СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2010 года по МПК A61K36/28 A61P37/04 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, влияющих на иммунную систему.

В настоящее время в комплексной терапии хронических, вялотекущих и рецидивирующих заболеваний применяют ряд препаратов, усиливающих иммунный ответ [6, 10]. К синтетическим иммуностимуляторам относится левамизол, метилурацил, лейкоген, ряд пептидных иммуностимуляторов (тимоген, иммунофан и др.) [5]. Однако использование препаратов, полученных методом химического синтеза, зачастую невозможно в силу их узконаправленного действия и массы побочных эффектов, в частности развития аллергических, аутоиммунных и лейкопролиферативных заболеваний. Из растительных препаратов, стимулирующих реакции иммунитета, наиболее известны препараты на основе эхинацеи пурпурной (иммунал, иммунорм, доктор Тайсс настойка эхинацеи) [7, 8, 12]. Препараты иммунал и иммунорм содержат сок, полученный из свежесобранной травы цветущей эхинацеи пурпурной, Доктор Тайсс - настойку листьев эхинацеи. Использование лекарственных растений представляется перспективным направлением дальнейшего развития, совершенствования методов иммунореабилитации, так как препараты природного происхождения не обладают токсическими свойствами, характерными для синтетических лекарственных средств, и не вызывают дисбаланса системы иммунитета [1, 2].

Целью изобретения является расширение арсенала иммуностимулирующих средств.

Поставленная цель достигается использованием в качестве иммуностимулирующего средства жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола.

Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ X1, том 2, стр.160). Основными биологически активными веществами корней лопуха большого и войлочного являются полисахариды (инулин до 45%), фенилпропаноиды, жирные кислоты, соли калия, кальция и магния. В современной медицинской практике корни лопуха большого и войлочного используются в качестве противовоспалительного, обволакивающего и отхаркивающего средства [5].

Новым в предлагаемом изобретении является то, что жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного, полученный с использованием сырья в соотношении 1:1, с помощью 40% этанола впервые предложен для использования в качестве иммуностимулирующего средства.

Использование жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола с использованием сырья в соотношении 1:1, в качестве иммуностимулирующего средства в литературе не описано. Применение по новому назначению стало возможно благодаря обнаружению у него новых свойств, а именно стимуляции гуморального иммунного ответа и неспецифической резистентности. Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. Жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного можно использовать у больных с хроническими, вялотекущими и рецидивирующими инфекционными заболеваниями, на фоне лучевой терапии и лечения цитостатиками.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленная применимость".

Новые свойства жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.

Для установления иммуностимулирующих свойств жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола было изучено его влияние на гуморальный иммунный ответ, а также на неспецифическую резистентность организма. Жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного получали методом реперколяции с помощью 40% этанола в соотношении используемого сырья 1:1. Для получения экстракта: 0,450 кг воздушно-сухого сырья корней лопуха измельчают на измельчителе типа траворезки до частиц размером 3-4 мм. Затем измельченное сырье при помощи сита со стороной отверстия 0,25 мм освобождают от пыли (частиц менее 0,25 мм) и получают 0,400 кг готового сырья. Экстракцию ведут методом реперколяции в 4 перколяторах. Для этого 0,100 кг измельченного и освобожденного от пыли сырья помещают в перколятор 1 и заливают 500 мл 40% этанола до образования "зеркала" и оставляют на 12 ч при температуре 18-20°С. После 12 часов настаивания из перколятора 1 сливают 500 мл извлечения и заливают им 0,100 кг готового сырья в перколяторе 2 до образования "зеркала" с одновременной подачей в перколятор 1 аликвотного количества свежего экстрагента. После 12 часов настаивания из перколяторов 1 и 2 сливают последовательно по 500 мл извлечения. При этом перколятор 1 пополняется свежим экстрагентом, а перколятор 2 - извлечением из перколятора 1, перколятор 3 - извлечением из перколятора 2. Таким образом, повторяют операцию до четвертого перколятора через каждые 12 ч. После 12 часов настаивания осуществляют последовательную передвижку извлечений в объеме 500 мл от перколятора 1 к перколятору 4, из перколятора 4 сливают в отдельную склянку 100 мл извлечения - готового продукта стадии экстракции сырья, а из перколятора 1 сливают остатки извлечения (побочный продукт) в отдельную емкость, после чего оставшийся в сырье этанол вымывают двукратным количеством воды (рекуперат). Перколятор 1 освобождают от отработанного сырья. Далее в таком же порядке через каждые 12 часов производят передвижку извлечений, исключая из работы сырье из перколятора 2, 3, и производят слив готового продукта (жидкого экстракта) из перколятора 4. В остановочном периоде из последнего перколятора (4) через 12 часов сливают 100 мл извлечения и объединяют с извлечениями, полученными в рабочий период, и получают 400 мл жидкого экстракта, который отстаивают при температуре 3-5°С в течение 3-4 суток и фильтруют через 3 слоя бязи. Перед введением экстракт подвергают деалкоголизации путем выдерживания в термостате при температуре 37°С в течение 30 минут.

Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ XI, том 2, стр.160). В качестве препарата сравнения использовали настойку эхинацеи пурпурной («ГаленоФарм», г.Санкт-Петербург, разрешена к применению на территории России, рег. №000167.01-2000).

Эксперименты по изучению влияния экстракта корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ), взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, на гуморальный иммунный ответ были проведены на 60 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 20 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 20 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 20 мышей получали деалкоголизированный ЭЛ, который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. При изучении гуморального иммунного ответа мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) - 6×10⁸/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл) в конце 5-дневного курса введения ЭЛ, ЭП или дистиллированной воды [9]. На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общепринятыми методами [4] общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×10⁶) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей по методу Cunningham [11] и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови с помощью стандартной реакции гемагглютинации (РГА) [3].

Эксперименты по изучению влияния экстракта корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, на неспецифическую резистентность организма были проведены на 30 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 10 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 10 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 10 мышей получали деалкоголизированный экстракт корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. Оценку неспецифической резистентности проводили путем изучения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов в тесте поглощения частиц латекса [4].

Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты, подтверждающие иммуностимулирующие свойства жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола.

Пример 1. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Затем мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана - 6×10⁸/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл). На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×10⁶) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови. Курсовое введение настойки эхинацеи пурпурной приводило к достоверному увеличению относительного количества антителообразующих клеток на 4-е и 7-е сут после иммунизации и абсолютного числа антителопродуцентов на 4-е сут эксперимента по сравнению с контролем (табл.1). Кроме того, отмечалось повышение титра иммуноглобулинов класса G на 4-е сут. Анализ результатов, представленных в таблице 1, показывает, что курсовое 5-дневное введение экстракта корней лопуха большого и войлочного приводило к увеличению общей клеточности лимфоидного органа, относительного и абсолютного числа антителообразующих клеток и титра IgM относительно животных контрольной и 1-й опытной групп во все сроки исследования.

Таблица 1 Влияние экстракта корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на гуморальный иммунный ответ мышей линии СВА/Са Lac, (X±m) Группа мышей Показатели Сроки исследования 4 сут 7 сут Контроль (ЭБ) ОКС, 10⁶/орган 159,20±16,50 149,8±7,71 АОК, % 7,36±0,10 7±0,21 АОК, 10⁶/орган 11,72±1,23 10,47±0,57 IgM, log₂T 2±0,32 2,2±0,32 IgG, log₂T 8,4±0,75 7,30±0,50 Опыт 1 (ЭП+ЭБ) ОКС, 10⁶/орган 190,00±22,67 163,00±10,85 АОК, % 11,44±0,49* 5,64±0,19* АОК, 10⁶/орган 21,89±3,20* 9,22±0,77 IgM, log₂T 2±0,32 1,2±0,49 IgG, log₂T 10,4±0,25* 10±0,32 Опыт 2 (ЭЛ+ЭБ) ОКС, 10⁶/орган 208,6±10,74* 224,6±10,04*# АОК, % 14,76±0,67*# 12,76±0,31*# АОК, 10⁶/орган 30,67±1,55*# 28,76±1,91*# IgM, log₂T 4,8±0,26*# 3,9±0,22*# IgG, log₂T 8,2±1,12 9,2±0,50 Примечания: здесь и в табл.2 * - различия с соответствующими значениями контроля достоверны; # - различия с соответствующими значениями группы «опыт 1» достоверны.

Пример 2. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); животные 1-ой опытной группы получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно; мыши 2-ой опытной группы получали деалкоголизированный экстракт корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. На 4 и 7 сут после окончания введения оценивали фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей всех групп по способности этих клеток поглощать частицы латекса (концентрация взвеси частиц - 60 млн/мл); учитывали процент нейтрофилов, поглотивших частицы (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число частиц, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ).

Приведенные в таблице 2 результаты опытов показывают, что экстракт корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, существенно стимулирует поглотительную активность нейтрофилов периферической крови (по сравнению с контрольной группой) как за счет повышения доли нейтрофилов, способных поглощать латекс (ФИ), так и за счет увеличения количества поглощенных каждой клеткой частиц (ФЧ) на 4 сут эксперимента.

Таблица 2 Влияние экстракта корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей линии СВА/Са Lac (X±m) Группа мышей 4 сут 7 сут ФИ (%) ФЧ ФИ (%) ФЧ Контроль 22±1,22 2,06±0,23 17,25±1,80 3,79±0,62 Опыт 1 (ЭП) 32±3,91* 4,72±0,45* 23,8±2,13 4,52±0,23 Опыт 2 (ЭЛ) 28,5±3,12* 6,64±0,08*# 21,6±0,98 4,93±0,31

Пример 3. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурупурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. На 4 и 7 сут после окончания введения оценивали фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей всех групп по способности этих клеток поглощать частицы латекса (концентрация взвеси частиц - 60 млн/мл); учитывали процент макрофагов, поглотивших частицы (фагоцитарный индекс - ФИ), и среднее число частиц, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ). Введение животным экстракта из корней лопуха большого и войлочного приводило к выраженному усилению фагоцитарной активности макрофагов по обоим исследуемым показателям во все сроки эксперимента как по сравнению с контрольной, так и 1-й опытной группой. При этом применение настойки эхинацеи вызывало повышение фагоцитарного индекса относительно контрольных мышей лишь на 4 сут.

Таблица 3 Влияние экстракта корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей линии СВА/Са Lac (X±m) Группа мышей 4 сут 7 сут ФИ (%) ФЧ ФИ (%) ФЧ Контроль 24,6±3,59 2,18±0,18 24,4±1,63 2,64±0,29 Опыт 1 (ЭП) 32,8±2,48 2,02±0,16 32±2,30* 2,20±0,21 Опыт 2 (ЭЛ) 41,4±2,05*# 3,44±0,07*# 48,8±1,32*# 3,82±0,20*#

Таким образом, жидкий экстракт из корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, проявляет иммуностимулирующие свойства, что выражается в усилении гуморального иммунного ответа (повышение общей клеточности лимфоидного органа, количества антителообразующих клеток и титра специфических гемагглютининов) и фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, сравнимые по выраженности с настойкой эхинацеи пурпурной. По степени стимуляции фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов жидкий экстракт из корней лопуха большого и войлочного существенно превышает настойку эхинацеи пурпурной.

Источники литературы

1. Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Крылова С.Г. Лекарственные растения как средства дополнительной терапии для лечения опухолей // Бюл. экспер. биол. - 2003. - Прил.2. - С.24-34.

2. Вершинина С.Ф., Потявина Е.В. Применение природных биорегуляторов в онкологии // Вопросы онкологии. - 2003. - Т.49. - №2. - С.145-151.

3. Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С.211-218.

4. Иммунология: Практикум / Е.У.Пастер, В.В.Овод, В.К.Позур, Н.Е.Вихоть. - К.: Выща шк. Изд-во при Киев. ун-те, 1989. - С.202-204.

5. Кьосев П. А. Полный справочник лекарственных растений. - М.: Изд-во Эксмо, 2003. - 922 с.

6. Лесков В.П. Иммуностимуляторы // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 1999. - №4. - С.12-25.

7. Линов Б.М., Барнаулов О.Д., Крылов В.А. и др. Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. - Томск, 1986. - С.89-90.

8. Самородов В.Н., Поспелов С.В., Моисеева Г.Ф. и др. Фитохимический состав представителей рода эхинацея (Echinacea Moench.) и его фармакологические свойства (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 1996. - №4. - С.32-37.

9. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и соавт.Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фарм. Комитета. - 1999. - №1. - С.31-36.

10. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. - 1996. - Т.74. - №8. - С.7-12.

11. Cunningham A. J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature. - 1965. - V.207, №5001. - P.1106-1107.

12. Percival S.S. Use of echinacea in medicine // Biochem. Pharmacol. - 2000. - Vol.60. - №2. - Р.155-158.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства, обладающего иммуностимулирующим действием, представляющего собой жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, полученный методом реперколяции 40% этанолом. Средство расширяет арсенал иммуностимулирующих средств, усиливает гуморальный иммунный ответ, фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов. 3 табл.

Средство, обладающее иммуностимулирующим действием, характеризующееся тем, что оно представляет собой жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, полученный методом реперколяции 40% этанолом.