КОМПОЗИЦИИ ПОЛИМЕРНЫХ МИЦЕЛЛ Российский патент 2007 года по МПК A61K9/51 A61K47/30 A61P31/00 A61P35/00 A61P37/00 

Описание

1. Область техники

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим полимерные мицеллы, которые пригодны для доставки терапевтических агентов, включая противораковые препараты, но не ограничиваясь только ими.

2. Предпосылки изобретения

Основным препятствием, связанным с использованием химиотерапевтических агентов, является отсутствие селективности в отношении раковых клеток. Такое отсутствие селективности связано с токсичным побочным действием, возникающим при использовании таких агентов, что обусловлено их доставкой как к нормальным, так и к аномальным клеткам. Отсутствие селективности лекарственных препаратов в отношении целевых клеток также является проблемой и при лечении различных других расстройств помимо рака. Много усилий исследователи фокусировали на разработке носителей для лекарственных препаратов, которые могли бы селективно доставлять лекарственный препарат к целевым клеткам. Например, для того чтобы улучшить специфическую доставку лекарственных препаратов с низким терапевтическим индексом, было исследовано несколько носителей лекарственных препаратов, таких как липосомы, микрочастицы, наноассоциаты и конъюгаты лекарственный препарат-полимер.

Из исследованных средств целевой доставки препаратов значительное внимание привлекли липосомы (фосфолипидные везикулы). Однако эффективность доставки ими препарата к цели ограничена их быстрым захватом клетками ретикулоэндотелия (RE) печени и селезенки, их нестабильностью в плазме, их ограниченной способностью выходить из сосудов в ткани, обусловленной их размером, техническими проблемами, связанными с их получением, и их подверженностью окислению. Решения отдельных проблем были найдены, но решения для более чем одной проблемы редко сочетались в одной композиции. Например, если уменьшить эффективность распознавания клетками RE и улучшить стабильность, то становится трудно получить стабильные липосомы, диаметр которых был бы меньше 50 нм.

Полимерные мицеллы впервые в качестве носителей лекарственных препаратов были предложены Bader, H. et al. в 1984 году. Angew. Makromol. Chem., 123/124, (1984), 457-485. Полимерные мицеллы были объектом всевозрастающего внимания ученых, и о них сформировалось представление как о потенциальном носителе для лекарственных препаратов с низкой растворимостью в воде, потому что они могут солюбилизировать данные лекарственные препараты в своем внутреннем ядре и потому что они обладают привлекательными характеристиками, такими как в общем случае небольшой размер (<100 Нм) и способность избегать захвата ретикулоэндотелиальной системой (RES).

Мицеллы часто сравнивают с носителями природного происхождения, такими как вирусы или липопротеины. Все три данных носителя характеризуются сходной структурой ядро-оболочка, которая позволяет защищать их содержимое во время транспортировки к целевой клетке, будь это ДНК для вирусов или нерастворимые в воде лекарственные препараты для липопротеинов и мицелл.

Липопротеины были предложены в качестве носителя для доставки соединений с противораковым действием к раковым клеткам, потому что новообразования обнаруживают повышенную потребность в липопротеинах низкой плотности. Однако эффективность липопротеинов в качестве носителей была поставлена под вопрос в основном потому, что липопротеины с введенным лекарственным препаратом также стали бы распознаваться и здоровыми клетками, и потому, что им бы пришлось конкурировать с липопротеинами организма за попадание на клеточные рецепторы на новообразованиях. Наоборот, вирусные носители в основном используются для доставки генетического материала, и их использование может оказаться оптимальным в тех приложениях, в которых не требуется повторного применения носителя для доставки, так как очень вероятно, что они станут причиной возникновения иммунной реакции.

Полимерные мицеллы, по-видимому, являются одним из наиболее выгодных носителей для доставки нерастворимых в воде лекарственных препаратов. Полимерные мицеллы характеризуются наличием структуры ядро-оболочка. Фармацевтические исследования полимерных мицелл в основном фокусировались на исследовании сополимеров, имеющих двухблочную структуру А-В, где А представляет собой гидрофильные звенья оболочки, а В представляет собой гидрофобные полимеры ядра соответственно. Многоблочные сополимеры, такие как поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксид)-поли(этиленоксид) (PEO-PPO-PEO) (А-В-А), также могут самоорганизовываться в мицеллы, и их также описывали в качестве потенциальных носителей лекарственных препаратов. Kabanov, A.V. et al., FEBS Lett., 258, (1989), 343-345. Гидрофобное ядро, которое в общем случае состоит из биоразлагаемого полимера, такого как поли(β-бензил-L-аспартат) (PBLA), поли(DL-молочная кислота) (PDLLA) или поли(ε-капролактон) (PCL), используется в качестве резервуара для нерастворимого лекарственного препарата, предохраняя его от контакта с водной средой. Ядро также может состоять из водорастворимого полимера, такого как поли(аспарагиновая кислота) (P(Asp)), которому придается гидрофобность в результате химической конъюгации с гидрофобным лекарственным препаратом, или же оно образуется в результате ассоциации двух противоположно заряженных полиионов (мицеллы на основе полиионных комплексов). Некоторые исследования описывают использование биоразлагаемых или плохо биоразлагаемых полимеров, таких как полистирол (Pst) или поли(метилметакрилат) (РММА), в качестве компонентов внутреннего ядра. Смотрите, например, Zhao, C.L. et al., Langmuir, 6, (1990), 514-516; Zhang, L. et al., Science, 268, (1995), 1728-1731 и Inoue, T. et al., J. Controlled Release, 51, (1998), 221-229. Для того чтобы бионеразлагаемые полимеры можно было рассматривать в качестве носителей лекарственных препаратов, имеющих значение в клинической практике, они должны быть нетоксичными и иметь молекулярную массу, достаточно низкую для того, чтобы их выведение из организма могло бы происходить через почки. Гидрофобное внутреннее ядро также может состоять из небольшой цепи с высокой гидрофобностью, такой как алкильная цепь, или из диациллипида, такого как дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE). Гидрофобная цепь либо может быть присоединена к одному концу полимера, либо она может быть случайным образом распределена в структуре полимера.

Оболочка отвечает за стабилизацию мицеллы и за взаимодействия с белками плазмы и мембранами клеток. Обычно она состоит из цепей гидрофильных, бионеразлагаемых, биосовместимых полимеров, таких как PEO. Биораспределение носителя в основном определяется природой гидрофильной оболочки. Другие полимеры, такие как поли(N-изопропилакриламид) (PNIPA) и поли(алкилакриловая кислота), придают мицеллам чувствительность к температуре или к значению рН, и они, в конечном счете, могут быть использованы для придания биоадгезивных свойств. Также известны и мицеллы, имеющие на своей поверхности функциональные группы для конъюгации с целевой группой. Смотрите, например, Scholz, C. et al., Macromolecules, 28, (1995), 7295-7297.

Поли(N-винил-2-пирролидон) (PVP) представляет собой хорошо известный водорастворимый, биосовместимый, амфифильный полимер с высокополярной лактамной группой, окруженной неполярными метиленовыми группами в основной цепи и метиновой группой в кольце. PVP обычно используют в качестве стерического стабилизатора при синтезе полистирольных латексов. Смотрите, например, Gabaston, L.I. et al., Macromolecules, 31, (1998), 2883-2888; Rutt, J.S. et al., J. Polym. Sci.: Part A: Polym. Chem., 32, (1994), 2505-2515. PVP также можно использовать в качестве средства криозащиты и средства защиты при лиофильной сушке. Смотрите, например, Skaer, H.B. et al., J. Microsc., 110, (1977), 257-270; Townsend, M.W. et al., J. Parenter. Sci. Technol., 42, (1988), 190-199.

В сравнении с PEG PVP известен разнообразными взаимодействиями, которые он демонстрирует в отношении растворенных вместе с ним неионных и ионных веществ. Смотрите Molyneux, P., Proc. Int. Symp. Povidone, (1983), 1-19. Связывание в наибольшей степени происходит для молекул, имеющих длинные алкильные цепи, или для ароматических групп. Подобно PEG PVP также увеличивает время циркуляции in vivo для коллоидных носителей и пептидов/белков. Смотрите, например, Kamada, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 257, (1999), 448-453; Torchilin, V.P., J. Microencapsulation, 15, (1998), 1-19. Кроме этого, было также показано, что после сублимационной сушки наночастицы, содержащие двухблочные сополимеры поли(D,L-молочной кислоты) и поли(этиленгликоля) (PEG), агрегируют. Смотрите De Jaeghere, F. et al., Pharm. Res., 16, (1999), 859-866. Данная проблема была разрешена за счет использования средства защиты при лиофильной сушке. Данную проблему можно избежать путем использования PVP, потому что PVP сам по себе является средством защиты при лиофильной сушке.

N-винилпирролидон (VP) можно сополимеризовать с широким спектром винильных мономеров. С электроотрицательными мономерами он образует чередующиеся сополимеры, в то время как с акрилатами он образует статистические сополимеры. Например, получали привитой сополимер, образованный из поли(L-лактида) (PLLA) и PVP. Смотрите Eguiburu, J.L., et al., J. San Roman, Polymer, 37, (1996), 3615-3622. В данном исследовании макромономер PLLA сополимеризовали с VP, но формирование полимерных мицелл не оценивали.

До сих пор большинство исследований, связанных с получением биоразлагаемых полимерных мицелл, фокусировалось на использовании PEG для получения гидрофильной оболочки. Смотрите, например, X. Zhang, X., et al., Inter. J. Pharm. 132 (1996), 195-206; Yokoyama, M., et al., J. Control. Release, 55 (1998), 219-229 и Allen, C., et al., J. Control. Release, 63 (2000), 275-286.

Поэтому сохраняется потребность в новых биосовместимых и биоразлагаемых полимерных мицеллярных системах, которые не содержат PEG, но которые отличаются хорошими свойствами в том, что касается солюбилизации, и наличием нескольких центров связывания для разнообразных лекарственных препаратов. Они также должны легко повторно диспергироваться или повторно растворяться после добавления воды к форме, полученной после сублимационной сушки. Настоящее изобретение предлагает такую систему, образованную из двухблочного PVP-поли(D,L-лактида) (PDLLA).

3. Краткое изложение изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает мицеллообразующую композицию, включающую гидрофобное ядро, окруженное гидрофильной оболочкой, и где упомянутой гидрофильной оболочкой является PVP.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает мицеллообразующую композицию, включающую:

терапевтический агент; и

гидрофобное ядро, окруженное гидрофильной оболочкой, и где упомянутой гидрофильной оболочкой является PVP, и где упомянутый терапевтический агент содержится в упомянутой мицелле.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает способы загрузки в полимерные мицеллы, по меньшей мере, одного подходящего терапевтического агента.

Настоящее изобретение также обеспечивает композицию, включающую полимерные мицеллы, содержащие терапевтический агент, где терапевтический агент может быть защищен от химических взаимодействий, таких как гидролиз, тем, что он будет содержаться в гидрофобном ядре или в гидрофильной оболочке упомянутой мицеллы.

Эти и другие признаки и преимущества изобретения будут легче поняты специалистами в данной области после прочтения следующего далее подробного описания.

4. Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает коллоидную композицию, состоящую из полимерных мицелл, которые можно использовать для доставки терапевтических агентов, которые отличаются плохой растворимостью в воде и/или обладают специфическим сродством к гидрофильной оболочке. Полимерные мицеллы характеризуются наличием структуры ядро-оболочка, где гидрофобное ядро окружено гидрофильной оболочкой. Гидрофильная оболочка содержит гидрофильные полимер или сополимер.

Гидрофильный полимер настоящего изобретения представляет собой полимер или сополимер поли(N-винил-2-пирролидона) (PVP).

Гидрофобная часть составляет ядро мицеллы. Гидрофобную часть можно выбрать из сложных полиэфиров, таких как поли(гликолевая кислота), поли(молочная кислота), поли(D-молочная кислота), поли(D,L-молочная кислота), сополимеры лактида/гликолида, поликапролактон и их производные; сложных поли(ортоэфиров) и их производных; полиангидридов и их производных; полученных из тирозина псевдополи(аминокислот) и их производных; полифосфазенов и их производных; поли(алкилакрилата) и его производных; поли(β-бензил-L-аспартата) и его производных и их комбинаций. Предпочтительной гидрофобной частью является поли(D,L-лактид) (PDLLA). PDLLA присутствует в концентрации, варьирующейся в диапазоне от приблизительно 10% до приблизительно 50% (масс./масс.).

4.1. Формирование мицелл

Формирование мицелл происходит в результате действия двух сил. Одной является сила притяжения, которая приводит к ассоциации молекул, в то время как другой является сила отталкивания, которая предотвращает неограниченный рост мицелл до получения отдельной макроскопической фазы. Амфифильные сополимеры самоассоциируются при попадании в растворитель, который является селективным либо для гидрофильного, либо для гидрофобного полимера.

Процесс мицеллообразования амфифильных сополимеров подобен такому же процессу для низкомолекулярных поверхностно-активных веществ. При очень низких концентрациях полимеры существуют только в виде индивидуальных цепей. По мере того как концентрация будет расти и достигать критического значения, называемого критической концентрацией ассоциации (ККА), полимерные цепи будут начинать ассоциироваться с формированием мицелл таким образом, что гидрофобная часть сополимера будет избегать контакта с водной средой, в которой растворен полимер. При ККА существенную часть растворителя можно обнаружить внутри ядра мицеллы, а мицеллы описывают как рыхлые агрегаты, отличающиеся более значительным размером по сравнению с мицеллами, образованными при более высоких концентрациях. При таких концентрациях равновесие будет смещено в сторону формирования мицелл, мицеллы будут принимать конфигурацию своего низкоэнергетического состояния, а остающийся растворитель будет постепенно высвобождаться из гидрофобного ядра, что повлечет за собой уменьшение размера мицеллы. Амфифильные сополимеры обычно характеризуются величиной ККА, которая будет намного ниже данной величины для низкомолекулярных поверхностно-активных веществ. Например, ККА для PEO-PBLA и PNIPA-Pst находятся в диапазоне 0,0005-0,002%. Однако некоторые амфифильные сополимеры отличаются намного более высокой ККА, достигающей вплоть до 0,01-10% в случае полоксамеров. Амфифильные сополимеры с высокой ККА не могут быть пригодными в качестве средств доставки лекарственных препаратов, поскольку они нестабильны в водной среде и легко диссоциируют при разбавлении.

Мицеллообразование для амфифильных сополимеров может привести к получению двух различных типов мицелл в зависимости от того, будут связаны гидрофобные цепи с гидрофильным полимером случайным образом или же они будут привиты к одному концу гидрофильной цепи. Мицеллы, образованные из полимеров, модифицированных случайным образом, в общем случае меньше, чем мицеллы для полимеров, модифицированных по концу. Размер мицелл в основном определяется гидрофобными силами, которые собирают гидрофобные цепи в ядре, и отталкиванием исключенного объема между цепями, которое ограничивает размер мицелл. Различие в балансе данных двух сил для сополимеров, модифицированных случайным образом и по концу, может объяснить различие их размеров. Когда ассоциируются концевые гидрофобные группы с образованием мицелл, кластеры воды, иммобилизованные в области гидрофобных сегментов, исключаются из ядра и не существует никакого непосредственного взаимодействия между ядром и гидрофильной оболочкой, которая сохраняется в виде мобильных линейных цепей в структуре мицеллы. Однако полимеры, модифицированные случайным образом, ассоциируются таким образом, что гидрофобная и гидрофильная части полимера переплетаются друг с другом, допуская возможный контакт между ядром и водной средой. Это важный момент, потому что незащищенность гидрофобных ядер может повлечь за собой вторичную агрегацию полимерных мицелл. Вторичную агрегацию также предлагали в качестве гипотезы для объяснения присутствия больших частиц (>100 нм) в мицеллярных системах PEO-P(Asp) с конъюгированным доксорубицином (DOX).

4.2. Определение критической концентрации ассоциации (ККА)

Для определения молекулярной массы и числа агрегации мицелл широко используют светорассеяние. Однако начало мицеллообразования можно зафиксировать только, если ККА попадает в пределы чувствительности способа рассеяния. Это редкая ситуация для полимеров в воде. Гельпроникающую хроматографию (ГПХ) в водной среде можно использовать потому, что индивидуальные цепи и мицеллярные фракции сополимеров характеризуются различными объемами элюирования. При помощи ГПХ также возможно одновременно определять молекулярную массу мицелл и их число агрегации. Важное значение имеет также сохранение целостности полимерных мицелл во время их элюирования через колонку для хроматографии исключенного объема. Проблему также может представлять адсорбция полимера на колонке, в особенности при концентрациях, близких к ККА, когда мицеллы состоят из больших рыхлых агрегатов.

Предпочтительный способ определения ККА включает использование флуоресцентных зондов, среди которых широко используют пирен. Пирен представляет собой конденсированный ароматический углеводород, который обладает высокой гидрофобностью и чувствительностью к полярности окружающей среды. Ниже ККА пирен солюбилизируется в воде, среде с высокой полярностью. Когда будут формироваться мицеллы, пирен предпочтительно перераспределится в гидрофобный домен, образуемый ядром мицеллы, и, таким образом, он попадает в неполярное окружение. В результате будут наблюдаться многочисленные изменения, такие как увеличение интенсивности флуоресценции, изменение в колебательной тонкой структуре эмиссионных спектров и сдвиг в длинноволновую сторону для полосы (0, 0) в спектрах возбуждения. Наблюдаемую ККА можно получить из графика зависимостей флуоресценции пирена, отношения I₁/I₃, получаемого из эмиссионных спектров, или отношения I₃₃₈/I₃₃₃, получаемого из спектров возбуждения, от концентрации. Значительное изменение наклона указывает на начало мицеллообразования. Отношение I₁/I₃ представляет собой отношение интенсивностей между первым и третьим эмиссионными пиками с наибольшей энергией, и его измеряют при постоянной длине волны возбуждения и переменных длинах волн испускания, соответствующих I₁ и I₃. К интерпретированию ККА, определенной при помощи флуоресцентных методик, нужно подходить с некоторой осторожностью по двум причинам. Во-первых, концентрацию пирена необходимо выдерживать на чрезвычайно низком уровне (10^-7 М) так, чтобы можно было точно зафиксировать изменение наклона тогда, когда будет иметь место мицеллообразование. Во-вторых, постепенное изменение в спектре флуоресценции иногда может быть приписано наличию гидрофобных примесей или ассоциации зонда с отдельными полимерными цепями или с агрегатами, предшествующими образованию мицелл. С началом мицеллообразования также связывали и изменения в анизотропии флуоресцентных зондов.

Полимерные мицеллы, такие как те, что входят в композиции данного изобретения, отличаются своим небольшим размером (10-100 нм). Помимо того что данный небольшой размер необходим для выхода материалов носителя из сосудов в ткани, он позволяет стерилизовать композицию просто в результате фильтрования и сводит к минимуму опасность эмболии в капиллярах. Такая ситуация не встречается для более крупных носителей лекарственных препаратов. Размер мицеллы зависит от нескольких факторов, в том числе от молекулярной массы сополимера, относительных пропорций гидрофильных и гидрофобных цепей и от числа агрегации. На размер мицелл, полученных в результате диализа, может оказать влияние органический растворитель, использованный для растворения полимера.

Диаметр мицелл и полидисперсность их размеров можно определить непосредственно в воде или в изотоническом буфере при помощи динамического светорассеяния (DLS). DLS также может дать информацию относительности степени сферичности полимерных мицелл.

Размер мицелл также можно оценить при помощи таких методов, как микроскопия атомных сил (AFM), просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ) и сканирующая электронная микроскопия (SEM). Данные способы делают возможным получение характеристик для формы мицелл и дисперсности размеров. Для оценки полидисперсности полимерных мицелл иногда проводят исследования с измерением скорости ультрацентрифугирования.

4.3. Введение в полимерные мицеллы терапевтических агентов

Загрузку в мицеллы терапевтического агента можно осуществить в соответствии с методиками, хорошо известными специалистам в данной области. Например, загрузку можно провести посредством растворения соединения в растворе, содержащем предварительно сформированные мицеллы, при помощи методики «масло в воде» или по методу диализа.

Терапевтические агенты, которые можно использовать, представляют собой любые соединения, в том числе те, что будут перечислены ниже, которые могут стабильно захватываться в полимерных мицеллах и вводиться в терапевтически эффективной дозировке. Терапевтические агенты, используемые в соответствии с изобретением, предпочтительно являются гидрофобными для того, чтобы загрузка в мицеллы проходила эффективно. Однако может оказаться возможным формирование стабильных комплексов между ионными мицеллами и противоположно заряженными гидрофильными соединениями, такими как антисенс-олигонуклеотиды. Подходящие лекарственные препараты включают соединения с противораковым действием, такие как фталоцианины (например, алюминийхлоридфталоцианин), антрациклины (например, доксорубицин (DOX)), плохо растворимые антиметаболиты (например, метотрексат, митомицин, 5-фторурацил) и алкилирующие агенты (например, кармустин). Мицеллы также могут содержать таксаны, такие как паклитаксель.

Дополнительные лекарственные препараты, которые могут содержаться в мицеллах, представляют собой обычно используемые гидрофобные антибиотики и противогрибковые препараты, такие как амфотерицин В, плохо растворимые в воде иммуномодуляторы, такие как циклоспорин, плохо растворимые в воде противовирусные препараты, такие как ингибиторы ВИЧ-протеазы, и плохо растворимые в воде стероидные (например, дексаметазон), нестероидные (например, индометацин) противовоспалительные препараты и фрагменты генома.

Кроме того, лекарственные препараты можно вводить во включающие полимерные мицеллы композиции данного изобретения производя химическую конъюгацию или физический захват в результате диализа, применения методик эмульгирования, простого создания равновесия между лекарственным препаратом и мицеллами в водной среде или солюбилизации твердой дисперсии лекарственный препарат/полимер в воде.

Во включающие полимерные мицеллы композиции данного изобретения также можно ввести и гидрофильные соединения, такие как белки. Однако введение таких гидрофильных соединений может потребовать химической гидрофобизации молекулы или наличия частичного сродства для гидрофильной оболочки. В результате формирования мицелл на основе полиионных комплексов можно вводить полиионные соединения.

Физический захват лекарственных препаратов в общем случае осуществляют проводя диализ или используя методику с применением эмульсии «масло в воде». Способ диализа заключается в перенесении лекарственного препарата и сополимера из растворителя, в котором они оба растворимы, такого как этанол или N,N-диметилформамид, в растворитель, который селективен только для гидрофильной части полимера, такой как вода. По мере того как хороший растворитель будет замещаться селективным растворителем, гидрофобная часть полимера в ходе процесса будет ассоциироваться с получением ядра мицеллы, включающего нерастворимый лекарственный препарат. Растягивая диализ на несколько дней, можно добиться полного удаления органического растворителя. В способе с использованием эмульсии «масло в воде» к водному раствору сополимера добавляют раствор лекарственного препарата в нерастворимом в воде летучем растворителе, таком как хлороформ, с получением эмульсии «масло в воде». По мере того как растворитель будет испаряться, будет формироваться конъюгат мицелла-лекарственный препарат. Основное преимущество методики диализа над последним способом заключается в том, что можно избежать использования потенциально токсичных растворителей, таких как хлорированные растворители.

Методика загрузки лекарственного препарата может оказать влияние на распределение лекарственного препарата в пределах мицеллы. Например, Cao et al. (Macromolecules, 24, (1991), 6300-6305) показали, что пирен, введенный в мицеллы тогда, когда они формировались, не был защищен от водной среды так же хорошо, как пирен, введенный после того, как мицеллы сформировались, хотя первый способ позволял добиться загрузки лекарственного препарата в три раза более высокой по сравнению со вторым способом.

Эффективность захвата полимерными мицеллами данного изобретения зависит от первоначального количества добавляемого лекарственного препарата. Превышение максимальной емкости загрузки влечет за собой осаждение терапевтического агента и, следовательно, уменьшение выхода. Кроме того, эффективность загрузки терапевтического агента зависит от числа агрегации сополимера. Мицеллы с более высоким числом агрегации делают возможной солюбилизацию в их внутреннем ядре более значительного количества лекарственного препарата.

4.4. Примеры полимерных мицелл с загрузкой терапевтического агента

Примеры соединений, загруженных в полимерные мицеллы, а также соответствующей методики загрузки лекарственного препарата приведены в таблице 1. Представляется, что включающие полимерные мицеллы композиции данного изобретения пригодны для использования в качестве систем доставки для широкого ассортимента терапевтических агентов, в том числе противораковых агентов, плазмида ДНК, антисенс-олигонуклеотидов, но не ограничиваясь только ими, или для доставки диагностических агентов к конкретному органу в организме.

Таблица 1
Примеры лекарственных препаратов и трейсеров, загруженных в полимерные мицеллыЛекарственный препарат ПолимерСпособ введенияРазмер мицеллы с лекарственным препаратом (нм) Амфотерицин В PEO-PBLAР26Антисенс-олигонуклеотидPEO-P(Lys)ЕА50Цисплатин PEO-P(Asp)С16Циклофосфамид PEO-P(Lys)Сn.a.Деквалиний РЕО-РЕР15Доксорубицин (DOX)PEO-P(Asp)С50DOXPEO-P(Asp)C14-131DOXPEO-P(Asp)C17-42DOXPEO-PBLAP 30 DOX PEO-PDLLAP n.a. DOX PEO-PBLAP 37 DOXPEO-P(Asp)P+C n.a. DOXPNIPA-PBMAP n.a. DOX PAA-PMMAP n.a. Gd-DTPA-PE
¹¹¹In-DTPA-SA PEO-PEP 20 Галоперидол РЕО-РРО-РЕОР n.a. Галоперидол РЕО-РРО-РЕОР 15 Индометацин PEO-PBLAР 25-29 ИндометацинPEO-PCLР 145-165 Индометацин PEO-PCLР 114-156 Иодное производное бензойной кислоты PEO-P(Lys) С 80 KRN-5500 PEO-PBLA P   PEO-(C₁₆, BLA)  71* PEO-P(Asp, BLA)   Паклитаксель PEO-PDLLA P n.a. Паклитаксель LCC P <100 Плазмид ДНКPEO-P(Lys) EA 140-150 Ингибитор трипсина из соевых бобов РЕО-РЕ Р 15 Тестостерон PEO-PDLLAР n.a. Ингибитор топоизомеразы II эллиптицин PEO-PE P n.a. n.a.: нет данных; Р: физический захват; С: химическое связывание; ЕА: электростатическая ассоциация.
* После обработки ультразвуком агрегатов РЕО (С₁₆, BLA).

Свидетельство введения лекарственного препарата можно получить при помощи ГПХ или DLS, поскольку оба метода детектируют изменения размера мицеллы. Присутствие лекарственных препаратов обычно связывают с таким увеличением размера мицелл. Местоположение лекарственного препарата внутри ядра мицеллы можно продемонстрировать проводя эксперименты по гашению свечения. Например, йод(I), который является водорастворимым гасителем для DOX, не оказывает влияния на флуоресценцию лекарственного препарата, введенного в мицеллу, но гасит флуоресценцию свободного лекарственного препарата. Такие эксперименты показали, что DOX сохраняется в PEO-PBLA после сублимационной сушки и восстановления исходного состояния в воде. В случае DOX самоассоциация лекарственного препарата в ядре мицеллы также приводит в результате к уменьшению интенсивности флуоресценции лекарственного препарата. Недавно удерживание и медленное высвобождение амфотерицина В из полимерных мицелл было опосредованно установлено при проведении измерений уменьшения его гемолитической активности после его введения в мицеллы PEO-PBLA.

4.5. Фармацевтические применения

Включающие полимерные мицеллы композиции данного изобретения пригодны для использования в разнообразных областях фармацевтики, таких как пероральная доставка, пролонгированное высвобождение и целевая доставка лекарственного препарата в конкретное место. Мицеллы данного изобретения предпочтительно используют в качестве средства доставки лекарственных препаратов, нерастворимых в воде.

5. Примеры

Следующий далее пример является иллюстративным и не предназначен для ограничения объема настоящего изобретения.

Вещества

Коммерчески доступные растворители приобретали от компании Moquin Scientific (Terrebonne, Quebec), а реагенты - от компании Aldrich (Milwaukee, WI). N-винил-2-пирролидон (VP), 2-изопропоксиэтанол, гидрид калия (КН) с содержанием 35 мас.% в минеральном масле и 18-краун-6 использовали без дополнительной очистки. D,L-лактид перекристаллизовывали три раза из безводного этилацетата при 60°С, а после этого высушивали при комнатной температуре в течение 24 часов при пониженном давлении над Р₂О₅. Тетрагидрофуран (ТГФ) кипятили в колбе с обратным холодильником и дистиллировали над натрием и бензофеноном в атмосфере сухого аргона непосредственно перед использованием. 1,1'-азобис(циклогексанкарбонитрил) (ACCN) очищали проводя осаждение в воду из раствора в этаноле и высушивали в вакууме в течение 4 дней. Sepharose 2В получали от компании Sigma (Saint Louis, MO) и перед использованием добивались достижения равновесия с водой. Пакетами для диализа, использованными при получении мицелл, были Spectra/Por Membranes (Rancho Dominguez, CA), MWCO 6000-8000. Все реакции проводили в атмосфере сухого азота в круглодонных колбах, которые предварительно стерилизовали пламенем и которые были снабжены резиновой мембраной.

Молекулярные массы определяли при помощи гельпроникающей хроматографии (ГПХ, Waters Model 600, Milford, MA) c программой из программного обеспечения Millenium. Использовали три колонки Styragel (Waters, HR1, HR3, HR4, 4,6·300 мм) и детектор с дифференциальным рефрактометром (Waters 2410). Подвижной фазой был CHCl₃ (30°С и 1 мл/мин). Калибровку колонки осуществляли при помощи полистирольных стандартов (Aldrich, Milwaukee, WI). Спектры ¹Н и ¹³С ЯМР записывали в дейтерированном хлороформе на спектрометрах Varian 300 и Brucker AMX 600 соответственно.

Критическую концентрацию ассоциации (ККА) определяли способом, использующим стационарную флуоресценцию пирена. Ранее было показано, что при увеличении концентраций амфифильных полимеров в водном растворе пирена в спектрах возбуждения пирена происходит сдвиг полосы (0, 0) от 333 до 338,5 нм. Данное изменение, измеренное по отношению интенсивностей I₃₃₈/I₃₃₃, сопровождает переход молекул пирена из водной среды в гидрофобные ядра мицелл и его можно использовать для оценки наблюдаемой ККА. Некоторые растворы полимеров в воде, различающиеся концентрацией полимера, но содержащие 10^-7 М пирена каждый, готовили и оставляли перемешиваться в темноте в течение ночи при 4°С. Спектры стационарной флуоресценции измеряли (λ_em=390 нм), спустя 5 минут после перемешивания при 20°С, при помощи флуориметра Serie 2 Aminco Bowman (Spectronics Instruments Inc., Rochester, NY). Размер мицелл определяли в воде и в PBS (фосфатно-солевом буферном растворе) при 20°С при помощи метода динамического рассеяния лазерного излучения (DLS) с использованием унимодального и дифференциального анализа интенсивности с помощью процессора для определения распределения по размерам (SDP) (N4Plus, Coulter Electronics, Hialeah, FL).

Получение PVP-OH

PVP с концевыми гидроксигруппами (PVP-OH) получали посредством механизма радикальной полимеризации с использованием 2-изопропоксиэтанола в качестве регулятора степени полимеризации. VP (5 мл, 47 ммоль) и ACCN (0,11 г, 0,45 ммоль) солюбилизировали в 60-300 мл 2-изопропоксиэтанола. Данные растворы дегазировали с помощью аргона. Полимеризацию проводили при 80°С при перемешивании в атмосфере сухого аргона в течение 24 часов. После испарения 2-изопропоксиэтанола полимер осаждали в избыток диэтилового эфира. Полученный таким образом белый порошок очищали три раза посредством солюбилизации в минимальном количестве СН₂Cl₂ и повторно осаждали из диэтилового эфира, и в заключение высушивали в вакууме.

Полученные характеристики PVP-OH

¹Н ЯМР δ (м.д.): 1,15 (м, СН₃), 3,5-4 (широкий сигнал, СН PVP).

¹³С ЯМР δ (м.д.): 175 (С=О PVP), 63,05 (СН₂ОН).

Таблица 2
Средние молекулярные массы для PVP№ партии PVP-OH Растворитель/VP (объемное отношение) M_wM_nM_w/M_n1 12 8516 4731 1,8 2 30 5726 4090 1,4 3 30 7163 3964 1,8 4 40 5900 3278 1,8 5 60 4585 2413 1,9

Средние молекулярные массы для PVP-OH приведены в таблице 2. Можно видеть, что молекулярная масса уменьшается тогда, когда увеличивается объемное отношение растворитель/VP.

Получение блок-сополимера PVP-PDLLA

Блок-сополимер получали при помощи анионной полимеризации с раскрытием цикла.

В круглодонную колбу, продуваемую аргоном, помещали КН (0,567 г, 14 ммоль). Через иглу с двумя кончиками добавляли безводный ТГФ, получаемую в результате дисперсию кратковременно перемешивали и после этого ТГФ удаляли. В колбу добавляли 30 мл ТГФ и дисперсию охлаждали до 0°С. PVP-OH (1,5 г), ранее высушенный в вакууме при 60°С над Р₂О₅ в течение 24 часов, солюбилизировали в 30 мл ТГФ при 60°С. Данный раствор добавляли к перемешанной дисперсии при помощи иглы с двумя кончиками, а получаемый в результате раствор выдерживали при 0°С в течение 1 часа. После нагревания до комнатной температуры перемешивание продолжали в течение 4 часов. Дисперсию переводили в другую колбу и при комнатной температуре добавляли 18-краун-6 (0,085 г, 0,32 ммоль) и перемешивали в течение 30 минут. Полимеризацию D,L-лактида инициировали в результате быстрого введения D,L-лактида (1,5 г, 10 ммоль), растворенного в 20 мл ТГФ. По истечении 16 часов полимеризацию прекращали добавлением 1 мл уксусной кислоты и 5 мл воды. В течение 24 часов при 4°С для получения мицелл проводили диализ раствора полимера используя воду. После диализа раствор центрифугировали в течение 30 минут при 40790×g для удаления гомополимера поли(D,L-лактида) (PDLLA). Супернатант замораживали и лиофилизовали в системе сублимационной сушки (Labconco, model 77535, Kansas City, Missouri). Порошок после сублимационной сушки повторно солюбилизировали в воде и свободный PVP-OH удаляли посредством пропускания через колонку Sepharose 2B (Pharmacia, 1·40 см). Содержащий мицеллы раствор замораживали, лиофилизовали в течение 2 дней и до использования хранили при -20°С.

Полученные характеристики PVP-PDLLA

¹Н ЯМР δ (м.д.): 5,2 (м, СН PDLLA), 3,5-4 (широкий сигнал, СН PVP).

¹³С ЯМР δ (м.д.): 175 (С=О PVP), 169 (C=O PDLLA), 69,8 (СН-CH₃ PDLLA), 17,2 (СН-CH₃ PDLLA).

Таблица 3
Полученные характеристики PVP-PDLLA и полимерных мицелл№ партии PVP-OH № партии PVP-PLA PVP:PLA (масс.%)^аM_wM_nM_w/M_nРазмер мицеллы^b в воде (нм) Размер мицеллы^b в PBS (нм) ККА (мг/л) 1 1а 59:4115151 7955 1,9 56±24 44±21 10,2 2 2а 74:268500 5500 1,5 54±24 59±25 3,4 3 3а 60:408985 6576 1,3 106±45 95±37 2 3 3b 33:6714500 12084 1,2 168±71 160±64 2,6 3 3c 88:126700 4500 1,4 74±31 92±41 22,4 4 4a 60:407134 5488 1,3 51±22 48±19 1,9 4 4b 64:367920 5100 1,5 50±22 68±31 2,5 5 5a 65:355737 3685 1,5 48±21 58±23 4,3 a: определено по методу ГПХ
b: из унимодального анализа

Синтезировали несколько блок-сополимеров PVP-PDLLA с переменными составами. Как показано в таблице 3, средний размер мицеллы находился в диапазоне от 44 до 168 нм, а ККА была низка. Образец 3а с самым коротким сегментом PLA обнаруживал самую высокую ККА. Однако распределение по размерам не было унимодальным, что было выявлено при помощи анализа с применением SDP (таблица 4).

Таблица 4
Распределение по размерам для мицелл PVP-PDLLA, анализ интенсивности с применением SDP№ партии PVP-PDLLAВодаPBS Величина пика по методу SDP Среднее значение для пика по методу SDP (нм)Величина пика по методу SDP Среднее значение для пика по методу SDP (нм) 1а 85% 62±29 63% 41±13 15% 419±133 34% 290±60  2a 50% 29±6 56% 124±51 50% 199±54 44% 36±12  3a 60% 106±22 82% 154±69 30% 328±111 18% 38±12  3b 63% 319±46 96% 243±138 37% 100±15 4% 40±13  3c 69% 129±44 59% 326±59 31% 34±7 41% 78±28  4a 72% 48±26 52% 37±11 28% 158±51 48% 89±21  4b 64% 39±23 86% 119±37 36% 248±8 14% 26±8  5a 55% 36±10 62% 106±36 45% 109±46 38% 36±11  

Как показано в таблице 4, для всех образцов получались мицеллы с бимодальным распределением, причем размер маленьких частиц находился в диапазоне от 26 до 124 нм, а размер более крупных агрегатов находился в диапазоне от 106 до 419 нм.

Для того чтобы исследовать эффективность захвата лекарственного препарата, создавали условия для захвата индометацина в мицеллах PVP-PDLLA и PEG-PDLLA, как это продемонстрировано в таблице 5.

Таблица 5
Введение индометацина в полимерные мицеллыПервоначальная загрузка лекарственного препарата (%)PEG-PDLLA
(63:37 мас.%)PVP-PDLLA
(60:40 мас.%)Конечная загрузка лекарственного препарата (%)Эффективность захвата (%) Конечная загрузка лекарственного препарата (%)Эффективность захвата (%)10 3±1,0 30±10 2±0,5 20±5 20 5±1,2 25±6 7±3,1 35±16 30 10±0,9 33±3 12±1,8 40±6 40 12±1,2 30±3 18±1,2 45±3 50 12±1,0 24±2 22±2,0 44±4 PEG-PDLLA (63:37 мас.%), Mn=7900, средний диаметр (унимодальный анализ)=110±42 нм.
PVP-PDLLA (60:40 мас.%), Mn=6600, средний диаметр (унимодальный анализ)=106±45 нм.

Приведенные данные представляют собой среднюю величину для 3 измерений ± стандартное отклонение.

Лекарственный препарат и сополимер растворяли в N,N-диметилформамиде (ДМФА) и в темноте, используя воду, проводили диализ в течение 24 часов. Растворы отфильтровывали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и подвергали сублимационной сушке. Величину загрузки индометацина определяли при помощи спектрофотометра с диодной матрицей Hewlett Packard 8452A (Boise, ID) в результате измерения оптической плотности в УФ-диапазоне в области 320 нм для содержащего мицеллы раствора в ДМФА.

Эффективность захвата индометацина в мицеллах PVP-PDLLA и PEG-PDLLA была сходной при низком уровне содержания лекарственного препарата. При увеличении загрузки лекарственного препарата эффективность захвата для мицелл PVP-PDLLA начинала превосходить эффективность захвата в мицеллах PEG-PDLLA (если рассматривать сополимеры с одинаковой молекулярной массой). Без намерения ограничиваться какой-либо теорией можно предположить, что при низких уровнях содержания лекарственного препарата он сначала вводится в ядро, а потом при более высоких уровнях содержания он начинает вводиться в гидрофильную оболочку PVP.

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает мицеллообразующую композицию, включающую гидрофобное ядро, окруженное гидрофильной оболочкой, и терапевтический агент, физически захваченный в указанной мицелле, где гидрофобное ядро выбрано из группы, состоящей из сложного поли(ортоэфира); полиангидрида; полученной из тирозина псевдополи(аминокислоты); полифосфазена или поли(β-бензил-L-аспартата) и их комбинаций, или сложного полиэфира, выбранного из группы, состоящей из поли(гликолевой кислоты), поли(молочной кислоты), поли(D-молочной кислоты), поли(D,L-молочной кислоты), сополимеров лактида/гликолида, поликапролактона и их производных, и гидрофильной оболочкой является поли(N-винил-2-пирролидон); причем указанная композиция легко повторно диспергируется или повторно растворяется после добавления воды или водного раствора к форме, полученной после сублимационной сушки указанной мицеллообразующей композиции. Использование в качестве гидрофильной оболочки поли(N-винил-2-пирролидона) позволяет избежать агрегации мицелл, а также упростить стадии получения самих мицелл. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Мицеллообразующая композиция, включающая гидрофобное ядро, окруженное гидрофильной оболочкой, и терапевтический агент, физически захваченный в указанной мицелле, где гидрофобное ядро выбрано из группы, состоящей из сложного поли(ортоэфира), полиангидрида, полученной из тирозина псевдополи(аминокислоты), полифосфазена или поли(β-бензил-L-аспартата) и их комбинаций, или сложного полиэфира, выбранного из группы, состоящей из поли(гликолевой кислоты), поли(молочной кислоты), поли(D-молочной кислоты), поли(D,L-молочной кислоты), сополимеров лактида/гликолида, поликапролактона и их производных, и гидрофильной оболочкой является поли(N-винил-2-пирролидон), причем указанная композиция легко повторно диспергируется или повторно растворяется после добавления воды или водного раствора к форме, полученной после сублимационной сушки указанной мицеллообразующей композиции.2. Композиция по п.1, где терапевтический агент представляет собой соединение с противораковым действием.3. Композиция по п.2, где соединение с противораковым действием выбирают из, по меньшей мере, одного производного фталоцианина, производного антрациклина, антиметаболита, алкилирующего агента и таксана.4. Композиция по п.3, где производным фталоцианина является алюминийхлоридфталоцианин.5. Композиция по п.3, где производным антрациклина является доксорубицин.6. Композиция по п.3, где антиметаболит выбирают из метотрексата, митомицина и 5-фторурацила.7. Композиция по п.3, где алкилирующим агентом является кармустин.8. Композиция по п.3, где таксаном является паклитаксель.9. Композиция по п.1, где терапевтический агент выбирают из гидрофобного антибиотика, гидрофобного противогрибкового агента, иммуномодулятора, противовирусного препарата и стероидного или нестероидного противовоспалительного препарата.10. Способ введения терапевтического агента, включающий создание мицеллообразующей композиции по любому из пп.1-9 и введение мицеллообразующей композиции субъекту, который в этом нуждается.