерн-блоттинг (см., например, Ausubel, F.M. et al. (1994) «Current Protocols in Molecular Biology», Wiley: New York). В этом способе экстрагируют общие клеточные белки, разделяют их гель-электрофорезом, переносят на матрикс, такой как нитроцеллюлоза, и инкубируют с зондом, таким как антитело, которое специфически связывается с желаемым белком. Этот зонд обычно является меченым хемилюминесцентной или колориметрической меткой, которая может легко детектироваться. Присутствие и количество наблюдаемой метки показывает присутствие и количество желаемого мутантного белка, присутствующего в данной клетке.
Пример 7: Культивирование генетически модифицированного Corynebacterium glutamicum - среды и условия культуры
Генетически модифицированные Corynebacteria культивируют в синтетических или природных средах для выращивания. Ряд различных сред для выращивания для Corynebacteria являются как хорошо известными, так и легко доступными (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag). Эти среды состоят из одного или нескольких источников углерода, источников азота, неорганических солей, витаминов и микроэлементов. Предпочтительными источниками углерода являются сахара, такие как моно-, ди- или полисахариды. Например, очень хорошими источниками углерода являются глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза, рибоза, сорбоза, рибулоза, лактоза, мальтоза, сахароза, рафиноза, крахмал или целлюлоза. Сахар можно также предоставлять в среду через комплексные соединения, такие как мелассы или другие побочные продукты очистки сахаров. Предпочтительно, можно также предоставлять смеси различных источников углерода. Другими возможными источниками углерода являются спирты и органические кислоты, такие как метанол, этанол, уксусная кислота или молочная кислота. Источниками азота обычно являются органические или неорганические соединения азота или материалы, содержащие эти соединения. Примеры источников азота включают в себя газообразный аммиак или аммониевые соли, такие как NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4OH, нитраты, мочевина, аминокислоты или комплексные источники азота, такие как жидкий кукурузный экстракт, соевая мука, соевый белок, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и другие.
Соединения, являющиеся неорганическими солями, которые могут быть включены в эти среды, включают в себя хлоридные, фосфористые или сульфатные соли кальция, магния, натрия, кобальта, молибдена, калия, марганца, цинка, меди и железа. Хелатообразующие соединения могут быть добавлены к среде для поддержания ионов металлов в растворе. Особенно применимые хелатообразующие соединения включают в себя дигидроксифенолы, такие как катехин или прокатехуат, или органические кислоты, такие как лимонная кислота. Для этих сред является типичным, что они содержат другие факторы роста, такие как витамины или стимуляторы роста, примеры которых включают в себя биотин, рибофлавин, тиамин, фолиевую кислоту, никотиновую кислоту, пантотенат и пиридоксин. Факторы роста и соли часто происходят из комплексных компонентов для сред, таких как дрожжевой экстракт, мелассы, жидкий кукурузный экстракт и другие. Точный состав соединений сред сильно зависит от конкретного эксперимента и решение о составе принимается для каждого особого случая. Информация об оптимизации сред доступна в руководстве "Applied Microbiol. Physiology. A Practical Approach (eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Возможен также выбор сред для выращивания от коммерческих поставщиков, таких как стандарт 1 (Merck) или BHI (инфузионный раствор для мозга и сердца, Difco) или другие.
Все компоненты среды стерилизуют либо нагреванием (20 мин при 1,5 бар и 121°С), либо стерильным фильтрованием. Эти компоненты могут стерилизоваться в начале культивирования или они могут необязательно добавляться непрерывно или периодически.
Условия культивирования определяют отдельно для каждого эксперимента. Температура должна быть в диапазоне между 15°С и 45°С. Температура может поддерживаться на постоянном уровне или может меняться во время эксперимента. рН среды должен быть в диапазоне 5-8,5, предпочтительно около 7,0, и может поддерживаться добавлением буферов к средам. Примером буфера для этой цели является калий-фосфатный буфер. Альтернативно или одновременно могут быть использованы синтетические буферы, такие как MOPS, HEPES, ACES и другие. Можно также поддерживать постоянный рН культуры добавлением NaOH или NH4OH во время культивирования. При использовании комплексных компонентов среды, таких как дрожжевой экстракт, необходимость в дополнительных буферах может уменьшаться вследствие того факта, что многие соединения комплекса имеют высокие буферные способности. При использовании ферментера для культивирования микроорганизмов рН может регулироваться при помощи газообразного аммиака.
Время инкубации обычно находится в диапазоне от нескольких часов до нескольких дней. Это время выбрано для производства возможности накопления максимального количества продукта в бульоне. Описанные эксперименты с культивированием могут проводиться в различных сосудах, таких как микротитрационные планшеты, стеклянные пробирки, стеклянные колбы или металлические ферментеры разных размеров. Для скрининга большого количества клонов микроорганизмы должны культивироваться в микротитрационных планшетах, стеклянных пробирках или встряхиваемых колбах с перегородками или без перегородок. Предпочтительно, используют встряхиваемые колбы на 100 мл, заполненные 10% (по объему) требующейся среды для выращивания. Колбы должны встряхиваться на ротационном шейкере (амплитуда 25 мм) с использованием диапазона скоростей 100-300 об/мин. Потери, связанные с испарением, могут быть уменьшены поддержанием влажной атмосферы; альтернативно должна проводиться математическая коррекция на потери от испарения.
При испытании генетически модифицированных клонов должен также испытываться немодифицированный клон или контрольный клон, содержащий основную плазмиду без какого-либо инсерта. Среду инокулируют до OD600 0,5-1,5 с использованием клеток, выращенных на чашках с агаром, таких как СМ-чашки (10 г/л глюкозы, 2,5 г/л NaCl, 2 г/л мочевины, 10 г/л полипептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л мясного экстракта, 22 г/л агара, рН 6,8 с 2М NaOH), которые инкубировали при 30°С. Инокуляцию сред выполняют либо введением суспензии клеток С. glutamicum в солевом растворе из СМ-чашек, либо добавлением жидкой предварительной культуры этой бактерии.
Пример 8 - Анализ in vitro функции мутантных белков
Определение активностей и кинетических параметров ферментов является хорошо разработанным в данной области. Эксперименты для определения активности любого конкретного измененного фермента должны выполняться относительно удельной активности фермента дикого типа, что находится вполне в рамках способностей среднего специалиста в данной области. Обзоры по ферментам вообще, а также конкретные детали, касающиеся структуры, кинетики, принципов, способов, применений и примеров для определения активностей многих ферментов могут быть найдены в следующих ссылках: Dixon, М. and Webb, E.C., (1979) Enzymes, Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology, Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2nd ed. VCH: Weinheim (IBSN 35273025); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassi, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; и Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, «Enzymes», VCH: Weinheim, p. 352-363.
Активность белков, которые связываются с ДНК, может быть измерена несколькими установленными способами, такими как анализы смещения полос ДНК (также называемые гель-ретардационными анализами (анализами замедления миграции в геле)). Действие таких белков на экспрессию других молекул может быть измерено с использованием анализов с репортерными генами (например, описанными в Kolmar, H. et al. (1995) ЕМВО J. 14: 3895-3904 и указанных в этой работе ссылках). Тест-системы с репортерными генами хорошо известны и разработаны для применений как в прокариотических, так и эукариотических клетках, с использованием ферментов, таких как бета-галактозидаза, зеленый флуоресцентный белок и некоторые другие.
Определение активности белков мембранного транспорта может проводиться в соответствии со способами, такими как способы, описанные в Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, p. 85-137; 199-234 и 270-322.
Пример 9: Анализ влияния мутантных белков на продуцирование желаемого продукта
Влияние генетической модификации в С. glutamicum на продуцирование желаемого соединения (такого как аминокислота) может быть оценено культивированием модифицированного микроорганизма при подходящих условиях (таких как условия, описанные выше) и анализом среды и/или клеточного компонента на увеличенное продуцирование желаемого продукта (т.е. аминокислоты). Такие способы анализа являются хорошо известными среднему специалисту в данной области и включают в себя спектроскопию, тонкослойную хроматографию, способы окрашивания разного рода, ферментативные и микробиологические способы и аналитическую хроматографию, например, высокоэффективную жидкостную хроматографию (см., например, Ullmann, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 89-90 и р. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. et al., (1987) «Applications of HPLC in Biochemistry» in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: «Product recovery and purification», page 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim; и Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Кроме измерения конечного продукта ферментации, можно также анализировать другие компоненты метаболических путей, используемых для образования желаемого соединения, такие как промежуточные продукты и побочные продукты, для определения общего продуцирования данного соединения. Способы анализа включают в себя измерения уровней питательных веществ в среде (например, сахаров, углеводородов, источников азота, фосфата и других ионов), измерения состава биомассы и роста, анализ продуцирования обычных метаболитов биосинтетических путей и измерение газов, продуцируемых во время ферментации. Стандартные способы для этих измерений описаны в "Applied Microbiol. Physiology. A Practical Approach (eds. P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Press p. 103-129; и 165-192 (ISBN 0 199635773).
Пример 10: Очистка желаемого продукта из культуры С. glutamicum
Извлечение желаемого продукта из клеток С. glutamicum или супернатанта описанной выше культуры может быть выполнено различными способами, хорошо известными в данной области. Если желаемый продукт не секретируется из клеток, клетки могут быть собраны из культуры низкоскоростным центрифугированием, эти клетки могут быть лизированы стандартными способами, такими как механические способы или обработка ультразвуком. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием, а фракцию супернатанта, содержащую растворимые белки, сохраняют для последующей очистки желаемого соединения. Если продукт секретируется из клеток С. glutamicum, то эти клетки удаляют из культуры низкоскоростным центрифугированием, а фракцию супернатанта сохраняют для последующей очистки.
Фракцию супернатанта из любого способа очистки подвергают хроматографии с подходящей смолой, в которой либо желаемая молекула удерживается на хроматографической смоле, тогда как примеси в пробе не удерживаются, либо примеси удерживаются этой смолой, тогда как проба не удерживается. Такие стадии хроматографии могут быть повторены, если требуется, с использованием той же самой смолы или отличающихся смол. Средний специалист в данной области должен быть вполне сведущим в выборе подходящих хроматографических смол и в их наиболее эффективном применении для конкретной подлежащей очистке молекулы. Очищенный продукт может быть сконцентрирован фильтрованием или ультрафильтрацией и может храниться при температуре, при которой стабильность этого продукта является максимизированной.
Имеется большое число способов очистки, известных в данной области, и предыдущий способ очистки не должен рассматриваться как ограничивающий изобретение. Такие способы очистки описаны, например, в Bailey, J.E. and Oilis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
Идентичность и чистота выделенных соединений может оцениваться способами, стандартными в данной области. Они включают в себя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), спектроскопические способы, способы с окрашиванием, тонкослойную хроматографию, NIRS, ферментативный анализ или микробиологические способы. Такие способы анализа рассматриваются в Patek et al. (1994) App. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32 и Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer, 19: 67-70, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p.89-90, p.521-540, p. 540-547, р.559-566, 575-581 и р.581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al.(1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.
Пример 11: Анализ последовательностей генов изобретения
Сравнение последовательностей и определение процентной гомологии между двумя последовательностями являются известными в данной области способами и могут быть выполнены с использованием математического алгоритма, такого как алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, модифицированный, как описано в Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST (версию 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST-поиски нуклеотидов могут выполняться с программой NBLAST, оценка = 100, длина слова = 12, для производства нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот НА данного изобретения. BLAST-поиски белков могут выполняться с программой XBLAST, оценка = 50, длина слова = 3, для производства аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка НА данного изобретения. Для получения имеющих пропуски выравниваний для целей сравнения может быть использована программа Gapped BLAST, описанная в Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST средний специалист в данной области будет знать, как оптимизировать параметры этой программы (например, XBLAST и NBLAST) для конкретной анализируемой последовательности.
Другим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Meyers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17). Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версию 2.0), которая является частью GCG-пакета программ выравнивания последовательностей. При применении программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей могут быть использованы таблица РАМ120 остатков весовых коэффициентов, штраф за длину пропуска 12 и штраф за пропуск 4. Дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей известны в данной области и включают в себя ADVANCE и ADAM, описанные в Torelli and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; и FASTA, описанную в Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85:2444-8.
Определение процентной гомологии между двумя аминокислотными последовательностями может также выполняться с использованием программы GAP GCG-пакета программ (доступной в http://www.gg.com), использующей либо матрицу Blosum 62, либо матрицу РАМ250 и весовой коэффициент пропуска 12, 10, 8, 6 или 4 и весовой коэффициент длины 2, 3 или 4. Процентная гомология между двумя последовательностями нуклеиновых кислот может быть определена с использованием программы GAP в GCG-пакете программ, с применением стандартных параметров, таких как весовой коэффициент пропуска 50 и весовой коэффициент длины 3.
Сравнительный анализ последовательностей генов данного изобретения с последовательностями, присутствующими в Genbank, выполняли с использованием способов, известных в данной области (см., например, Bexevanis and Oullette, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons: New York). Последовательности генов данного изобретения сравнивали с генами, присутствующими в Genbank, в трехстадийном процессе. В первой стадии выполняли анализ BLASTN (например, локальный анализ выравнивания) для каждой из последовательностей данного изобретения против нуклеотидных последовательностей, присутствующих в Genbank, и высшие 500 совпадений сохраняли для дальнейшего анализа. Последующий поиск FASTA (например, объединенный локальный и глобальный анализ выравнивания, в котором выравнивали лимитированные области этих последовательностей) проводили на этих 500 выравниваниях. Каждую последовательность гена данного изобретения затем сопоставляли глобально с каждым из наивысших трех совпадений FASTA с использованием программы GAP в GCG-пакете программ (с использованием стандартных параметров). Для получения точных результатов длину последовательностей, извлеченных из Genbank, корректировали относительно длины запрашиваемых (query) последовательностей при помощи способов, хорошо известных в данной области. Результаты этого анализа приведены в таблице 4. Полученная информация идентична информации, которая была бы получена, если бы проводили только анализ GAP (глобальный) на каждом из генов данного изобретения в сравнении с каждой из ссылочных последовательностей в Genbank, но требовалось значительно уменьшенное время вычисления в сравнении со временем вычисления анализа GAP (глобального) с широкой базой данных. Последовательности данного изобретения, для которых не получали выравниваний выше величин отсечения, показаны в таблице 4 отсутствием информации выравнивания. Кроме того, среднему специалисту в данной области будет понятно, что проценты гомологии выравнивания GAP, приведенные в таблице 4 под заголовком «%-ная гомология (GAP)», перечислены в Европейском цифровом формате, где «,» (запятая) обозначает десятичную точку. Например, величина «40,345» в этом столбце обозначает именно «40,345%».
Пример 12: Конструирование и эксплуатация микроматриц ДНК
Последовательности данного изобретения могут быть дополнительно использованы в конструировании и применении микроматриц ДНК (конструирование, методология и применения матриц ДНК хорошо известны в данной области и описаны, например, в Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470, Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 1359-1367; DeSaizieu, A. et al. (1998) Nature Biotechnology 16: 45-48 и DaRisi, J.L. et al. (1997) Science 278: 680-686).
Микроматрицы ДНК являются твердыми или гибкими подложками, состоящими из нитроцеллюлозы, стекла, силикона или других материалов. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть присоединены к поверхности упорядоченным образом. После подходящего мечения другие нуклеиновые кислоты или смеси нуклеиновых кислот могут быть гибридизованы с иммобилизованными молекулами нуклеиновых кислот, и метка может быть использована для мониторинга и измерения индивидуальных интенсивностей сигнала гибридизованных молекул в определенных областях. Эта методология позволяет одновременное определение относительного или абсолютного количества всех или выбранных нуклеиновых кислот в нанесенной пробе или смеси нуклеиновых кислот. Таким образом, микроматрицы ДНК позволяют проводить анализ экспрессии множественных (до 6800 или более) нуклеиновых кислот параллельно (см., например, Schena, M. (1996) BioEssays 18 (5): 427-431).
Последовательности данного изобретения могут быть использованы для конструирования олигонуклеотидных праймеров, которые способны амплифицировать определенные области одного или нескольких генов С. glutamicum посредством реакции амплификации нуклеиновых кислот, такой как полимеразная цепная реакция. Выбор и конструирование 5'- или 3'-олигонуклеотидных ПЦР-праймеров или подходящих линкеров делают возможным ковалентное присоединение полученных ПЦР-продуктов к поверхности среды-носителя, описанной выше (и описанной также, например, Schena, M. (1995) Science 270: 467-470).
Микроматрицы нуклеиновых кислот могут быть также сконструированы синтезом олигонуклеотидов in situ, как описано Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 1359-1367. При помощи фотолитографических способов точно определенные области матрицы экспонируются свету. Защитные группы, которые являются фотолабильными, активируются посредством этого и подвергаются добавлению нуклеотидов, тогда как области, которые маскированы от света, не подвергаются никакой модификации. Последующие циклы защиты и активации светом делают возможным синтез различных олигонуклеотидов в определенных положениях. Небольшие, определенные области генов данного изобретения могут быть синтезированы на микроматрицах посредством твердофазного синтеза олигонуклеотидов.
Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения, присутствующие в пробе или смеси нуклеотидов, могут быть гибридизованы с микроматрицами. Эти молекулы нуклеиновых кислот могут быть помечены в соответствии со стандартными способами. Вкратце, молекулы нуклеиновых кислот (например, молекулы мРНК или молекулы ДНК) метят включением изотопно или флуоресцентно меченых нуклеотидов, например, во время обратной транскрипции или синтеза ДНК. Гибридизация меченых нуклеиновых кислот с микроматрицами описана (например, в Schena, M. et al. (1995) supra; Wodicka, L. et al. (1997) supra и DeSaizieu, A. et al. (1998) supra). Детектирование и количественное определение гибридизованной молекулы выполняются в соответствии со специфической включенной меткой. Радиоактивные метки могут быть детектированы, например, как описано в Schena, M. et al. (1995 supra), a флуоресцентные метки могут быть детектированы, например, по способу Shalon et al. (1996) Genome Research 6: 639-645).
Применение последовательностей данного изобретения к технологии микроматриц ДНК, как описано выше, делает возможным сравнительный анализ различных штаммов С. glutamicum или других Corynebacteria. Например, исследования вариаций между штаммами на основе профилей индивидуальных транскриптов и идентификация генов, которые являются важными для специфических и/или желательных свойств штаммов, таких как патогенность, продуктивность и устойчивость к стрессам, облегчаются методологиями микроматриц нуклеиновых кислот. Сравнения профиля экспрессии генов данного изобретения в ходе реакции ферментации также являются возможными с использованием технологии матриц нуклеиновых кислот.
Пример 13: Анализ динамики популяций клеточных белков (протеомики).
Гены, композиции и способы данного изобретения могут применяться для исследования взаимодействий и динамики популяций белков, называемой «протеомикой». Представляющие интерес популяции белков включают в себя, но не ограничиваются ими, общую популяцию белков С. glutamicum (например, в сравнении с популяциями белков других организмов), белки, которые являются активными при специфических условиях окружающей среды или метаболических условиях (например, во время ферментации, при высокой или низкой температуре или при высоком или низком рН), или другие белки, которые являются активными во время конкретных фаз роста и развития.
Популяции белков можно анализировать разнообразными хорошо известными способами, такими как гель-электрофорез. Клеточные белки могут быть получены, например, лизисом или экстракцией, и могут быть отделены друг от друга с использованием различных электрофоретических способов. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (электрофорез в ДСН-ПААГ) разделяет белки в значительной степени на основе их молекулярной массы. Электрофорез в полиакриламидном геле с иэоэлектрическим фокусированием (ИЭФ-электрофорез в ПАДГ) разделяет белки по их изоэлектрической точке (которая отражает не только аминокислотную последовательность, но также посттрансляционные модификации данного белка). Другим, более предпочтительным способом анализа белков является последовательная комбинация ИЭФ-электрофореза в ПААГ и электрофореза в ДСН-ПААГ, известная как 2-D-гель-электрофорез (описанная, например, в Hermann et al. (1998) Electrophoresis 19: 3217-3221; Fountoulakis et al. (1998) Electrophoresis 19: 1193-1202; Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192; Antelmann et al. (1997) Electrophoresis 18: 1451-1463). Другие способы разделения могут быть также использованы для разделения белков, такие как капиллярный гель-электрофорез; подобные способы хорошо известны в данной области.
Белки, разделенные с использованием этих методологий, могут быть визуализированы стандартными способами, такими как окрашивание или мечение. Подходящие красители известны в данной области и включают в себя Кумасси бриллиантовый синий, содержащий серебро краситель (серебряный краситель) или флуоресцентные красители, такие как Sypro Ruby (Molecular Probes). Включение радиоактивно меченых аминокислот или других белковых предшественников (например, 35C-метионина, 35S-цистеина, 14C-меченых аминокислот, 15N-аминокислот, 15NO3 или 15NH4 + или 13С-меченых аминокислот) в среду С. glutamicum позволяет проводить мечение белков из этих клеток перед их разделением. Подобным образом могут быть использованы флуоресцентные метки. Меченые белки могут быть экстрагированы, выделены и разделены в соответствии с описанными ранее способами.
Белки, визуализированные этими способами, можно дополнительно анализировать посредством измерения количества используемых красителя или метки. Количество конкретного белка может сравниваться с количеством других белков в том же самом геле или в других гелях. Сравнения белков на гелях могут производиться, например, оптическим сравнением, спектроскопией, сканированием изображений и анализом гелей или посредством применения фотографических пленок и экранов. Такие способы хорошо известны в данной области.
Для определения идентичности любого конкретного белка могут быть использованы прямое секвенирование или другие стандартные способы. Например, может быть использовано секвенирование N- и/или С-концевых аминокислот (например, разрушение Эдмана), а также масс-спектрометрия (в конкретных способах MALDI или ESI (см., например, Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192)). Белковые последовательности, обеспеченные здесь, могут быть использованы для идентификации белков С. glutamicum при помощи этих способов.
Информация, полученная этими способами, может быть использована для сравнения распределений (паттернов) присутствия белков, активности или модификации между различными пробами из различных биологических условий (например, различных организмов, временных точек ферментации, условий сред или различных биотопов, среди прочих). Данные, полученные только из таких экспериментов, или в комбинации с другими способами, могут быть использованы для различных применений, например, для сравнения поведения различных организмов в конкретной (например, метаболической) ситуации, для повышения продуктивности штаммов, которые продуцируют химические продукты тонкого органического синтеза, или для увеличения эффективности продуцирования химических продуктов тонкого органического синтеза.
Эквиваленты
Среднему специалисту в данной области будут очевидны многие эквиваленты или они будут способны получить с использованием небольшего труда, чем этого требует рутинное экспериментирование, многочисленные эквиваленты относительно конкретных вариантов описанного здесь изобретения. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенные молекулы нуклеиновой кислоты Corynebacterium glutamicum, которые кодируют полипептид с активностью сульфатаденилаттрансферазы. Изобретение относится также к рекомбинантным экспрессирующим векторам, содержащим такие молекулы нуклеиновых кислот, и клеткам-хозяевам, в которые были введены эти экспрессирующие векторы. Данное изобретение касается также способа получения аминокислот при помощи культивирования указанных клеток. Изобретение позволяет расширить ассортимент ферментов и получать аминокислоты с высокой степенью эффективности. 24 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 табл.
Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium, lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum и штаммов, представленных в таблице 3.
| WO 9309225, 13.05.1993 | |||
| EIKMANNS et | |||
| al | |||
| The phosphenolpyruvate carboxylase gene of Corynebacterium glutamicum molecular cloning, nucleotide sequence and expression MOL GEN GENET., vol.218, 1989, p.330-339 | |||
| 0 |
|
SU401735A1 | |
| ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД С АКТИВНОСТЬЮ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESHCERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ | 1991 |
|
RU2081173C1 |
