СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2007 года по МПК A61K36/882 A61K125/00 A61P37/04 

Изобретение относится к медицине, конкретно, к фармакологии, и касается средств, влияющих на иммунную систему.

Назначение с лечебной или профилактической целью при заболеваниях, связанных с нарушениями иммунитета, препаратов химической или биологической природы, обладающих иммунотропной активностью, называется иммунотерапией, а сами препараты можно разделить на четыре большие группы: иммуномодуляторы, иммунокорректоры, иммуностимуляторы, иммунодепрессанты [9]. Иммуностимуляторы - средства, усиливающие иммунный ответ. К синтетическим иммуностимуляторам относится левамизол, ряд пептидных иммуностимуляторов (тимоген, иммунофан и др.) [5]. Из растительных препаратов, стимулирующих реакции иммунитета, наиболее широко используются экстракты эхинацеи пурпурной (прототип) [7, 12]. Использование лекарственных растений представляется перспективным направлением дальнейшего развития, совершенствования методов иммунореабилитации, так как препараты природного происхождения не обладают токсическими свойствами, характерными для синтетических лекарственных средств, и не вызывают дисбаланса системы иммунитета [1, 2].

Целью изобретения является расширение арсенала иммуностимулирующих средств.

Поставленная цель достигается использованием в качестве иммунностимулирующего средства водорастворимых полисахаридов, выделенных путем двукратной экстракции водой корневищ аира болотного, осаждения полисахаридов двукратным объемом 96% этанола, центрифугирования и высушивания.

Основными биологически активными веществами корневищ аира болотного являются эфирное масло (0,68-2,60%) и полисахариды (7,56-15,28 %) [10]. В современной медицинской практике используются корневища аира в виде отвара в качестве ароматической горечи, повышающей аппетит и улучшающей пищеварение, они входят в состав желудочного и противоопухолевого сборов, а виде порошка - в состав комплексных препаратов, применяемых для возбуждения аппетита и улучшения пищеварения при расстройствах желудочно-кишечного тракта и в терапии язвенной болезни и гастритов [6].

Новым в предлагаемом изобретении является то, что водорастворимые полисахариды, полученные из корневищ аира болотного, впервые предложены для использования в качестве иммуностимулирующего средства.

Использование водорастворимых полисахаридов, полученных из корневищ аира болотного, в качестве иммунностимулирующего средства в литературе не описано. Применение по новому назначению стало возможно благодаря обнаружению у них новых свойств, а именно стимуляции гуморального иммунного ответа и фагоцитарной активности макрофагов.

Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. Препарат, содержащий водорастворимые полисахариды, полученные из корневищ аира болотного, можно использовать у больных с иммунной недостаточностью, ассоциированной с острыми и хроническими инфекционными заболеваниями, на фоне лучевой терапии и лечения цитостатиками.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленная применимость".

Новое свойство водорастворимых полисахаридов, полученных из корневищ аира болотного, было обнаружено благодаря экспериментальным исследованиям.

Для установления иммуностимулирующих свойств водорастворимых полисахаридов, полученных из корневищ аира болотного, были изучены их влияние на гуморальный иммунный ответ, а также на фагоцитоз макрофагов.

Сумму водорастворимых полисахаридов из корневищ аира болотного получают двукратной экстракцией водой, осаждением полисахаридов двукратным объемом 96% этанола, центрифугированием и высушиванием осадка.

В качестве препарата сравнения использовали настойку эхинацеи пурпурной («ГаленоФарм», г.Санкт-Петербург, разрешена к применению на территории России, рег. №000167.01-2000).

Эксперименты по изучению влияния водорастворимых полисахаридов (ПАБ), полученных из корневищ аира болотного, на гуморальный иммунный ответ были проведены на 36 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 12 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно (контроль); 12 мышей получали деалкоголизированный экстракт эхинацеи пурупурной (ЭЭП), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно (опыт 1) - прототип; 12 мышей получали водорастворимые полисахариды (ПАБ), полученные из корневищ аира болотного, которые вводили животным в течение 5 дней в дозе 10 мг/кг в объеме 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно (опыт 2) - предлагаемое средство. При изучении гуморального иммунного ответа мышей всех групп иммунизировали минимальными дозами эритроцитов барана (ЭБ) - 5×10⁶/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл) в конце 5-дневного курса введения ПАБ, ЭЭП или воды для инъекций [8]. На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общепринятыми методами [4] общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×10⁶) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей по методу Cunningham [11] и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови с помощью стандартной реакции гемагглютинации (РГА) [3].

Эксперименты по изучению влияния водорастворимых полисахаридов (ПАБ), полученных из корневищ аира болотного, на фагоцитоз перитонеальных макрофагов были проведены на 18 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 6 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно (контроль); 6 мышей получали деалкоголизированный экстракт эхинацеи пурупурной (ЭЭП), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно (опыт 1) - прототип; 6 мышей получали водорастворимые полисахариды (ПАБ), полученные из корневищ аира болотного, которые вводили животным в течение 5 дней в дозе 10 мг/кг в объеме 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно (опыт 2) - предлагаемое средство. Фагоцитарная активность макрофагов перитонеального эксудата оценивалась через 72 ч после окончания 5-дневного курса введения ПАБ, ЭЭП или воды для инъекций по способности этих клеток поглощать суточную культуру St.aureus, штамм 209 (получена с кафедры микробиологии Сибирского государственного медицинского университета; концентрация взвеси микробов - 20 млн/мл); учитывали процент макрофагов, поглотивших микробы (фагоцитарный индекс - ФИ), и среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ) [8].

Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты, подтверждающие иммуностимулирующие свойства водорастворимых полисахаридов, полученных из корневищ аира болотного.

Пример 1. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт эхинацеи пурупурной (ЭЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно. Мышам 2-й опытной группы вводили водорастворимые полисахариды (ПАБ), полученные из корневищ аира болотного, в течение 5 дней в дозе 10 мг/кг в объеме 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно. Затем мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана - 5×10 /мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл). На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×10⁶) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови. Курсовое введение экстракта эхинацеи пурпурной не оказывало существенного влияния на гуморальный иммунный ответ экспериментальных животных по сравнению с контролем (табл.1). Анализ результатов, представленных в таблице 1, показывает,

Таблица1
Влияние водорастворимых полисахаридов (ПАБ), полученных из корневищ аира болотного, и экстракта эхинацеи пурпурной (ЭЭП) на гуморальный иммунный ответ мышей линии СВА/Са Lac, (X±m)Группа мышейПоказателиСроки исследования4 сут7 сутКонтроль (ЭБ)ОКС, 10⁶/орган200,6±11,25193,8±18,86АОК, %11,26±0,4213,10±0,89АОК, 10⁶/орган22,62±1,6125,64±3,68IgM, log₂T3,00±0,004,0±0,55IgG, log₂T0,00±0,003,0±0,55Опыт 1 (ЭЭП+ЭБ)ОКС, 10⁶/орган194,60±10,18198,20±9,06АОК, %9,72±0,6112,90±0,92АОК, 10⁶/орган18,74±0,7525,68±2,49IgM, log₂T3,0±0,03,2±0,37IgG, log₂T0,2±0,23,6±0,24Опыт 2 (ПАБ+ЭБ)ОКС, 10⁶/орган196,2±12,67232,2±22,96АОК, %9,69±0,7318,54±0,69*#АОК, 10⁶/орган18,79±1,2742,89±4,21*#IgM, log₂T3,0±0,03,0±0,0IgG, log₂T4,0±1,22*#5,40±0,81*Примечания: здесь и в табл.2
* - различия с соответствующими значениями контроля достоверны;
# - различия с соответствующими значениями группы «опыт 1» достоверны.

что курсовое 5-дневное введение водорастворимых полисахаридов, полученных из корневищ аира болотного, приводило к повышению титра специфических гемагглютининов класса IgG на 4-е сут после иммунизации как по сравнению со значениями в контрольной группе, так и в группе с введением экстракта эхинацеи пурпурной. На 7-е сут после введения ЭБ в группе мышей, получивших курсовой прием ПАБ (опыт 2), наблюдалось значительное увеличение как относительного, так и абсолютного содержания АОК в селезенках экспериментальных животных, что было достоверно выше относительно контроля и группы мышей с введением ЭЭП (опыт 1). Повышение количества АОК в группе животных, получивших ПАБ, сопровождалось увеличением их функциональной активности, что выражалось в нарастании титров специфических гемагглютининов. Так, на 7-е сут после иммунизации титр антител класса IgG в этой экспериментальной группе был достоверно выше контрольных значений.

Пример 2. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт эхинацеи пурупурной (ЭЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно. Мышам 2-й опытной группы вводили водорастворимые полисахариды (ПАБ), полученные из корневищ аира болотного, в течение 5 дней в дозе 10 мг/кг в объеме 0,2 мл воды для инъекций внутрибрюшинно. Через 72 ч оценивали фагоцитарную активность макрофагов перитонеального экссудата мышей всех групп по способности этих клеток поглощать суточную культуру St.aureus, штамм 209 (получена с кафедры микробиологии Сибирского государственного медицинского университета; концентрация взвеси микробов - 20 млн/мл); учитывали процент макрофагов, поглотивших микробы (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ).

Приведенные в таблице 2 результаты этих опытов показывают, что и ПАБ, и ЭЭП существенно стимулируют фагоцитоз (по сравнению с контрольной группой) как за счет повышения доли макрофагов, способных поглощать стафилококки (ФИ), так и за счет увеличения количества поглощенных каждой клеткой микроорганизмов (ФЧ).

Таблица 2
Влияние водорастворимых полисахаридов (ПАБ), полученных из корневищ аира болотного, и экстракта эхинацеи пурпурной (ЭЭП) на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей линии СВА/Са Lac (X±m)Группа мышейФИ (%)ФЧКонтроль63,20±3,355,14±0,40Опыт 1 (ЭЭП)84,20±2,01*10,24±0,93*Опыт 2 (ПАБ)89,40±2,29*10,52±0,47*

Таким образом, водорастворимые полисахариды, полученные из корневищ аира болотного, проявляют иммуностимулирующие свойства, что выражается в усилении гуморального иммунного ответа (повышение количества антителообразующих клеток и титра специфических гемагглютининов) и фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов, сравнимой по выраженности с экстрактом эхинацеи пурупурной.

Источники информации

1. Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Крылова С.Г. Лекарственные растения как средства дополнительной терапии для лечения опухолей // Бюл. экспер. биол. - 2003. - Прил. 2. - С.24-34.

2. Вершинина С.Ф., Потявина Е.В. Применение природных биорегуляторов в онкологии // Вопросы онкологии. - 2003. - Т.49. - №2. - С.145-151.

3. Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С.211-218.

4. Иммунология: Практикум / Е.У.Пастер, В.В.Овод, В.К.Позур, Н.Е.Вихоть. - К.: Выща шк. Изд-во при Киев. ун-те, 1989. - С.202-204.

5. Лесков В.П. Иммуностимуляторы // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 1999. - №4. - С.12-25.

6. Линов Б.М., Барнаулов О.Д., Крылов В.А. и др. Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. - Томск, 1986. - С.89-90.

7. Самородов В.Н., Поспелов С.В., Моисеева Г.Ф. и др. Фитохимический состав представителей рода эхинацеа (Echinacea Moench.) и его фармакологические свойства (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 1996. - №4. - С.32-37.

8. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и соавт. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фарм. Комитета. - 1999. - №1. - С.31-36.

9. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. - 1996. - Т.74. - №8. - С.7-12.

10. Шеховцова Е.Г., Блинова К.Ф. Динамика накопления эфирного масла в аире обыкновенном в период вегетации / Вторая республиканская конференция по медицинской ботанике. Тезисы докладов. - Киев, 1988. - С.326-327.

11. Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature.- 1965.-V.207, №5001. - Р.1106-1107.

12. Percival S.S. Use of echinacea in medicine // Biochem. Pharmacol. - 2000. - Vol.60. - №2. - Р.155-158.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему иммуностимулирующей активностью. Средство, обладающее иммуностимулирующим действием, представляющее собой водорастворимые полисахариды, выделенные путем двукратной экстракции водой корневищ аира болотного, осаждения полисахаридов двукратным объемом 96% этанола, центрифугирования и высушивания. Средство обладает повышенным иммуностимулирующим действием. 2 табл.

Средство, обладающее иммуностимулирующим действием, характеризующееся тем, что представляет собой водорастворимые полисахариды, выделенные путем двукратной экстракции водой корневищ аира болотного, осаждения полисахаридов двукратным объемом 96% этанола, центрифугирования и высушивания.