ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Pichia pastoris Х-33/2albumin ДЛЯ СЕКРЕЦИИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬБУМИНА Российский патент 2007 года по МПК C12N1/19 C12N15/09 C07K14/765 C12R1/84 

Настоящее изобретение относится к генной инженерии, методу рекомбинантных ДНК, а также к дрожжам, модифицированным введением чужеродного генетического материала, и может быть использовано в производстве альбуминосодержащих медицинских препаратов.

В настоящее время наиболее распространенными способами получения альбумина являются химические способы, в частности, фракционирование плазмы крови, денатурация балластных белков, экстракция альбумина из альбуминосодержащих осадков. К недостаткам химических способов можно отнести дефицит сырьевой базы и опасность заражения конечного продукта патогенными организмами. Кроме того, химические способы являются малопроизводительными, с невысоким выходом конечного продукта.

Технологией получения человеческого альбумина, не зависящей от объемов сырьевой базы и опасности заражения патогенными организмами конечного продукта, является генная инженерия. Одним из известных методов генной инженерии является метод рекомбинантных ДНК, предусматривающий перенос структурного гена альбумина при помощи выделенной из клеток донора ДНК в клетку продуцента. В качестве продуцентов используют различные штаммы микроорганизмов, в частности штаммы дрожжей. Использование дрожжей уменьшает вероятность содержания патогенных организмов в альбумине и снижает трудоемкость процесса его производства. Кроме того, отсутствие токсичных компонентов в дрожжах позволяет использовать альбумин как основу для лекарственных средств.

Согласно патенту ЕР 0361991, 1990 г., А61К 37/02, C12N 1/19, C12N 15/14 продуцентом в процессе синтеза альбумина человека являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus var. Lactis, в хромосомы которых интегрирован структурный ген альбумина, содержащий нативный сигнал секреции и транскрибируемый под контролем промотора и региона терминации транскрипции фосфоглицерат киназы. Недостатком данной системы является низкий уровень синтеза альбумина и значительные затраты на выделение и очистку конечного продукта.

Использование метилотрофных дрожжей рода Pichia приводит к значительному увеличению выхода альбумина человека. Для получения альбумина в качестве продуцентов используют различные штаммы дрожжей рода Pichia: Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851), Pichia pastoris GS190 (NRRL Y-18014), Pichia pastoris PPFI (NRRL Y-18017), Pichia pastoris (NRRL Y-11430), Pichia pastoris (NRRL Y-11431) [EP 0510693, 1992 г., C12N 1/15, C12N 15/14], Pichia pastoris GS115 [EP 0344459, 1989 г., C12N 15/00, C12P 21/02], Pichia pastoris Hsp150 [EP 0764209, 1997 г., C12N 15/14, C12 N1/19], Pichia pastoris MP-36 [EP 0438200, 1991 г., C12N 1/16, C12N 15/16, C12N 15/56, C12N 15/57, C12N 15/81], Pichia pastoris GTS11S [JP 8259599, 1996 г., С07К 14/765, C07K 1/22]. Производство альбумина человека осуществляют по известной технологии рекомбинантных ДНК. Биосинтез рекомбинантного внеклеточного альбумина человека штаммами-продуцентами осуществляется за счет использования плазмид, содержащих структурный ген альбумина, под контролем промотора гена АОХ1, содержащего области, обеспечивающие активацию и инициацию транскрипции в присутствии метанола в культуральной среде. По совокупности существенных признаков в качестве прототипа может быть выбран любой из вышеприведенных штаммов. К тому же они обладают общим недостатком - невысокой производительностью альбумина.

В качестве прототипа выбран наиболее продуктивный из указанных выше штаммов Pichia pastoris GS115/His⁺Mut^s albumin [EP 0510693, 1992 г., C12N 1/15, C12N 15/14], в АОХ1 локус хромосомы которого интегрирован один структурный ген альбумина, содержащий нативный сигнал секреции и транскрибируемый под контролем 5'АОХ1 промотора и АОХ1 региона терминации транскрипции.

Недостатком этого штамма является низкий уровень секреции альбумина человека - 1 г/л культуральной среды.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, это повышение продуктивности дрожжевого продуцента альбумина человека.

Задача решается тем, что в соответствии с изобретением для повышения продуктивности дрожжевого продуцента альбумина человека используют штамм дрожжей Pichia pastoris X33/2albumin, АОХ1 локус хромосомы которого содержит, по меньшей мере, два структурных гена альбумина с сигналами секреции альфа фактора дрожжей, транскрибируемых под контролем 5'АОХ1 промотора и региона терминации транскрипции вируса гепатита G.

Для получения штамма дрожжей Pichia pastoris X33/2albumin в качестве реципиента используют штамм дрожжей Pichia pastoris X-33 (wild-type mut⁺), известный, например, по [Burrowes О. et al., 2005, Journal of Biomedicine and Biotechnology, №4, p.374-384].

Штамм дрожжей Pichia pastoris X33/2albumin характеризуется следующими отличительными признаками.

Фрагмент ДНК, кодирующий структурный ген альбумина, извлекают из печени человека методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (Lawn R.M. et al., Nucleic Acids Res, 1981, v.22, p.6103-6114). Полученный таким образом фрагмент ДНК идентичен нуклеотидной последовательности мРНК, кодирующей структурную часть альбумина человека (депонирование мРНК в базе данных EMBL/GenBank/DDBJ под регистрационным номером V00495).

АОХ1 локус хромосомы Pichia pastoris X33 трансформируют, по меньшей мере, двумя генетическими конструкциями, содержащими сигнал секреции альфа фактора дрожжей, слитого со структурной частью гена альбумина, и транскрибируемых под контролем 5'АОХ1 промотора и региона терминации транскрипции вируса гепатита G. В результате трансформации в составе хромосомы клетки дрожжей содержится, по меньшей мере, два структурных гена альбумина, обеспечивающих синтез и секрецию в культуральную среду альбумина человека. В результате таких изменений трансформированный штамм дрожжей Pichia pastoris обозначен как Pichia pastoris X33/2albumin.

Генетическая конструкция, обеспечивающая синтез и секрецию альбумина человека трансформированными ею клетками дрожжей, состоит из следующих элементов:

- Bgl II - Xho I - фрагмент ДНК размером 2995 п.о., включающий фрагмент 5'-промоторной области дрожжевого гена АОХ1 размером 941 н.о., сигнал секреции альфа фактора дрожжей размером 266 н.о. (Brake A.J., Merryweather J.P., Cuit D.G., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 81, p.4682-4686), слитый со структурным геном альбумина размером 1788 п.о. (депонированным в базе данных EMBL/GenBank/DDBJ под регистрационным номером V00495).

- Kpn I - фрагмент ДНК размером 120 н.о. региона терминации транскрипции вируса гепатита G (Новиков Д.В. Автореф. дисс. канд. биол., М.: 2000 г., 24 с.).

- Bam HI - фрагмент ДНК размером 2787 п.о., включающий фрагмент 5'-промоторной области дрожжевого гена АОХ1 размером 733 н.о., сигнал секреции альфа фактора дрожжей размером 266 н.о., слитый со структурным геном альбумина размером 1788 п.о.

Для получения генетической конструкции и трансформации ею клеток дрожжей используют методы, описанные ранее (Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы, М.: Мир, 1989, 368 с.).

Клетки растут на полной органической среде YEPD (известной также под названием YPD) - 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы или 1% глицерина.

Клетки растут также и на минеральной среде SC - 1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США), 2% глюкозы (1% глицерина или 0.5% метанола), а также на других синтетических средах для дрожжей.

Клетки растут в температурном диапазоне от 4 до 37°С.

В качестве источника углерода для клетки можно использовать многие простые соединения, такие как глюкоза, глицерин, метанол, этанол.

В качестве источника азота для клетки можно использовать минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.

При росте на твердых питательных средах клетки образуют округлые, гладкие колонии с матовой поверхностью светло-кремового цвета. При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную суспензию. Культура обладает характерным запахом метилотрофных дрожжей.

Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма дрожжей Pichia pastoris X33/2albumin.

Клетки Pichia pastoris X33/2albumin выращивают при 20-30°С в 100 мл жидкой среды BMGY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 1% глицерина, 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 6,0, 1,3% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США)) до стационарной фазы роста в течение 1-2 суток.

Пример 2. Использование штамма дрожжей Pichia pastoris X33/2albumin для получения рекомбинантного альбумина человека и анализ культуральной среды на наличие альбумина.

Клетки полученного из предыдущего примера штамма дрожжей собирают центрифугированием, сливают супернатант и суспендируют осадок в 20 мл среды BMMY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5 - 5% метанола, 0.1 М калий-фосфатного буфера, рН 5,0-6,0, 1,3% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США)) для индукции экспрессии альбумина. Индукцию проводят при 20-30°С в течение 2-8 суток, затем культуральную среду отделяют от клеточной биомассы центрифугированием или фильтрованием.

Наличие альбумина в культуральной среде определяют при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Белки разделяют в 10% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер - 25 мМ трис HCl, 200 мМ глицина, 0,1% додецилсульфата натрия; буфер для приготовления верхнего геля - 350 мМ трис HCl рН 6.8; буфер для приготовления нижнего геля - 375 мМ трис HCl рН 6.8). Параллельно разделяют белки, секретируемые в культуральную жидкость контрольного штамма Pichia pastoris X33, выращенного в идентичных условиях. В качестве стандарта используют препарат альбумина человека. По окончании электрофореза белки окрашивают в растворе, содержащем 10% этилового спирта, 10% уксусной кислоты и 0.01% Coomassie Briliant Blue R-250 (Serva, США). Не связавшийся краситель отмывают в растворе, содержащем 10% этилового спирта и 10% уксусной кислоты. При сравнении спектра белков, секретируемых в культуральную жидкость двумя штаммами, у штамма Pichia pastoris X33/2albumin обнаруживают появление дополнительной белковой полосы, обладающей электрофоретической подвижностью, идентичной стандартному препарату альбумина человека. Уровень синтеза альбумина определяют, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой стандарта.

Полученный таким образом штамм дрожжей Pichia pastoris X33/2albumin является продуцентом рекомбинантного альбумина человека. Согласно полученным данным клетки штамма дрожжей Pichia pastoris X33/2albumin секретируют не менее 1,5 г альбумина человека на литр культуры дрожжей.

Пример 3. Проверка подлинности заявляемого штамма дрожжей Pichia pastoris X33/2albumin.

При использовании очищенного препарата хромосомальной ДНК Pichia pastoris X33/2albumin в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции с использованием праймеров 5'-TCTAGAAGGCGTTGAATTCTCGC-3' и 5'-ATAGCGTAATCCGTGACTAC-3' синтезируется фрагмент ДНК размером 140 нуклеотидных оснований, содержащий следующую нуклеотидную последовательность:

ATAGCGTAATCCGTGACTACGGGCTGCTCGCAGAGCCCTCCCCGGATGGGGCACAG

TGCACTGTGATCTGAAGGGGTGCACCCCGGTAAGAGCTCGGCCCAAAGGCCGGGTT

CTACTGCGAGAATTCAACGCCTTCTAGA,

соответствующую нуклеотидной последовательности 3' концевой области генома вируса гепатита G, и депонированной в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank под регистрационным номером - AF249320.

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к штамму дрожжей, модифицированному введением чужеродного генетического материала. Штамм получают трансформированием клеток исходной культуры Pichia pastoris X-33 двумя структурными генами альбумина с сигналами секреции альфа фактора дрожжей, транскрибируемых под контролем 5'АОХ1 промотора и региона терминации транскрипции вируса гепатита G. Штамм обеспечивает высокий выход рекомбинантного альбумина человека и может быть использован при производстве альбуминосодержащих медицинских препаратов.

Штамм дрожжей Pichia pastoris X-33/2albumin для секреции альбумина человека, трансформированный в АОХ1 локусе хромосомы двумя структурными генами альбумина с сигналами секреции альфа фактора дрожжей, транскрибируемых под контролем 5'АОХ1 промотора и региона терминации транскрипции вируса гепатита G.