СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СНИЖЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА БОЛЬНЫХ ЛЕЙКОЗАМИ К ИНФЕКЦИИ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в онкогематологической практике.

Известно, что защиты от инфекции обеспечивается клеточным, гуморальным звеном специфической иммунологической реактивности, а также участием комплекта и фагоцитоза [6]
Повышение содержания супрессорных лимфоцитов, а также усиление их функциональной активности приводит к развитию иммунодефицита [3] что может явиться причиной развития осложнений бактериальной или вирусной природы.

Наиболее близким к заявленному способу является оценка состояния иммунной системы с помощью индекса супрессии, который вычисляется как отношение Т-лимфоцитов к количеству теофиллин-чувствительных клеток [4]
Предложенный способ имеет недостатки: при составлении индекса супрессии учитывается не вся популяция супрессивных лимфоцитов, так как известно, что лимфоциты, экспрессирующие рецепторы к Fc-фрагменту I₀C (Fc⁺ - лимфоциты) также обладают супрессорной функцией [1, 3]
Целью предложенного изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что определяют содержание Т-тотальных лимфоцитов, Т-супрессоров и Fc⁺-лимфоцитов, рассчитывают индекс супрессии как отношение T-тотальных лимфоцитов к сумме T-супрессоров Fc⁺-клеток и при величине этого индекса ниже 48% от нормальных значений судят о снижении устойчивости организма больных лейкозами к инфекции.

Способ осуществляют следующим образом: при поступлении больного в клинику наряду с общепринятыми клиническими методами проводят выделение лимфоцитов из венозной гепаринизированной крови в фиколл-верографиновом градиенте /= 1,076/, клетки трижды отмывают средой 199. Конечную концентрацию лимфоцитов доводят до 2,0•10⁶ клеток/мл.

Затем проводят определение количества Т-тотальных, Т-супрессорных и Fc⁺-лимфоцитов.

1. Определение содержания Т-тотальных проводили в реакции прямого розеткообразования с эритроцитами барана по методике Jondall etcel. К 0,2 мл взвеси эритроцитов /5%/ барана добавляли 0,2 мл взвеси лимфоцитов. Инкубировали 5 минут при комнатной температуре, центрифугировали 400 об/мин в течение 5 минут, затем инкубировали при +4^oC в течение 1 часа. Осадок ресуспендировали, заполняли камеру Горяева, где подсчитывали 200 лимфоцитов. Те из них, которые присоединили 3 и более эритроцитов барана, оценивали как "розеткообразующие", то есть Т-лимфоциты.

2. Выявление Т-супрессоров проводили с использованием отечественных моноклональных антител серии ИКО-31 при помощи пероксидазно-антипероксидазного ПАП метода [2] На предметные стекла наносили 3 капли клеточной суспензии лимфоцитов, стекла инкубировали при -4^oC в течение 10 15 минут для полного осаждения клеток. После удаления с каждой капли клеточной суспензии надосадочной жидкости капли высушивали, а затем фиксировали в течение 3 минут 10% формалином. На высушенные капли наносили по 20 мкл моноклональных антител серии ИКО-31, после чего стекла помещали во влажную камеру на 1 час. Затем остатком моноклональных антител смывали стерильным физиологическим раствором. После высушивания на каждую каплю наносили по 1 капле кроличьей антимышиной сыворотки, затем стекла помещали на 30 минут во влажную камеру при комнатной температуре. Мазки промывали физиологическим раствором и высушивали. На стекла наносили по 1 капле ПАП-реактива, помещали их во влажную камеру на 30 минут, после чего мазки вновь промывали физиологическим раствором и высушивали. Далее производили постановку гистохимической реакции: на каждую каплю наносили инкубационную смесь следующего состава: 3,3 диаминобензидин тетрахлорид в 10 мл забуференного раствора 5 мл и 0,02 мл 3% перекиси водорода.

После 10 минут инкубации мазки смывали, высушивали, ядра докрашивали 3 минуты 5% раствором метиленового зеленого. Учет реакции проводили с помощью светового микроскопа на основании подсчета 200 клеток. Затем пересчитывали число окрашенных клеток, которое соответствовало проценту лимфоцитов - Т-супрессоров.

3. Определение количества Fc⁺-лимфоцитов проводили в реакции ЕА-образования [5] Содержимое ампулы "Диагностикума для определения ревматоидного фактора" (ДРФ) растворяли и трижды отмывали большим объемом среды 199. Осадок ресуспендировали в 1 мл среды 199. Бараньи моноспецифические сыворотки против 1^oC человека пулировали в субагглютинирующем разведении. При периодическом помешивании смесь инкубировали при 37^oC в течение 30 минут. После этого ДРФ трижды отмывали средой 199, объем суспензии доводили до 2,0 мл. К 0,2 мл взвеси лимфоцитов добавляли 0,2 мл приготовленного препарата ДРФ, суспендировали и центрифугировали при 180 об/мин в течение 5 минут. После ресуспендирования каплю взвеси переносили в камеру Горячева. Те из клеток, которые присоединили 3 и более эритроцитов, оценивали как розеткообразующие, то есть несущие Fc⁺-рецепторы.

У 30 обследованных здоровых лиц индекс супрессии (ИС) составил 1,3 1,7, в среднем 1,58±0,01.

Примером конкретного осуществления способа могут служить выписки из истории болезни.

Пример 1. Б-й Х-ко, N ист. болезни 8864-1009, поступил в отделение по поводу хронического миелолейкоза. Гемограмма имела типичную для этого заболевания картину. При иммунологическом исследовании получены следующие результаты: Т-тотальные 30% Т-супрессоры 6% Fc⁺- лимфоциты 22% Индекс супрессии составил: 30:(6+22)=1,07, то есть был ниже нормальных величин на 32,3% У этого больного в процессе цитостатической терапии признаков инфекционно-воспалительных процессов не наблюдалось.

Пример 2. Б-ная Я-ая, N ист. болезни 4226-726, поступила в отделение по поводу хронического миелолейкоза с типичными клинико-гематологическими проявлениями этого заболевания. При иммунологическом исследовании получены следующие результаты: Т-лимфоциты 25% Т-супрессоры 5% Fc⁺ - лимфоциты 26% Индекс супрессии оказался равным 0,806 и был ниже нормальных величин на 49% В процессе терапии у больной диагностирована пневмония.

Пример 3. Б-ная К-ва, N ист. болезни 5315-278, поступила в отделение по поводу острого лейкоза. При иммунологическом исследовании выявлены следующие параметры: Т-лимфоциты 16% Т-супрессоры 4% Fc⁺ лимфоциты 22% Индекс супрессии составил 0,615, то есть был ниже нормальных значений на 61% У больной развилась тяжелая бронхопневмония.

Пример 4. Больная С-ко, N ист. болезни 52647-220 поступила в отделение по поводу острого лейкоза с типичным для этой патологии клинико-гематологического проявления. При исследовании иммунного статуса получены следующие данные: Т-лимфоциты 25% Т-супрессоры 4% Fc⁺-лимфоциты 16% Индекс супрессии в этом случае составил 1,25 и оказался ниже нормальных величин на 20,9% Признаков инфекционно-воспалительных процессов во время прохождения цитостатической терапии в данном случае не диагностировано.

Пример 5. Больной Т-к, N ист. болезни 56134-543 поступил в гемотологическое отделение по поводу обострения хронического лимфолейкоза. При иммунологическом исследовании обнаружены следующие результаты: Т-лимфоциты - 20% Т-супрессоры 6% Fc⁺-лимфоциты 26% Индекс супрессии в данном случае составил 0,625 и был ниже нормальных величин на 60,5. Через неделю после начала терапии у больного диагностирована тяжелая двусторонняя нижнедолевая пневмония.

Пример 6. Больной К-ин, N ист. болезни 55945-526 лечился в гематологическом отделении по поводу хронического лимфолейкоза. Иммунологические параметры: Т-лимфоциты 25% Т-супрессоры 5% Fc⁺-лимфоциты 17% Индекс супрессии 1,136 и оказался ниже нормальных величин на 28,1% Признаков инфекционно-воспалительных процессов не диагностировано.

Апробация способа проведена на 47 больных различными формами лейкозов, которые находились на лечении в Киевской областной клинической больнице.

Для оценки эффективности заявленного способа проведен сравнительный анализ с результатами, полученными при использовании способа-прототипа. При применении способа-прототипа ошибка в определении устойчивости организма к инфекции составила 39% тогда как при применении заявляемого способа она оказалась равной 19% Таким образом, точность способа повышена в 2,05 раза. Л и т е р а т у р а 1. Беклемишев Н.Д. Иммунопатология и иммунорегуляция // М. Медицина. 1986. 256 с. 2. Глузман Д.Ф. Надгорная В.А. Абраменко И.В. и др. Иммунопероксидазный метод определения антигенов поверхностных мембран нормальных и лейкозный клеток с использованием отечественных моноклональных антител // Экспер. онкология. 1986. N 6. С. 46-49. 3. Петров Р.В. Иммунология. -М. Медицина. 1982. 368 с. 4. Петров Р.В. Михайленко А.А. Оценка состояния здоровья практически здоровых лиц с помощью иммунологических показателей // Иммунология. 1990. N 1. С. 60-64. 5. Шергин С.М. Мусатов М.И. Кожевников В. С. Применение Стандартных формализированных эритроцитов, нагруженных гамма-глобулином, для определения клеток, несущих Fc-рецепторы // Лаб.дело. 1978. 13. С. 162-163. 6. Aiuti F. Luzi G. Clinical immunology of immunodeficiency diceases. Symptoms aud siugs of primary immunodeficiens // Ann. Clin. Res. 1987. v.19,4. p. 230-247. 7. Jondall M. Holm G. Wigzell H. Surface of human B-and T-lymphocytes // J. Exp. Med. 1972. v. 136. N 2. p. 207-212.

Использование: в области медицины, в частности в онкологии. Сущность изобретения: определяют содержание Т-тотальных лимфоцитов, Т-супрессоров, и Fc<M^ >+<D> - клеток в реакции прямого розеткообразования с эритроцитами барана, рассчитывают индекс супрессии как отношение Т-тотальных лимфоцитов к сумме Т-супрессоров и Fc<M^>+<D> - клеток и при величине этого индекса ниже 48% относительно нормы судят о снижении устойчивости организма больных лейкозами к инфекции. Способ позволяет повысить точность определения устойчивости организма к инфекции.

Способ определения снижения устойчивости организма больных лейкозами к инфекции путем исследования лимфоцитов крови, отличающийся тем, что определяют содержание Т-тотальных лимфоцитов, Т-супрессоров и Fс⁺-лимфоцитов, рассчитывают индекс супрессии как отношение количества Т-тотальных лимфоцитов к сумме Т-супрессоров и Fс⁺-лимфоцитов и при его значении менее 48% относительно нормы определяют снижение устойчивости организма больных лейкозами к инфекции.