ШТАММ БАКТЕРИЙ BURKHOLDERIA THAILANDENSIS КМ 161 - АВИРУЛЕНТНЫЙ ИМИТАТОР ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения авирулентного штамма Burkholderia thailandensis KM 161 - имитатора возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) для проведения учебных занятий по бактериологии и индикации возбудителей особо опасных инфекций, контроля питательных сред, в том числе и селективных, а также учений по ГО (гражданской обороне), на которых в качестве имитаторов для других бактериальных агентов используются известные вакцинные штаммы - Y.pestis EV, F.tularensis 15, B.anthracis СТИ и др. Для В.pseudomallei аналогичные вакцинные штаммы не существуют, в связи с чем на учебных занятиях отсутствует бактериологический раздел работы, так как используется только инактивированная культура возбудителя, с которой можно проводить лишь ограниченное количество исследований, что в конечном итоге снижает качество обучения курсантов.

Целью изобретения является получение штамма из рода Burkholderia, который по своим культуральным, биохимическим и антигенным свойствам способен служить авирулентным имитатором возбудителя мелиоидоза.

Для достижения цели из имевшегося в нашем распоряжении авторского набора культур непатогенных буркхольдерий (всего более 30), выделенных из внешней среды эндемичных по мелиоидозу регионах с помощью селективных сред для В.pseudomallei, отобран штамм В. thailandensis KM 161, который из всех имеющихся в коллекции авирулентных буркхольдерий агглютинируется специфической мелиоидозной сывороткой и по другим фенотипическим признакам обладает наибольшей степенью сходства с В.pseudomallei, но отличается от возбудителя мелиоидоза авирулентностью и способностью ассимилировать L-арабинозу. Данный штамм имеет определенные отличия от В.pseudomallei в последовательностях нуклеотидов секвенированных фрагментов ДНК, что имеет прямое отношение к дополнительной верификации родовой и видовой принадлежности В.thailandensis KM 161.

Выявленный штамм В.thailandensis KM 161 представляет собой подвижные, грамотрицательные, неспороносные палочки, размером 0,5-1,0×2,0-4,0 мкм. Хорошо растет в аэробных условиях на простых питательных средах, которые используют при работе с типичными видами буркхольдерий: мясо-пептонном агаре (бульоне), триптиказо-соевом агаре (бульоне) с добавлением 4-5% глицерина при 37°С и оптимуме рН от 6,8 до 7,2.

На плотных питательных средах через 24 ч роста образует гладкие, круглые, полупрозрачные колонии кремового цвета. На 3-4 с колонии становятся непрозрачными и шероховатыми. На жидких питательных средах образует интенсивную муть с выраженной пленкой на поверхности.

Биохимическая активность В.thailandensis KM 161 и типичного вирулентного штамма В.pseudomallei С-141, проверенная по стандартным методам, предусмотренным для изучения основных родовых и видовых свойств возбудителя мелиоидоза (Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Пивень Н.Н. Идентификация Pseudomonas pseudomallei. Лаб. дело. - 1983. - №7.- С.61-62), у данных микроорганизмов была идентичной.

При подкожном введении морским свинкам 0,5 мл суточной агаровой культуры дозой 1 млрд м.к./мл животные не падали в течение 30 сут (срок наблюдения). В конце опыта животных усыпляли хлороформом, вскрывали и проводили посевы внутренних органов на МПА отпечатками с целью выявления бактериальной обсемененности. Чашки с посевами инкубировали в течение 5 сут при 37°С. Рост микроорганизмов не обнаружен.

Уровень вирулентности штамма B.thailandensis KM 161 сохранялся в течение 2 лет (срок наблюдения) при хранении как в лиофилизированном состоянии при +4°С, так и в полужидком МПА под вазелином.

Данный штамм принят на депонирование 28 ноября 2002 г. В Государственной коллекции патогенных бактерий “Микроб” штамму присвоен номер В.thailandensis KM 161.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Оценка культурально-морфологических свойств B.thailandensis KM 161.

Для культивирования штамма используют общепринятые для экспериментов с бурхольдериями твердые или жидкие питательные среды - на основе мясо-пептонного или триптиказо-соевого бульонов. Селективную среду Эшдауна (Ashdown L.R. Pathology. - 1979. - Vol.11, №2. - P.293-297) готовят на основе триптиказо-соевого агара (ТСА) с добавлением 5 мг/л кристалл виолета, 50 мг/л нейтрального красного и 4 мг/л гентамицина.

Через 24 ч на плотных питательных средах вырастают однородные колонии диаметром 3-5 мм в S-форме, почти бесцветные, со слабым кремовым оттенком, проявляющимся все более по мере старения культуры. На 3-4 с колонии становятся непрозрачными и шероховатыми. На селективной среде Эшдауна - колонии розового цвета, просветление вокруг них не выражено.

При световой микроскопии - грамотрицательные палочки (0,5-3,0 мкм), в “раздавленной” капле - выраженная подвижность бактерий.

Пример 2. Сравнение основных биохимических характеристик штаммов B.thailandensis KM 161 и В.pseudomallei С-141.

Культуры B.thailandensis KM 161 и В.pseudomallei С-141 выращивают на триптиказно-соевом агаре и селективной среде Эшдауна при 37°С в течение 24 ч.

Оценку активности расщепления карбогидратов, декарбоксилирования аминокислот, ассимиляции источников углерода и энергии проводят на среде, предложенной G.Gilardi (Gilardi G.L. Mount Sinai J. Med. - 1976. - Vol.43, №6. - P.710-715) по стандартным методам, предусмотренным для изучения основных родовых и видовых свойств B.pseudomallei.

Результаты сравнения штаммов B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei С-141 представлены в таблице 1.

Таблица 1
Сравнение фенотипических призраков B.ailandensis KM 161 и B.pseudomallei C-141ТестыB.pseudomallei С-141B.thailandensis KM 161Окисление глюкозы++фруктозы++ксилозы++лактозы++мальтозы++Аргининдигидролаза++Лизиндекарбоксилаза--Орнитиндекарбоксилаза--Желатиназа++Денитрификация++ДНК-аза--Число жгутиков>1>1Рост при 4°С--Рост при 42°С++ПолимиксинRRГентамицинRRРост при 2,5% NaСl--Ассимиляция 1-арабинозы-+Ассимиляция β-аланина++Наличие пигмента--R-колонии на агаре+/--Ауксотрофность--Примечание: (+) и (-) обозначают наличие или отсутствие признака у данного штамма; R - устойчивость, S - чувствительность к антибиотикам.

Пример 3. Определение вирулентности штаммов B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei C-141.

Вирулентность штаммов для лабораторных животных проверяют на двух видах - высокочувствительных к мелиоидозу золотистых хомячках и умеренно чувствительных - морских свинках. Заражение животных производят взвесью суточной агаровой культуры в объеме 0,5 мл подкожно в область внутренней поверхности бедра. Морских свинок и золотистых хомячков заражают возрастающими в геометрической прогрессии дозами от 10² до 10⁸ м.к/мл. Учет опыта - через 1 месяц от момента заражения. Расчет летальной дозы производят с учетом результатов аутопсии.

Результаты опыта представлены в таблице 2.

Таблица 2
Вирулентность штаммов B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei С-141 для лабораторных животныхВид животногоШтаммыДозы зараженияЛД5010²10⁴10⁶10⁸З. хомячкиКМ 1610/50/52/55/51,6×10⁶З. хомячкиС-1415/55/5--<10²М. свинкиКМ 161---0/5>10⁸М.свинкиС-1411/53/55/5-2,5×10³

Пример 4. Определение иммунологических свойств и фагопродукции штамма В.thailandensis KM 161.

Постановку иммунологических реакций: РА с агглютинирующей мелиоидозной сывороткой, РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом, МФА с люминесцирующей мелиоидозной сывороткой, ТИФА и реакция иммунодиффузии, производят по общепринятым методикам, применительно к возбудителю мелиоидоза (Методические рекомендации “Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза”, Волгоград, 1994, утвержденные Г.Г.Онищенко 1.11.1994 г.).

Для определения спонтанной фагопродукции, как принято в отношении B.pseudomallei (Гришкина Т.А., Меринова Л.К. Изучение спонтанной фагопродукции Pseudomonas pseudomallei и круга “хозяев” мелиоидозных фагов среди представителей рода Pseudomonas. Микробиол. журн. - 1993. - №4. - С.43-47), в качестве индикаторного штамма используют B.mallei 10230.

B.thailandensis KM 161 так же, как и возбудитель мелиоидоза, агглютинировался кроличьей мелиоидозной сывороткой в разведениях не менее 1:200. Методом ТИФА B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei С-141 выявлялись в концентрации клеток 2,5х10⁵ и более. При использовании иммуноглобулинов диагностических флюоресцентных мелиоидозных моноклональных B.pseudomallei С-141 выявляется в МФА в титрах 1:256, B.thailandensis KM 161 - в титре 1:128. Методом РНГА B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei С-141 выявляются в разведении 5×10⁵. Все остальные штаммы буркхольдерий, в том числе и B.thailandensis, имели более низкие титры в сывороточных реакциях и не обладали спонтанной фагопродукцией. Результаты опыта представлены в таблице 3.

Таблица 3
Сравнительная характеристика диагностических тестов для идентификации возбудителя мелиоидоза и B.thailandensisШтаммыРНГА м.к./млМФА (титры)Спонтанная фагопродукцияВ. pseudomallei С 1415×10⁵1:256+B.thailandensis KM 1615×10⁵1:128+

При использовании кроличьей мелиоидозной сыворотки в реакции иммунодиффузии в геле отмечались идентичные линии преципитации, что дополнительно подтверждает антигенное родство этих видов.

Таким образом, как следует из представленных результатов, полученный штамм B.thailandensis KM 161 обладает основными фенотипическими свойствами В.pseudomallei С-141, является авирулентным и не требует соблюдения режима безопасности при работе с ним. На основании этих данных штамм B.thailandensis KM 161 может быть использован в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий по бактериологии и индикации возбудителей особо опасных инфекций.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Штамм Burkholderia thailandensis KM 161 по фенотипическим признакам обладает высокой степенью сходства с B.pseudomallei, но отличается от возбудителя мелиоидоза авирулентностью - не вызывает гибели морских свинок в дозе 1×10⁸ КОЕ. Это позволяет использовать его в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий по бактериологии и индикации возбудителей особо опасных инфекций, 3 табл.

Штамм бактерий Burkholderia thailandensis KM 161 (коллекция Рос-НИПЧИ “Микроб”) - авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза (В.pseudomallei).