СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРОВ В КАЛЕ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинической лабораторной диагностики, и может быть использовано при определении жиров в кале.

В настоящее время жиры в кале определяют качественным (микроскопия) и количественными методами (химические). К количественным методам относятся гравиметрический, титриметрический методы и липидограмма кала. Количественные методы позволяют суммарно определить общее количество жира в фекалиях с учетом жира экзогенного (пищевого) происхождения. Определение количества жира в кале необходимо для диагностики панкреатической недостаточности, синдрома ахолии и нарушенного пищеварения в кишечнике, в частности при синдроме ускоренной эвакуации химуса и нарушенного всасывания веществ кишечником. Однако при панкреатической недостаточности увеличивается содержание нерасщепленного жира - нейтрального жира, а при патологии тонкого кишечника, связанной с нарушенным всасыванием веществ - расщепленного жира - жирных кислот и солей жирных кислот. Гравиметрический метод позволяет определить общее содержание жира в кале без дифференциации между расщепленным (жирные кислоты и соли жирных кислот) и нерасщепленным жиром (нейтральный жир). Для дифференциальной лабораторной диагностики синдрома недостаточности панкреатического переваривания и синдрома нарушенного пищеварения в тонкой кишке (энтеральный синдром) проводят титриметрический метод и липидограмму кала. Однако ограничения применения титриметрического метода включают потерю летучих жирных кислот и различия в факторе титрования, зависящего от того, какая жирная кислота используется в качестве стандарта. Гравиметрический, титриметрический методы требуют сбора кала в течение 72 часов, приема с пищей 50-150 г жира/сутки по крайней мере за 2 дня до начала и в процессе сбора кала. Гравиметрический метод приводит к интерференции в случаях приема больших доз аминосалициловой кислоты, азатиоприна, бисакодила (длительное применение), холестирамина (доза более 15 г/сутки), канамицина, неомицина, тетрациклина.

Однако гравиметрический, титриметрический методы и липидограммма кала до настоящего времени остаются доступными не каждой лаборатории, достаточно трудоемкими, длительными, дорогостоящими. Анализ гравиметрии требует длительного времени. Такие операции, как «старение» осадка, фильтрование, прокаливание, занимают несколько часов, поэтому от начала до конца анализа проходит очень много времени. Следует, однако, заметить, что в течение этого времени не требуется постоянной работы биохимика-аналитика, так как «старение» осадка, прокаливание тиглей или высушивание осадка проходит практически без его участия. Поэтому не составляет большого труда выполнять сразу несколько (5-10) параллельных операций. Таким образом, гравиметрический анализ не применяется в тех случаях, когда необходим быстрый анализ большого числа проб. Длительность, трудоемкость и дороговизна определения практически исключают применение этих методов для анализов, поставленных на поток в поликлиниках и клинических больницах. Кроме того, для этих методов необходимо собирать кал в течение 72 часов, что почти не проводится в современных клиниках, так как необходимость полного количественного сбора кала представляет известные трудности, требует специальной посуды и соответствующего инструктирования больных и персонала лечебных учреждений. При определении суточного жира не требуется сбора суточного кала, достаточно после каждой дефекации в течение суток проводить определение жиров. Суточная потеря жира складывается из потери жиров за каждую дефекацию в течение суток. Однако из-за дороговизны, длительности и трудоемкости методов гравиметрии и титриметрии проводится определение жира не в каждой порции кала, а в суточном кале. Предлагаемый способ определения жиров в кале лишен этих недостатков и позволяет, не собирая суточного кала определять жиры после каждой дефекации.

Наиболее близким к предлагаемому способу является копрологический способ исследования стеатореи, который позволяет получить ориентировочную информацию об экзокринной функции поджелудочной железы и о всасывательной функции кишечника [В.Т.Морозова, И.И.Миронова, Р.Л.Марцишевская. Лабораторная диагностика патологии пищеварительной системы. М., 2001, с.63-98]. Определение расщепленного и нерасщепленного жира в кале с помощью копрологического исследования дает качественный результат. При микроскопии кала определяют нейтральные жиры, жирные кислоты и мыла. Однако этот метод не надежен, так как не дает представления о количестве выделившихся жиров. Количественные методы являются более точными и позволяют подбирать более эффективные дозы ферментных препаратов для коррекции экзокринной панкреатической недостаточности. Названные трудности привели к поиску альтернативного метода, дающего количественную оценку стеатореи.

Изобретением решается задача по определению количества общего жира, нерасщепленного (нейтрального) жира и жирных кислот в кале, что позволяет провести дифференциальную диагностику между экзокринной панкреатической недостаточностью и нарушенным всасыванием веществ в кишечнике.

Было проведено сравнение значений жира, нейтрального жира и жирных кислот, полученных с помощью титриметрии и гравиметрии и показателей, полученных по заявленному способу в 9 пробах. Полученные результаты показали, что предлагаемый способ не уступает по точности гравиметрическому и титриметрическому исследованиям, и в то же время является более точным, чем копрологическое исследование. Предлагаемый способ прост и быстр в выполнении, благодаря чему его можно рекомендовать для определения общего жира, нейтрального жира, жирных кислот для диагностики липолитической панкреатической недостаточности и заболеваний кишечника, в частности синдрома мальабсорбции.

В предлагаемом способе определения количества общего жира, нейтрального жира и жирных кислот дополнительно измеряют количество навески кала, определяют количество каждого вещества в препарате и пересчитывают полученный результат на общее количество выделенного кала за сутки или за одну дефекацию. При определении суточного жира по предлагаемому способу не требуется сбора суточного кала, достаточно после каждой дефекации в течение суток проводить определение жиров. Суточная потеря жира складывается из потери жиров за каждую дефекацию в течение суток.

где

Q - количество исследуемого вещества (общий жир, нейтральный жир, жирные кислоты) в исследуемом кале М;

n - число полей зрения в препарате (при увеличении 7×40 4031 полей зрения; при увеличении 7×10 - 233 полей зрения при площади покровного стеклышка 324 мм²);

N - среднее количество капель (жира, нейтрального жира, жирных кислот) в одном поле зрения;

ρ - плотность жиров, жирных кислот 0,9 г/см³;

R - средний радиус одной капли жира;

S_p - площадь покровного стеклышка;

v_k - объем реагента (уксусной кислоты, метиленовой или нильской сини), помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии;

М - количество кала за сутки или одну дефекацию;

m - масса навески кала, взятая для приготовления каловой эмульсии;

V - объем дистиллированной воды, добавленный в каловую навеску массой m для приготовления каловой эмульсии;

v - объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии.

Необходимо отметить, что объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии, примерно равен его массе, плотность принимается равной примерно 1 г/см³, так как большая часть исследуемого препарата, помещенного под покровное стеклышко, состоит из воды.

Полученное значение сравнивают с нормальным значением жира в кале. Существуют различные мнения о том, сколько жира выделяется с калом в норме. По данным Коровиной Н.А., Захаровой И.Н., Маловой Н.Е. в норме с калом выделяется не более 10% от жира введенного с пищей [Вопросы современной педиатрии, 2003, т.2, №5, www.solvay-phanna.ru/creon/article.asp?id=2384]. По данным Шульпековой Ю.О., Ивашкина В.Т. - норма 7 г/сут [Коррекция нарушений пищеварения ферментными препаратами поджелудочной железы (www.solvay-pharma.ru/creon/article.asp?id=3089)]. По данным В.Т.Морозовой, И.И.Мироновой, Р.Л.Марцишевской у практически здоровых людей с калом выделяется 5% жира в виде солей жирных кислот (мыл) [Лабораторная диагностика патологии пищеварительной системы. M., 2001, с.76]. Исследование является информативным только при нормальной эвакуаторной функции кишечника, что обеспечивает содержание воды в кале 80-85%. При ускоренной эвакуации химуса по тонкому кишечнику в кале определяется нейтральный жир, который не свидетельствует о панкреатической липолитической недостаточности.

Способ осуществляется следующим образом. Кал для исследования собирают после самопроизвольной дефекации в специально предназначенную посуду: чистую, сухую, не пропускающую влагу. Нельзя исследовать материал после клизмы, приема медикаментов (белладонны, пилокарпина, касторового, вазелинового масла), ведения свечей.

Для исследования из общего количества кала М приготавливают кусочек кала массой - m (навеска кала). Разводят его в дистиллированной воде объемом V до консистенции густого сиропа. Получают объем каловой эмульсии, из которого берут определенный объем каловой эмульсии (v) и приготавливают 3 препарата для определения общего жира, нейтрального жира и жирных кислот. 1 препарат - объем эмульсии каловой (v) наносят на предметное стекло, покрывают покровным, для определения остатков жировой пищи. При обнаружении игл или глыбок нативный препарат подогревают на пламени спиртовки, не доводя до кипения, быстро микроскопируют. Иглы и глыбки жирных кислот легко плавятся, превращаясь в капли, и вновь кристаллизуются при остывании. 2 препарат - на предметном стекле смешивают объем каловой эмульсии (v) и объем уксусной кислоты (v_k). Покрывают покровным стеклышком. Диагностируют соли жирных кислот (мыла) при кипячении. При кипячении препарата с уксусной кислотой соли жирных кислот плавятся, образуя капли, быстро кристаллизующиеся при остывании препарата. 3 препарат - на предметном стекле смешивают каловую эмульсию объемом (v) и метиленовой или нильской сини объемом (v_k). Покрывают покровным стеклышком. Дифференцируют капли нейтрального жира от капель жирных кислот. Капли жирных кислот окрашиваются в синий или темно-синий цвет. Капли нейтрального жира метиленовой синью не окрашиваются, а нильская синь окрашивает их в желтоватый или розоватый цвета или вообще не окрашивает [В.Т.Морозова, И.И.Миронова, Р.Л.Марцишевская. Лабораторная диагностика патологии пищеварительной системы. М., 2001, с.77]. Покрывают покровным стеклышком исследуемые препараты аккуратно, чтобы исследуемая смесь вся находилась равномерно и не вытекала из под покровного стеклышка. Материал равномерно находится под покровным стеклышком размером 324 мм², и не растекается при нанесении каловой эмульсии 0,1 мл и реагента (уксусной кислоты, метиленовой или нильской сини) 0,1 мл.

Выбирается средняя капля нейтрального жира, с помощью окуляромикрометра измеряется ее диаметр и подсчитывается среднее количество капель жира, нейтрального жира и жирных кислот в одном поле зрения. Определение средней массы одной капли жира зависит от толщины исследуемого препарата. Если средний диаметр жировой капли меньше или равен толщине исследуемого препарата, то средний объем капли жира рассчитывается как объем шара, если средний диаметр жировой капли больше толщины исследуемого препарата, находящегося под покровным стеклышком, то средний объем, рассчитывается как объем цилиндра. Зная количество капель жира в одном поле зрения (N), количество полей зрения в препарате (n) и массу одной капли жира, находят массу жира, содержащегося в исследуемом препарате, находящемся под покровным стеклышком и содержащим объем каловой эмульсии (v). Учитывая разведение кала (масса каловой навески (m), разведенная в объеме дистиллированной воды (V)) находят количество жира, содержащегося в кале, выделенного за сутки или за одну дефекацию.

где

Q - количество исследуемого вещества (общий жир, нейтральный жир, жирные кислоты) в исследуемом кале М;

q - количество жира, находящегося в исследуемом препарате (v) под покровным стеклышком площадью S_p, равное n·N·ρ-4/3·π·R³ (если 2R≤(v+v_k)/S_p) или равное (n·N·ρ·π·R²·(v+v_k)/S_p (если 2R>(v+v_k)/S_p));

v_k - объем реагента (уксусной кислоты, метиленовой или нильской сини), помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии;

S_p - площадь покровного стеклышка, равная 324 мм²

М - количество кала за сутки или одну дефекацию;

m - масса навески кала, взятая для приготовления каловой эмульсии;

V - объем дистиллированной воды, добавленный в каловую навеску массой m для приготовления каловой эмульсии;

v - объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии.

или

где

Q - количество исследуемого вещества (общий жир, нейтральный жир, жирные кислоты) в исследуемом кале М;

n - число полей зрения в препарате (при увеличении 7×40 4031 полей зрения; при увеличении 7×10 - 233 полей зрения при площади покровного стеклышка 324 мм²);

N - среднее количество капель (жира, нейтрального жира, жирных кислот) в одном поле зрения;

ρ - плотность жиров, жирных кислот 0,9 г/см³;

R - средний радиус одной капли жира;

А-4/3·R, если 2R≤(v+v_k)/S_p; (v+v_k)/S_p, если 2R>(v+v_k)/S_p;

Sp - площадь покровного стеклышка;

v_k - объем реагента (уксусной кислоты, метиленовой или нильской сини), помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии;

М - количество кала за сутки или одну дефекацию;

m - масса навески кала, взятая для приготовления каловой эмульсии;

V - объем дистиллированной воды, добавленный в каловую навеску массой m для приготовления каловой эмульсии;

v - объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии.

Необходимо отметить, что объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии, примерно равен его массе, плотность принимается равной примерно 1 г/см³, так как большая часть исследуемого препарата, помещенного под покровное стеклышко, состоит из воды.

Плотность жирных кислот при температуре 37°С в среднем примерно составляет 906,57 кг/м³. Плотность молочного жира при 15°С составляет от 0,936 до 0,944 г/см³; животных жиров при 18°С составляет от 0,915 до 0,953 г/см³. Таким образом, можно использовать среднее значение плотности жиров, равное 0,9 г/см³.

По предлагаемому способу было обследовано 9 больных, которым для контроля проводилось также определение жиров в кале с помощью гравиметрического и титриметрического методов. Было получено, что рассчитанные показатели нейтрального жира, жирных кислот и общего жира практически совпадают с показателями, полученными с помощью гравиметрического и титриметрического методов. Разница в показателях, полученных по предлагаемому способу титриметрии и гравиметрии, составила в среднем 7,5% для общего жира и нейтрального жира и 8% для жирных кислот.

Для подтверждения работоспособности способа приводятся следующие клинические примеры.

Пример №1. Больной, страдающий несколько лет хроническим панкреатитом. При гравиметрическом исследовании количество жира, теряемое в течение суток, составило 18 г. При определении суточной стеатореи с помощью предлагаемого способа количество общего жира составило 20 г /сут.

где

Q - количество исследуемого вещества (общий жир, нейтральный жир, жирные кислоты) в исследуемом кале М;

n - число полей зрения в препарате (при увеличении 7×40 4031 полей зрения; при увеличении 7×10 - 233 полей зрения при площади покровного стеклышка 324 мм²);

N - среднее количество капель (жира, нейтрального жира, жирных кислот) в одном поле зрения;

ρ - плотность жиров, жирных кислот 0,9 г/см³;

R - средний радиус одной капли жира;

S_p - площадь покровного стеклышка;

v_k - объем реагента (уксусной кислоты, метиленовой или нильской сини), помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии;

М - количество кала за сутки или одну дефекацию;

m - масса навески кала, взятая для приготовления каловой эмульсии;

V - объем дистиллированной воды, добавленный в каловую навеску массой m для приготовления каловой эмульсии;

v - объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии.

Так как 2R=2·0,05 мм;

(v+v_k)/S_p=0,1 мл / 324 мм² = 100 мм³/ 324 мм² = 0.3 мм,

то А=4/3·R;

n=4031 полей зрения;

N=4, т.е. в среднем по 4 капли жира в одном поле зрения;

ρ=0,9 г/см³;

R=0,05 мм;

А=4/3·R, так как 2R=2·0,05 мм;

(v+v_k)/S_p=0,1 мл / 324 мм² = 100 мм³/ 324 мм²=0.3 мм,

то А=4/3·R;

S_p - 324 мм²;

М=250 г/сут;

m=5 г;

V=0,3 мл дистиллированной воды;

v=0,1 мл.

Q=(4031·4·0,9 г/1000 мм³·3,14·(0,05)²·(4/3·(0,05))·250 г/сут·(5+0,3))/(5·0,1)=20 г/сут;

Q=20 г/сут.

Пример №2. Больной с генерализованной панкреатической внешнесекреторной недостаточностью, принимающий ферментозаместительные препараты. При титриметрическом исследовании стеаторея составила 25 г/сут, жирные кислоты 20 г/сут. При определении с помощью предлагаемого способа - общий жир 26 г/сут, жирные кислоты - 19,6 г/сут. Следовательно, дозы препарата, который больному был назначен, достаточно, а стеаторея, имеющаяся у больного, связана с нарушенным всасыванием веществ в кишечнике.

Расчет количества общего жира:

Так как 2R=2·0,04 мм;

(v+v_k)/S_p=0,1 мл/324 мм²=100 мм³/324 мм²=0,3 мм,

то А=4/3·R;

n=4031 полей зрения;

N=10, т.е. в среднем по 4 капли жира в одном поле зрения;

ρ=0,9 г/см³;

R=0,05 мм;

А=4/3·R, так как 2R=2·0,04 мм

(v+v_k)/S_p=0,1 мл/324 мм²=100 мм³/324 мм²=0,3 мм,

то А=4/3·R;

S_p - 324 мм²;

М=250 г/сут;

m=5 г;

V=0,3 мл дистиллированной воды;

v=0,1 мл.

Q=(4031·4·0,9 г/1000 мм³·3,14·(0,04)²·(4/3·(0,04))·250 г/сут·(5+0,3))/(5·0,1)=26 г/сут;

Q=26 общего жира/сут.

Расчет количества жирных кислот:

n=4031 полей зрения;

N=18, т.е. в среднем по 18 капель жирных кислот в одном поле зрения;

ρ=0,9 г/см³;

R=0,03 мм;

А=4/3·R, так как 2R=0,06 мм;

v=0,1 мл;

v_k=0,1 мл;

(v+v_k)/S_p=0,2 мл/324 мм²=200 мм³/324 мм²=0,6 мм,

то А=4/3·R;

S_p - 324 мм²;

М=250 г/сут;

m=5 г;

V=0,3 мл дистиллированной воды;

v=0,1 мл.

Q=(4031·18·0,9 г/1000 мм³·3,14·(0,03)²·(4/3·(0,03))·250 г/сут·(5+0,3))/(5·0,1)=19,6 г/сут;

Q=19,6 г/сут.

Количество общего жира в кале по предлагаемому способу - 26 г/сут, количество жирных кислот - 19,6 г/сут.

Пример №3. Больной с синдромом мальабсорбции. При титриметрическом исследовании жир в суточном кале составил 56 г, из него 50 г/сут жирные кислоты. При исследовании соотношения жиров с помощью предлагаемого способа жиры составили 54 г/сут, жирные кислоты - 48,3 г/сут.

Расчет количества общего жира:

Так как 2R=2·0,04 мм = 0,08 мм;

(v+v_k)/S_p=0,1 мл/324 мм²=100 мм³/324 мм²=0,3 мм,

то А=4/3·R;

n=4031 полей зрения;

N=13, т.е. среднем по 6 капель жирных кислот в одном поле зрения;

ρ=0,9 г/см³;

R=0,04 мм;

А=4/3·R, так как 2R=2·0,04 мм;

(v+v_k)/S_p=0,1 мл/324 мм²=100 мм³/324 мм²=0,6 мм,

то А=4/3·R;

S_p - 324 мм²;

M=400 г/сут;

m=5 г;

V=0,3 мл дистиллированной воды;

v=0,1 мл.

Q=(4031·13·0,9 г / 1000 мм³·3,14·(0,04)²·(4/3·(0,04))·400 г/сут · (5+0,3))/(5·0,1)=54 г/сут;

Q=54 г/сут.

Расчет количества жирных кислот:

n=4031 полей зрения;

N=6, т.е. среднем по 6 капель жирных кислот в одном поле зрения;

ρ=0,9 г/см³;

R=0,05 мм;

А=4/3·R, так как 2R=0,1 мм;

v=0,1 мл;

v_k=0,1 мл;

(v+v_k)/S_p=0,2 мл / 324 мм² = 200 мм³ / 324 мм² = 0,6 мм,

то А=4/3·R;

S_p - 324 мм²;

M=400 г/сут;

m=5 г;

V=0,3 мл дистиллированной воды;

v=0,1 мл.

Q=(4031·6·0,9 г / 1000 мм³ · 3,14·(0,05)²·(4/3·(0,05))·400 г/сут · (5+0,3))/(5·0,1)=48,3 г/сут;

Q=48,3 г/сут.

Предлагаемый способ можно использовать не только для количественной оценки стеатореи, но и амилореи. При этом объем крахмальных зерен, которые имеют вытянутую форму, необходимо рассчитывать как объем двух шаров. Для проверки предлагаемого способа в целях количественного определения амилореи производился подсчет крахмальных зерен содержащихся в 0,1 мл исследуемого раствора, состоящего из 2,5 г крахмала, растворенного в 1000 мл воды. Количество крахмальных зерен в 0,1 мл составило 166710. При пересчете массы крахмальных зерен в 1000 мл с помощью предлагаемой формулы масса крахмальных зерен в 1000 мл составила 2,8 г.

Таким образом, в связи с отсутствием методов титриметрии, гравиметрии и липидограммы кала в клинических лабораториях, дороговизной этих методов, а также с длительностью и трудоемкостью проведения этих методов предлагаемый способ имеет важное значение как альтернативный метод для определения нейтрального жира и жирных кислот в целях диагностики ферментативной недостаточности и нарушенного всасывания веществ в кишечнике. В то же время предлагаемый способ более точный и объективный, чем копрологическое исследование.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике. Осуществляют определение количества капель жира в препарате каловой эмульсии с помощью микроскопии. Дополнительно определяют массу исследуемой навески кала, средний радиус одной капли жира, объем реагента - уксусной кислоты, метиленовой или нильской сини, помещаемого под покровное стеклышко для микроскопии, количество кала за сутки или одну дефекацию, объем дистиллированной воды, добавленный в каловую навеску массой для приготовления каловой эмульсии, объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии. Исходя из полученных данных рассчитывают количество жира в исследуемом кале. Использование способа позволяет повысить точность определения количества общего жира, нерасщепленного (нейтрального) жира и жирных кислот в кале, что позволяет провести дифференциальную диагностику между экзокринной панкреатической недостаточностью и нарушенным всасыванием веществ в кишечнике.

Способ определения жиров в кале, включающий определение количества капель жира в препарате каловой эмульсии с помощью микроскопии, отличающийся тем, что дополнительно определяют массу исследуемой навески кала (m), средний радиус одной капли жира (R), объем реагента - уксусной кислоты, метиленовой или нильской сини, помещаемого под покровное стеклышко для микроскопии (v_k), количество кала за сутки или одну дефекацию (М), объем дистиллированной воды, добавленный в каловую навеску массой m для приготовления каловой эмульсии (V), объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии (v), затем рассчитывают количество жира в исследуемом кале (Q) по формуле

Q=(n·N·ρ·π·R²·А·М·(m+V))/(m·V),

где Q - количество исследуемого вещества (общий жир, нейтральный жир, жирные кислоты) в исследуемом кале М;

n - число полей зрения в препарате (при увеличении 7×40 4031 полей зрения;

при увеличении 7·10 - 233 полей зрения при площади покровного стеклышка 324 мм²);

N - среднее количество капель (жира, нейтрального жира, жирных кислот) в одном поле зрения;

ρ - плотность жиров, жирных кислот 0,9 г/см³;

R - средний радиус одной капли жира;

S_p - площадь покровного стеклышка (324 мм²);

V_k - объем реагента (уксусной кислоты, метиленовой или нильской сини), помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии;

М - количество кала за сутки или одну дефекацию;

m - масса навески кала, взятая для приготовления каловой эмульсии;

V - объем дистиллированной воды, добавленный в каловую навеску массой m для приготовления каловой эмульсии;

v - объем каловой эмульсии, помещаемый под покровное стеклышко для микроскопии.