СТИМУЛЯТОР ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЭУКАРИОТОВ И ПРОКАРИОТОВ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии, микробиологической промышленности, биотехнологии, а именно к стимуляторам жизнедеятельности микроорганизмов для улучшения показателей их жизнедеятельности и накопления микробных метаболитов, полезных для практического применения, и может быть использовано при промышленном и лабораторном получении тканевых культур, питательных сред, сывороток, вакцин и других микробных, вирусных и бактерийных препаратов.

В микробиологической промышленности при выращивании микроорганизмов, как эукариотов, так и прокариотов, большое значение имеет присутствие стимуляторов жизнедеятельности, наличие которых позволяет увеличивать выход и скорость накопления биомассы и, следовательно, сокращать время продуцирования микробных метаболитов, что особенно важно при промышленном производстве микробиологической продукции, а также при диагностировании. В качестве стимуляторов жизнедеятельности микроорганизмов используют как индивидуальные соединения, такие как витамины, аминокислоты, микроэлементы, пуриновые или пиримидиновые основания, так и сложные смеси, включающие ряд биологически активных веществ.

Известен биостимулятор, представляющий собой экстракт кормовых дрожжей, который используют для роста биомассы микроорганизмов [1], в частности, при производстве питательных сред, для выращивания биомассы трепонем [2, 3].

К недостаткам биостимулятора можно отнести низкую активность стимулятора, что приводит к использованию его в больших количествах, составляющих 10-20% от композиции питательной среды.

Основная задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в создании универсального биостимулятора, оказывающего стимулирующее действие на жизнедеятельность, в частности, на рост биомассы микроорганизмов, как эукариотов, так и прокариотов, при использовании его даже в небольших количествах.

Задача решена тем, что в качестве стимулятора жизнедеятельности микроорганизмов использованы экстракты плаценты, полученные при обработке интактной плаценты полярным растворителем [4].

Интактная плацента - это плацента, не разделенная на части, содержащая амнион, хорион, пуповину, крупные кровеносные сосуды и мелкие капилляры, наполненные кровью, которая сохранила максимально возможное количество биологически активных веществ, присущих нативной плаценте.

Использование в качестве биостимулятора микроорганизмов экстрактов, полученных из интактной плаценты, обусловлено стимулирующим действием биологически активных компонентов, содержащихся в нативной плаценте, включая кровь.

Влияние крови или сыворотки крови при культивировании микроорганизмов широко используют в микробиологии. В нативном состоянии сыворотку крови рекомендуют включать в среду для культивирования L-форм микобактерий туберкулеза. Например, среда Банич с использованием 10% сыворотки крови превосходит по культивированным свойствам среды Левенштейна-Йенсена и Шула. При добавлении в среду Школьниковой свежей человеческой плазмы улучшает культуральные свойства в 9 раз. Среда WS3E, содержащая 30% сыворотки крови плода коровы, поддерживает рост M.Leprae. Сыворотку крови в количестве 10-20% используют для роста пневмококков и менингококков [5].

Плацентарный препарат в виде бульона входит в состав питательной среды для выделения уреаплазм, но в качестве питательной основы [6]. Стимулирующая активность плацентарного бульона даже при содержании его в составе питательной среды в количестве 70-80% невелика, поэтому в состав питательной среды в качестве биостимуляторов также входят экстракт кормовых дрожжей, лошадиная сыворотка и гидролизат казеина.

Эффективность использования экстрактов интактной плаценты в качестве биостимуляторов микроорганизмов показана при исследовании влияния биостимулятора на рост биомассы эукариотов - диплоидных клеток человека, а также дрожжей и на рост биомассы прокариотов, при культивировании микроорганизмов трудно растущих культур.

Исследования на культуре клеток фибробластов человеческого эмбриона (эукариотов) показали, что экстракты плаценты оказывают воздействие на увеличение массы белка (метод Лоури). По активности лактатдегидрогеназы оценивают степень повреждения цитоплазматической мембраны. При длительных инкубациях клеток с исследуемым препаратом в течение 16-24 часов этот показатель отражает интенсивность анаэробного гликолиза и является показателем скорости размножения клеток в культуре, поскольку коррелирует с общим содержанием белка.

Пример 1. В качестве клеточной культуры использованы диплоидные клетки фибробластов человека.

В качестве биостимулятора микроорганизмов использованы экстракты интактной плаценты в растворе этанола, ацетона и пропиленгликоля с концентрацией 0,1-0,00001%.

Оценку метаболического состояния клеток проводили по двум параметрам:

1. прирост биомассы клеток по содержанию белка (метод Лоури);

2. изменение интенсивности клеточного дыхания (нитро-тетразолиевый тест, НТТ). Все препараты тестировали в начальном разведении 1:10, затем проводили последовательные 10-кратные разведения. Инкубацию клеток с препаратами проводили в бессывороточной среде.

Метод Лоури.

Фибробласты выращивали в 24-луночных планшетах в ростовой питательной среде Игла 24 часа при 37°С до образования конфлюэнтного монослоя. Затем ростовую среду сливали и добавляли по 1 мл тестируемых препаратов и инкубировали 2 часа при 37°С. Затем раствор тестируемых образцов сливали и к клеткам добавляли по 1 мл стерильной дистиллированной воды для создания гипотонического шока клеток. При этом оболочка клеток разрушается и цитозольное содержимое выходит из клетки.

В пробирки разливали по 2 мл смеси реактивов (растворы натрия карбоната в натрия гидроксиде и сульфата меди в натрия цитрате), добавляли к ним по 0,4 мл надклеточной воды из лунок и выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Затем в пробирки добавляли по 0,2 мл реактива Фолина-Чокальтеу и выдерживали в течение 40 мин при комнатной температуре. Спектрофотометрически определяли оптическую плотность полученных растворов при длине волны 540 нм. Для контроля использовали растворы используемых реактивов в ростовой среде. Результаты анализа в табл.1.

Нитро-тетразолиевый тест.

Аналогично методу Лоури проводили совместную инкубацию клеток с растворами тестируемых препаратов в течение 2 часов при 37°С. Затем растворы сливали, промывали лунки буфером "для трипсина" и добавляли по 0,5 мл 0,5% раствора красителя нитро-синего тетразолия; проводили дальнейшую инкубацию в течение 4 часов при 37°С. После этого раствор красителя сливали, добавляли по 1,5 мл этилового спирта 96% для экстракции образовавшихся в клетках кристаллов формазана. Далее измеряли оптическую плотность окрашенного спиртового раствора при длине волны 550 нм. Результаты анализа в табл.2.

По результатам анализа установлено:

- спиртовые и ацетоновые экстракты интактной плаценты с разведения 1:1000 не изменяют дыхательную функцию клеток на фоне значительного прироста биомассы клеточной культуры.

- Пропиленгликолевый экстракт интактной плаценты снижает дыхательную активность клеток, однако это не влияет на значительный прирост биомассы клеточной культуры.

По результатам анализа методом Лоури установлено, что биомасса клеток увеличивается в 7-14 раз по сравнению с контролем. Увеличение биомассы происходит или за счет скорости размножения клеток, или за счет увеличения массы клеток, и в том, и в другом случае увеличивается выход метаболитов.

Пример 2. Для определения влияния биостимулятора на рост труднорастущих микроорганизмов были поставлены опыты с использованием тест-культур Streptococcus pneumoniae ATCC49619.

В качестве биостимулятора использован экстракт плаценты в ацетоне в концентрации 0,0005%.

Питательная среда - мясопептонный бульон (МПБ) с добавлением 1% глюкозы.

Инокулюм: 10⁵ КОЕ/мл. Инкубация при 37°С.

Опыт - 5,0 мл ацетонового экстракта плаценты на 1 л МПБ с 1% глюкозы.

Контроль - МПБ с 1% глюкозы.

Через 14 часов отчетливый типичный рост в опытных пробирках и практически никакого роста в контроле.

Через 24 часа в опытных пробирках типичный для данного штамма рост, близкий по плотности биомассы стандарту №5 ГНИСК. В контроле рост незначительный (10¹ КОЕ/мл).

Пример 3. В качестве тест-культуры дрожжей использованы следующие культуры: C.Albicans ATCC10231; C.maltosa.

В качестве биостимулятора микроорганизмов использованы экстракты интактной плаценты в растворе ацетона и пропиленгликоля с концентрацией 0,0005%.

Питательная среда-среда Сабуро. Инокулюм: 101-105 КОЕ/мл.

Опыт - 5,0 мл ацетонового экстракта плаценты на 1 л среды Сабуро;

- 5,0 мл пропиленгликолевого экстракта плаценты на 1 л среды Сабуро.

Контроль - среда Сабуро.

Через 6 часов наблюдается начало роста в опытных пробирках.

Через 18 часов активный рост (10⁷ КОЕ/мл) культур в опытных пробирках и отсутствие роста в контроле.

Пример 4. В качестве тест-культуры использованы труднорастущие (анаэробы) - Cl.

Tercium#177.

В качестве биостимулятора микроорганизмов использованы экстракты интактной плаценты в растворе пропиленгликодя с концентрацией 0,0005%.

Питательная среда- СКС+199. Инокулюм: 101-105 КОЕ/мл.

Опыт - 5,0 мл пропиленгликолевого экстракта плаценты на 1 л среды СКС+199.

Контроль - среда СКС+199.

Через 9 часов наблюдается начало роста в опытных пробирках. Прирост объема массы тест-культуры по сравнению с контролем составил 234-297%.

Таблица 1 Определение концентрации белка по методу Лоури№ опытаОбразецРазведениеОП при 540 нмДостоверность, %Белок, % от контроля1КК-0,01685981002ЭПЭ1:10000,1186 7233ЭПЭ1:100000,1224507464ЭПЭ1:1000000,1008906145ЭПА1:10000,2270 13846ЭПА1:100000,18319212237ЭПА1:1000000,1585909678ЭПП1:10000,2091 12759ЭПП1:100000,167690102210ЭПП1:1000000,1472901009Обозначения:
КК - контроль клеток
ЭПЭ - экстракт плаценты в этаноле
ЭПА - экстракт плаценты в ацетоне
ЭПП - экстракт плаценты в пропиленгликоле

Таблица 2Оценка активности клеточного дыхания в нитро-тетразолиевом тесте№ опытаОбразецРазведениеОП при 550 нм% от контроля1КК-0,09990100,02ЭПЭ1:1000 96,23ЭПЭ1:100000,0985898,64ЭПЭ1:1000000,0983998,55ЭПА1:1000 96,36ЭПА1:100000,0965696,67ЭПА1:1000000,0980798,28ЭПП1:10000,0830083,09ЭПП1:100000,0710071,010ЭПП1:1000000,0741974,0

Источники информации

1. Патент RU №2084171, A23J 1/18, С12Р 13/04, C12N 1/06, C12N 1/16.

2. Инструкция по изготовлению питательной среды для контроля живых вакцин ВНИИ противочумный институт "МИКРОБ", Саратов, утв. 28.09.1981.

3. Патент RU №2198920, C12N 1/20, C12Q 1/04.

4. Патент RU №2246308, А61К 35/50.

5. А.З.Равилов, Р.Я.Гильмутдинов, М.И.Хусаинов. Микробиологические среды. 1999, Казань, Изд. ФЭН.

6. А.с. 1723128, C12Q 1/04.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном и лабораторном получении тканевых культур, питательных сред, сывороток, вакцин и других микробных, вирусных и бактерийных препаратов. Применение в качестве стимулятора жизнедеятельности эукариотов и прокариотов экстракта интактной плаценты в количестве, не превышающем 0,001%, позволяет значительно увеличить рост биомассы микроорганизмов. 6 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Применение экстракта интактной плаценты в качестве стимулятора жизнедеятельности эукариотов и прокариотов.2. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт интактной плаценты получен экстракцией полярным растворителем.3. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт интактной плаценты получен экстракцией гидрофильным органическим растворителем.4. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт интактной плаценты получен экстракцией алифатическим спиртом.5. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт интактной плаценты получен экстракцией этанолом.6. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт интактной плаценты получен экстракцией пропиленгликолем.7. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт интактной плаценты получен экстракцией ацетоном.