СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ МИКРОАНГИОПАТИЙ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1-ГО ТИПА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/72 

Изобретение относится к области медицины, а именно эндокринологии, и может быть использовано для ранней диагностики микроангиопатий у больных сахарным диабетом 1 типа.

В настоящее время известны способы диагностики микроангиопатий сахарного диабета 1 типа на основе клинических, инструментальных и лабораторных данных (И.И.Дедов, М.И.Балаболкин, Е.И.Марова. Болезни органов эндокринной системы: Руководство для врачей - М., 2000. - С.197-228). Большинство из них позволяют определить наличие поздних сосудистых осложнений.

Достаточно широко с этой целью в клинической практике используются инструментальные способы. Для диагностики диабетической ретинопатии всем больным проводится офтальмологическое обследование, включающее: наружный осмотр глазного яблока, глазного дна, определение остроты зрения, исследование полей зрения, исследование переднего отдела глаза, тонометрию.

С целью диагностики синдрома диабетической стопы определяется вибрационная чувствительность (с помощью градуированного камертона 128 Гц и биотензиометра), температурная чувствительность (с помощью устройства «Тип-Терм»), тактильная чувствительность (с помощью монофиламента 10 г), рефлексы на ногах (коленный, ахиллов) и на руках (карпорациальный, с двуглавой и трехглавой мышщ), рентгенография стоп.

Для выявления диабетической нефропатии стадии микроальбуминурии (экскреции с мочой альбумина в пределах 30-300 мг/сут) пользуются тестами для определения микроальбуминурии.

Недостатками этих способов исследования является то, что они не позволяют диагностировать субклинически протекающие формы ангиопатий, которые проявляются только метаболическими нарушениями.

Известен также способ диагностики диабетической ретинопатии (Степанова И.С., Краморенко Ю.С. по патенту РФ №2071059, опубликованный 27.12.1996, заявка №5065877/14 от 17.08.1992) путем определения в сыворотке крови уровня тироксинсвязывающего гормона и при повышении значения этого показателя в 1,5 и более раза относительно контроля диагностируют диабетическую ретинопатию.

Из практики медицины известен способ-прототип диагностики сосудистых нарушений у женщин в период перименопаузы при сахарном диабете 2-го типа, заключающийся в определений фракций гемоглобина в венозной крови и увеличение процентного содержания их приводит к снижению кислородтранспортной функции гемоглобина, что является одной из причин гипоксии тканей на микроциркуляторном уровне (Сергеева Н.А., Макарова Л.Д., Григорян О.Р., Чернова Т.О., Анциферов М.Б. // Сахарный диабет. - 2001 - №3 - С.48-50). Однако этот способ имеет недостатки: он не позволяет диагностировать ранние микрососудистые осложнения сахарного диабета 1 типа.

Целью представленного изобретения является повышение точности ранней диагностики микроангиопатий у больных сахарным диабетом 1 типа (ретинопатии 1, нефропатии 1, полинейропатии).

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что одновременно определяют в крови больных содержание метгемоглобина и сульфгемоглобина, рассчитывают коэффициент трансформации метгемоглобина в сульфгемоглобин и при уровне метгемоглобина от 1,47 до 1,42%, и уровне сульфгемоглобина от 2,27 до 2,44%, и значении коэффициента трансформации метгемоглобина в сульфгемоглобин от 0,65 до 0,58 диагностируют ранние микрососудистые осложнения сахарного диабета 1 типа.

В настоящее время сахарный диабет (СД) стоит в одном ряду с проблемами государственной важности в силу его эпидемического характера и сосудистых осложнений. В РФ в 2000 г. было зарегистрировано более 8 млн больных СД и к 2025 г. это число возрастет до 12 млн (Дедов И.И., 2001-2004 гг.). Доля больных СД 1 типа составляет 7-10% от всех больных диабетом. Средняя продолжительность жизни (СПЖ) больных СД 1 типа на 12 лет меньше СПЖ больных СД 2 типа. СПЖ мужчин с СД 1 типа на 5 лет меньше, чем у женщин (Сунцов И.Ю., Кудрякова С.В., 2002 г.). В структуре смертности больных СД на первое место вышли поздние сосудистые осложнения - микроангиопатии (диабетическая нефропатия) и макроангиопатии (сердечно-сосудистые осложнения) (Юшков П.В., Опаленов К.В., 2001 г.).

Высокая частота у больных СД 1 типа поздних сосудистых осложнений, сложность и недостаточная изученность патогенеза, отсутствие надежных критериев диагностики их начальных проявлений служат поводом многочисленных научных исследований.

Гипоксии принадлежит одна из ведущих ролей в патоморфологии и патофизиологии СД (Галенок В.А., Диккер B.E., 1985 г.). Не вызывает споров тот факт, что на доставку кислорода (O₂) при СД существенное влияние может оказать и структурно-функциональное состояние кислород-транспортной системы крови, иными словами, состояние эритрона.

Эритрон является наиболее многочисленным и чрезвычайно функционально важным звеном многокомпонентной системы крови (Назаров С.Б., 1996 г.). Участие эритрона в патогенезе, течении и прогнозе СД неоднозначно и пока не совсем ясно. Как известно, эритроциты (Er) наряду с легкими и кожей первым воспринимают информацию о меняющейся среде (содержание O₂, CO₂ и др.).

Клинико-патогенетическое значение изменений эритрона при микроваскулярных осложнениях СД остается мало изученным, хотя измененные эритроциты играют существенную роль в механизме их формирования (Балашова Т.С. и соавт., 1996). Помимо широко распространенного представления о гипергликемии как основной причине гемореологических расстройств при СД 1 типа есть немало оснований полагать, что глубокие нарушения молекулярной организации клеточных мембран, лежащие в основе серьезных нарушений функциональной активности Er, играют существенную роль в формировании сосудистых осложнений СД 1 типа.

Hb способен взаимодействовать не только с O₂, CO₂, но и со многими другими веществами, которые называются лигандами (Bunn H.F., Forget B.G. Hemoglobin: Molecular, genetic and clinical aspects. - Philadelphia etc.: Saunders, 1986. - VII, 690 - Pill).

Понятие «лигандный спектр Hb» включает в себя Hb и те его дериваты, которые присутствуют в крови как у здоровых людей, так и при патологии, представляя собой соединения Hb с различными лигандами: восстановленный гемоглобин (Hb), HbO₂, MetHb, карбоксигемоглобин (Hb СО), сульфгемоглобин (SHb) или вердоглобин S, холеглобин или вердоглобин А, цианметгемоглобин (CNMetHb), нитрозогемоглобин (HbNO), метгемальбумин (MetAl) в плазме (Зеньков Л.Н. Некоторая модификация лабораторных исследований дериватов гемоглобина и редуктазной активности эритроцитов в крови больных. //Лаб. дело. - 1978. - №8. - С.494-495).

Большой интерес представляет структурно-функциональная характеристика и физиологическая роль MetHb. В организме человека постоянно возникают условия для эндогенного окисления железа, т.е. для образования MetHb прежде всего ввиду присутствия О₂ воздуха, продуктов межуточного обмена. По данным литературы, содержание MetHb в крови может достигать 2-5% и даже 10%, однако окончательная концентрация деривата обычно не превышает 1% от общего Hb. В последние годы возрос интерес исследователей к SHb, одному из пяти известных типов вердоглобинов (Балашов В.И., Резаев А.А., Ярыга В.В. Содержание гемоглобина и дериватов в крови детей, проживающих в (населенных пунктах санитарно-защитной зоны Астраханского газоперерабатывающего завода //Педиатрия. - 1995. - №2. - С.75-77). Hb в Er претерпевает ряд последовательных превращений: образование связи с глутатионом, окисление до MetHb, распад до SHb, преципитация белка в виде телец Гейнца. Следовательно, окисление Hb в SHb есть обычный этап его обмена в стареющем Er при участии гемоксигеназы. В молекуле SHb железо заблокировано для доступа молекулярного O₂, поэтому дериват не участвует в его транспорте. У здоровых лиц в крови SHb выявляется в следовых количествах - до 1% от общего Hb, хотя, по мнению некоторых авторов, говорить о «нормальном» уровне SHb затруднительно (Изучение сульфгемоглобина и его значение как показателя вредных химических воздействий на организм человека. /Отчет о НИР. Учебно-научно-лечебно-производственное ТОО «Тест» на базе АГМА. - Астрахань, 1996. - 25 с). Взаимоотношения между MetHb и SHb остаются не выясненными до конца.

У здоровых людей доля MetHb, способного трансформироваться в Hb с активной газотранспортной функцией, составляет более половины. Рассчитав отношение MetHb/HbS, мы получили коэффициент трансформации MetHb. Результаты расчета коэффициента трансформации MetHb/HbS до и после лечения больных СД 1-го типа представлены в таблице 1.

Видно, что у здоровых лиц коэффициент трансформации равен 1. У всех больных СД 1-го типа с микроангиопатиями отмечается снижение коэффициента трансформации MetHb/HbS от 0,65 до 0,58. После лечения коэффициент трансформации нормализовался у больных СД без сосудистых осложнений и у больных с ДН1 и ДР1. Нормализация после лечения соотношения MetHb/HbS у больных с начальными стадиями микроангиопатий может служить дополнительным критерием оценки тяжести сосудистых осложнений СД 1-го типа. Таким образом, коэффициент трансформации MetHb/HbS<1 у больных группы сравнения и больных с сосудистыми осложнениями СД 1-го типа свидетельствует об усиленном окислении значительной доли MetHb в HbS с дальнейшей деградацией Hb и создание условий для сдвига КДО вправо с улучшением диссоциации HbO₂.

Предложенный способ был успешно апробирован в эндокринно-терапевтическом отделении Городской клинической больницы №3 им. Кирова г.Астрахани с января 2003 г. по июнь 2005 г. на 130 больных сахарным диабетом 1-го типа. В группу обследуемых вошли больные сахарным диабетом 1-го типа, длительность заболевания которых составила не более 5 лет.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1. Больная В., 20 лет, № истории болезни 2955, поступила в плановом порядке в эндокринно-терапевтическое отделение ГКБ №3 им. Кирова 19.05.03 года с DS: Сахарный диабет 1-го типа, 2а степени тяжести, декомпенсированный.

Жалобы на сухость во рту, жажду, слабость. Больна сахарным диабетом в течение 4 лет. Лечилась амбулаторно. Получала инсулинотерапию.

Мать больной страдала сахарным диабетом и умерла в 52 года.

Отмечает ухудшение самочувствия в течение 2 недель: усилилась сухость во рту, жажда, в связи с чем была госпитализирована данное отделение. При объективном обследовании: умеренного питания. Кожные покровы бледные, слегка суховатые. В легких везикулярное дыхание. Хрипов нет. ЧДД 16 в мин. Тоны сердца приглушены. Ритм правильный. АД-120/80 мм рт.ст.

Язык сухой. Живот мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не пальпируются. Периферических отеков нет. Пульсация на a.dorzalis pedis сохранена.

Средняя суточная доза инсулина-48 ЕД.

Для определения концентрации общего Hb, MetHb, SHb, HbO₂ пользовались спектрофотометрическим методом (Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. /Под ред. В.В.Меньшикова. - М: Медицина, 1987 - 368 с.).

Принцип метода.

Методика измерения концентрации общего Hb основана реакции образования цианметгемоглобина (CNMetHb) и спектрофотометрическом отсчете оптической плотности раствора при длине волны 540 нм (в зеленой области спектра). Количество SHb определяется в результате измерения величин оптических плотностей при длине волны 620 и 650 нм после добавления к 1% раствору крови ацетонциангидрина. Для этих длин волн характерна большая разница в поглощении света между Hb, с одной стороны, и HbO₂, CNMetHb, с другой стороны. Обязательно предварительное определение концентрации MetHb при длине волны 630 нм (в красной области спектра) при внесении в кювету с 1% раствором крови ацетонциангидрина.

Реактивы:

1. 1/15 М раствор фосфатного буфера рН 6,7-6,8

2. 10% водный раствор ацетонциангидрина

3. Феррицианид

4. Гепарин 5000 ЕД/мл

Оборудование:

1. Спектрофотометр СФ №46 с кюветами 10 мм

2. Стеклянная мерная колба 25 мл

3. Пипетка 1 мл

4. Тонкая стеклянная палочка

Ход определения.

Кровь с гепарином (1 капля последнего на 10 мл крови) в количестве 0,25 мл вносили в колбу емкостью 25 мл, куда добавляли для гемолиза 10 мл дистиллированной воды и через 1-2 минуты 12,5 мл фосфатного буфера. Объем жидкости в колбе доводили водой до метки 25 мл. В результате чего получали 1% раствор крови исследуемого. Затем центрифугировали 10 минут при 4500 об/мин. Заполняли 10 мм кювету отцентрифугированным раствором и при контрольной кювете, заполненной водой, снимали отсчет оптической плотности при длине волны 630 нм (Д1). Далее в кювету вносили каплю 10% раствора ацетонциангидрина, осторожно помешивая тонкой стеклянной палочкой. Через 2-3 минуты производили отсчет при длине волны 630 нм (Д2), 620 нм (Д3), 650 нм (Д4). Затем в эту же кювету вносили 2-3 кристаллика феррицианида, помешивали и через 3 минуты измеряли величину оптической плотности при длине волны 540 нм спектрометрически (Д5).

Расчеты:

1. Концентрация MetHb в гемолизате:

С MetHb=(Д1-Д2)/3,6 м·экв/л

2. Концентрация общего НЬ без SHb в гемолизате:

С общего Hb без SHb=Д5/11,0 м·экв/л

3. Концентрация HbO2 в гемолизате:

С HbO2=С общего Hb без SHb - С MetHb м·экв/л 4-Концентрация SHb в гемолизате:

С SHb=(Д3-Д4-0,14·С HbO2-0,43·С MetHb)/6,25 м·экв/л

У данной больной уровень MetHb составил 1,47%, SHb 2,27%, коэффициент трансформации MetHb/HbS: 0,65, что позволило диагностировать микрососудистые осложнения. Однако при проведении дополнительного обследования (осмотр окулиста, сосудистого хирурга, проведение Микраль-Теста) микроангиопатии не выявление.

В динамике через 7 месяцев при повторном исследовании коэффициент трансформации MetHb/HbS: 0,64. При проведении дополнительного обследования больной был выставлен диагноз: Диабетическая нефропатия 1.

До лечения: креатинин крови - 79,3 мкмоль/л, СКФ - 132,8 мл/мин; микроальбуминурия - 50 мг/сут; гликемия натощак составила 7,8 ммоль/л; HbAlc - 9,03%;

После лечения:

креатинин крови - 72,3 мкмоль/л, СКФ - 122,7 мл/мин; микроальбуминурия - отр.; гликемия натощак составила 7,1 ммоль/л; HbAlc - 8,73%; коэффициент трансформации MetHb/HbS: 1,01.

Полученные данные позволили выявить больную с высоким риском развития микроангиопатии и диагностировать ранние микрососудистые осложнения.

Пример 2. Больной Л., 19 лет, № истории болезни 4424, поступил в плановом порядке в эндокринно-терапевтическое отделение ГКБ №3 им. Кирова 19.03.03 года с DS: Сахарный диабет 1-го типа, 2а степени тяжести, декомпенсированный.

Жалобы на сухость во рту, жажду, чувство тяжести в икроножных мышцах, стопах, слабость. Болен сахарным диабетом в течение 3 лет. Получал интенсифицированную инсулинотерапию. Ухудшение самочувствия в течение 3 недель, усилилась сухость во рту, жажда, слабость. Дедушка больного страдал сахарным диабетом и умер в 62 года.

При объективном обследовании: умеренного питания. Кожные покровы обычной окраски. В легких везикулярное дыхание. Хрипов нет. ЧДД 18 в мин. Тоны сердца ясные. АД-120/80 мм рт.ст. Язык суховат. Живот мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не пальпируются. Стопы теплые на ощупь. Пульсация на a.dorzalis pedis сохранена.

Суточная доза инсулина - 45 ЕД.

У данного больного уровень MetHb составил 1,42%, SHb 2,44%, коэффициент трансформации MetHb/HbS: 0,58, что позволило диагностировать микрососудистые осложнения. При проведении дополнительного обследования больному был выставлен диагноз: Диабетическая полинейропатия.

До лечения: гликемия натощак составила 9,1 ммоль/л; HbAlc - 8,9%;

Биотензиометрия - 15 В с обеих сторон. Тактильная и температурная чувствительность сохранена. Вибрационная чувствительность незначительно снижена.

После лечения: гликемия натощак составила 8,6 ммоль/л; HbAlc - 8,3%;

Биотензиометрия - 10 В с обеих сторон. Тактильная, температурная и вибрационная чувствительности сохранены. Коэффициент трансформации MetHb/HbS: 1,03

Полученные данные позволяют диагностировать ранние микрососудистые осложнения.

Пример 3 Больной П., 24 лет, № истории болезни 1735, поступил в плановом порядке в эндокринно-терапевтическое отделение ГКБ №3 им. Кирова 20.09.03 года с DS: Сахарный диабет 1-го типа, 2а степени тяжести, декомпенсированный.

Жалобы на незначительную сухость во рту, жажду, слабость. Болен сахарным диабетом в течение 4 лет. Лечился амбулаторно. Получал инсулиногерапию. Отмечает ухудшение самочувствия в течение 1,5 недель усилилась сухость во рту, жажда, слабость, в связи с чем был госпитализирован данное отделение.

Средняя суточная доза инсулина 46 ЕД

У данного больного уровень MetHb составил 1,44%, SHb 2,34%, коэффициент трансформации MetHb/HbS: 0,61, что позволило диагностировать микрососудистые осложнения. Однако при проведении дополнительного обследования (осмотр окулиста, сосудистого хирурга, проведение Микраль-Теста) микроангиопатии не выявлено.

В динамике через 9 месяцев при повторном исследовании коэффициент трансформации MetHb/HbS: 0,60. При проведении дополнительного обследования больному был выставлен диагноз: Диабетическая непролиферативная ретинопатия.

Проведены исследования.

До лечения

Глазное дно: бледно-розовое, границы четкие, вены расширены, извитые, артерии сужены, микроаневризиы.

Гликемия натощак составила 8,9±1,4 ммоль/л; HbAlc - 8,8%;

После лечения: гликемия натощак составила 8,6 ммоль/л; HbAlc - 8,3%;

Глазное дно: бледно-розовое, границы четкие. Коэффициент трансформации MetHb/HbS: 0,99.

Полученные данные позволили выявить больного с высоким риском развития диабетической микроангиопатии и диагностировать ранние микрососудистые осложнения.

Пример 4. Больная К., 20 лет, № истории болезни 4951, поступила в плановом порядке в эндокринно-терапевтическое отделение ГКБ №3 им. Кирова 19.07.03 года с DS: Сахарный диабет 1-го типа, впервые выявленный, декомпенсированный.

Жалобы на сухость во рту, жажду, слабость. Считает себя больной сахарным диабетом в течение 4 месяцев. Отмечает ухудшение самочувствия в течение 2 недель: усилилась сухость во рту, жажда, в связи с чем была госпитализирована данное отделение. В семье больных сахарным диабетом нет.

При объективном обследовании: умеренного питания. Кожные покровы бледные, слегка сухие. В легких везикулярное дыхание. Хрипов нет. ЧДД 16 в мин. Тоны сердца приглушены. Ритм правильный. АД-120/80 мм рт.ст.

Язык сухой. Живот мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не пальпируются. Периферических отеков нет. Пульсация на a.dorzalis pedis сохранена. Средняя суточная доза инсулина 48 ЕД.

Проведены исследования.

Глазное дно: бледно-розовое, границы четкие, вены расширены.

До лечения: креатинин крови - 79,3 мкмоль/л, СКФ - 102,8 мл/мин; микроальбуминурия - отр.; гликемия натощак составила 7,8 ммоль/л; HbAlc - 9,03%;

После лечения:

креатинин крови - 72,3 мкмоль/л, СКФ - 102,7 мл/мин; микроальбуминурия - отр.; гликемия натощак составила 7,1 ммоль/л; HbAlc - 8,73%;

У данной больной уровень MetHb составил 1,54%, SHb 1,64%, коэффициент трансформации MefHb/HbS: 0,93, что не позволило диагностировать микрососудистые осложнения. При повторном обследовании через год сосудистые осложнения не выявлены. (коэффициент трансформации MetHb/HbS: 0,90).

Предлагаемым способом достигается положительный эффект: повышается точность ранней диагностики микроангиопатий у больных сахарным диабетом 1 типа, появляется возможность выделения групп больных сахарным диабетом 1-го типа с высоким риском развития микроангиопатий благодаря одновременному определению в крови больных уровня метгемоглобина и сульфгемоглобина, а также рассчитав коэффициент трансформации метгемоглобина в сульфгемоглобин, отражающий нарушение метаболизма клеток; появляется возможность ранней диагностики малосимптомных, субклинически протекающих форм микроангиопатий. Полученные результаты могут быть использованы для более обоснованного назначения ангиопротекторов. Точность предлагаемого способа 85%.

Таблица 1
Структура содержания фракций гемоглобина при СД 1 типа с начальными стадиями микроангиопатий до (I) и после лечения (II), (М±m, %)Группы обследованныхMetHbSHbMetHb/SHbБольные СД 1-го типа с микрангиопатиями n=80I1,42±0,01*2,44±0,05*²0,58II1,62±0,131,57±0,591,03Больные СД 1-го типа без сосудистых осложнений n=20I1,48±0,062,26±0,06*0,66II1,79±0,01***1,68±0,21**1,06Контроль, n=201,62±0,031,60±0,31,01Примечание: * р<0,05 достоверность различий с контролем
** р<0,05 достоверность различий до и после лечения
² р<0,05 достоверность различий с группой сравнения

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам в эндокринологии. Для осуществления способа в крови больного одновременно определяют содержание метгемоглобина и сульфгемоглобина. Затем рассчитывают коэффициент трансформации метгемоглобина в сульфгемоглобин. При уровне метгемоглобина от 1,47 до 1,42%, уровне сульфгемоглобина от 2,27 до 2,44% и значении коэффициента трансформации метгемоглобина в сульфгемоглобин от 0,65 до 0,58 диагностируют ранние микрососудистые осложнения сахарного диабета 1 типа. Использование изобретения позволяет повысить точность ранней диагностики микроангиопатий у больных сахарным диабетом 1-го типа (ретинопатии 1, нефропатии 1, полинейропатии). 1 табл.

Способ ранней диагностики микроангиопатий у больных сахарным диабетом 1 типа путем исследования венозной крови, отличающийся тем, что одновременно определяют в крови больного содержание метгемоглобина и сульфгемоглобина, рассчитывают коэффициент трансформации метгемоглобина в сульфгемоглобин и при уровне метгемоглобина от 1,47 до 1,42% и уровне сульфгемоглобина от 2,27 до 2,44% и значении коэффициента трансформации метгемоглобина в сульфгемоглобин от 0,65 до 0,58 диагностируют ранние микрососудистые осложнения сахарного диабета 1 типа.