Область изобретения
Настоящее изобретение относится к лиганду рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, способу его получения и композиции для улучшения состояния инсулинорезистентности или для предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности (диабет типа 2, гиперинсулинемия, дислипидемия, ожирение, гипертензия и заболевания, характеризуемого артериосклерозом), содержащей лиганд рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, в качестве активного ингредиента.
Предшествующая область техники
Рецептор, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR), представляет собой лиганд-зависимый регулятор транскрипции, принадлежащий к семейству внутриядерных рецепторов. Данное семейство определяют как семейство регуляторов транскрипции, вовлеченных в регуляцию экспрессии группы генов, обеспечивающей метаболизм липидов. У млекопитающих известны 3 подтипа, а именно PPARα, PPARδ (PPARβ, NUC-1, FAAR) и PPARγ, причем PPARα экспрессируется преимущественно в печени, а PPARδ экспрессируется везде. Для PPAR γ существуют 2 изоформы, а именно PPAR γ1 и PPARγ2, причем PPARγ1 экспрессируется не только в жировой ткани, но также и в органах иммунной системы, надпочечниках и тонком кишечнике. PPARγ2 экспрессируется специфически в жировой ткани и является основным регулятором, который регулирует дифференцировку и созревание адипоцитов (Teruo Kawada, "Igaku No Ayumi", 184, 519-523, 1998).
В качестве лигандов PPARγ известны синтетические соединения, включающие производные тиазолидина, такие как троглитазон, пиоглитазон и розиглитазон. В качестве лигандов PPARγ известны соединения естественного происхождения, включающие метаболиты арахидоновой кислоты, такие как 15-деокси-Δ12,14-простагландин J2 и Δ12,14-простагландин J2, ненасыщенные жирные кислоты, такие как ω-3 поливалентная ненасыщенная жирная кислота, α-линоленовая кислота, эйкозапентаеновая кислота (ЭПК (EPA)) и докозагексаеновая кислота (ДГК (DHA)) и эйкозаноиды, такие как 9-гидроксиоктадекадиеновая кислота и 13-гидроксиоктадекадиеновая кислота (J. Auwerx, Diabetologia, 42, 1033-1049, 1999). В японской публикации Kokai 2000-355538 описана С10-26 конъюгированная ненасыщенная жирная кислота, имеющая конъюгированную триеновую структуру или конъюгированную тетраеновую структуру. В отношении флавонидов, сообщают, что кризин и апигенин, как производные флавона, и кемпферол как производное флавонола, являются лигандами PPARγ. (Y. C. Liang, et al., FEBS Letters, 496, 12-18, 2001). Флавонид представляет собой вещество, широко распространенное в растениях, и известно, что он обладает антиоксидантными свойствами. Однако неизвестно, является ли пренилфлавоноид, содержащийся только в специфических растениях, лигандом PPARγ.
Агонистическая активность производных тиазолидина в качестве лиганда PPARγ коррелирует с его гипогликемическим действием, поэтому такие производные привлекают внимание в отношении их взаимосвязи с улучшающим состояние действием в отношении инсулинорезистентности и разрабатываются в качестве средств, улучшающих состояние инсулинорезистентности, для применения при сахарном диабете типа 2 (инсулин-независимом сахарном диабете: ИНСД). То есть, производное тиазолидина, которое является лигандом PPAR, активирует PPAR, вызывая увеличение количества нормально функционирующих небольших адипоцитов, дифференцировавшихся из преадипоцитов. Соответственно, количество гипертрофированных адипоцитов, в которых избыточно продуцируются и секретируются ФНО-α (TNFα) и свободные жирные кислоты, способствуя инсулинорезистентности, уменьшается вследствие апоптоза. В результате улучшается состояние инсулинорезистентности (A. Okuno, et al., Journal of Clinical Investigation, 101, 1354-1361, 1998). Лиганд PPARγ улучшает состояние инсулинорезистентности и таким образом также является эффективным для предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности, включающего не только сахарный диабет типа 2, но и гиперинсулинемию, дислипидемию, ожирение (в частности, висцеральное ожирение), гипертензию и артериосклероз (R.A. DeFronzo & E. Ferrannini, Diabetes Care, 14, 173-194, 1991). Патологические состояния такого же рода, что и синдром инсулинорезистентности, включают синдром Х (G.M. Reaven, Diabetes, 37, 1595-1607, 1988), смертельный квартет (N.M. Kaplan, Archives of Internal Medicine, 149, 1514-1520, 1989) и синдром висцерального ожирения (Y. Matsuzawa, Diabetes/Metabolism Reviews, 13, 3-13, 1997).
Лиганд PPARγ также является эффективным для предотвращения и/или улучшения состояния воспалительных и раковых состояний из-за его способности ингибировать продукцию цитокинов воспаления (C. Jiang, et al., Nature, 391, 82-86, 1998) и индуцировать апоптоз, таким образом ингибируя рост раковых клеток (Y. Tsubouchi, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 270, 400-405, 2000).
Краткое описание изобретения
В свете вышеупомянутого, лиганд PPARγ обладает эффектом в отношении улучшения состояния инсулинорезистентности и предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности, например сахарного диабета типа 2, гиперинсулинемии, дислипидемии, ожирения (в частности, висцерального ожирения), гипертензии и артериосклероза. Целью настоящего изобретения является получение лиганда PPAR, обнаруженного в природных материалах, способа для более легкого и эффективного получения подобного и композиции для улучшения состояния инсулинорезистентности или для предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности, содержащей лиганд в качестве активного ингредиента.
Авторы настоящего изобретения искали вещество, обладающее активностью лиганда PPARγ, в природных материалах и в результате обнаружили, что экстракт растения, такого как лакричник, обладает активностью лиганда PPARγ. Авторы настоящего изобретения интенсивно изучали его активный ингредиент и в результате обнаружили, что специфический компонент экстракта обладает активностью лиганда PPARγ. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что органический растворитель, предпочтительно сложный эфир жирной кислоты или водорастворимый органический растворитель, особенно водорастворимый органический растворитель, могут применяться для эффективного экстрагирования подобного компонента из лакричника, для осуществления настоящего изобретения.
То есть, первый аспект настоящего изобретения связан с лигандом рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, который включает пренилфлавоноид, производное халькона, отличного от пренилфлавоноидов, производное флавонола, отличного от пренилфлавоноидов, и их соль, гликозид и/или этерифицированную форму, приемлемую в качестве фармацевтического препарата, или пищевого продукта, или напитка.
Второй аспект данного изобретения связан с растительным экстрактом, который включает лиганд рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, включающий пренилфлавоноид, производное халькона, отличного от пренилфлавоноидов, производное флавонола, за исключением пренилфлавоноидов, и их соль, гликозид и/или этерифицированную форму, приемлемую в качестве фармацевтического препарата или пищевого продукта или напитка.
Третий аспект данного изобретения связан с композицией для улучшения состояния инсулинорезистентности или для предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности, которая включает, в качестве активного ингредиента, пренилфлавоноид, обладающий способностью связываться с лиганд-связывающим участком рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, производное халькона, отличного от пренилфлавоноидов, производное флавонола, отличного от пренилфлавоноидов, и их соль, гликозид и/или этерифицированную форму, приемлемую в качестве фармацевтического препарата или пищевого продукта или напитка.
Четвертый аспект данного изобретения связан с композицией для предотвращения и/или улучшения состояния воспалительных и раковых процессов, которая включает в качестве активного ингредиента пренилфлавоноид, обладающий способностью связываться с лиганд-связывающим участком рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, производное халькона, отличного от пренилфлавоноидов, производное флавонола, отличного от пренилфлавоноидов, и их соль, гликозид и/или этерифицированную форму, приемлемую в качестве фармацевтического препарата или пищевого продукта или напитка.
Пятый аспект данного изобретения связан со способом получения экстракта, описанного выше, который включает экстрагирование экстракта из лакричника, имеющего соотношение области коры (оболочек) к общей площади поверхности 30% или более.
Шестой аспект данного изобретения связан со способом получения экстракта, описанного выше, где экстрагирование из лакричника проводят с помощью сложного эфира жирной кислоты или водорастворимого органического растворителя.
Седьмой аспект данного изобретения связан со способом получения экстракта, описанного выше, который включает экстрагирование из лакричника с помощью органического растворителя, имеющего содержание воды 30% по объему или меньше.
Подробное описание изобретения
Ниже детально описаны варианты воплощения настоящего изобретения.
Лиганд PPAR (предпочтительно лиганд PPARγ) представляет собой соединение, имеющее активность лиганда PPAR (предпочтительно, активность лиганда PPARγ), то есть, соединение, обладающее способностью связываться с лиганд-связывающим участком PPAR (предпочтительно PPARγ). Активность лиганда PPARγ может быть измерена, например, путем репортерного анализа, где связывание соединения со слитым белком лиганд-связывающего участка PPARγ и GAL4 оценивают в единицах экспрессии люциферазы (B.M. Forman, et al., Cell, 83, 803-812, 1995), анализ конкурентного связывания с использованием белка, имеющего лиганд-связывающий участок PPARγ (S.A. Kliewer, et al., Cell, 83, 813-819, 1995), и др. Как правило, активность образца в данных анализах сравнивают с таковой контрольного растворителя, и образец, имеющий более высокую активность, чем таковая контрольного растворителя, а также имеющий показатели того, что активность является дозозависимой, расценивали как, имеющий "активность лиганда PPARγ".
Лиганд PPAR, предпочтительно лиганд PPARγ, по настоящему изобретению представляет собой, по меньшей мере, одно соединение, выбираемое из группы, состоящей из пренилфлавоноида, производного халькона, отличного от пренилфлавоноидов, производного флавонола, отличного от пренилфлавоноидов и их соли, гликозида и/или этерифицированной формы, приемлемой в качестве фармацевтического препарата или пищевого продукта или напитка.
Соль, приемлемая в качестве фармацевтического препарата или пищи или напитка включает, но не ограничена, например, солями натрия, солями калия, солями магния, солями кальция и др.
Гликозид, приемлемый в качестве фармацевтического препарата или пищевого продукта или напитка включает, но не ограничен, например, гликозидами моносахаридов, таких как глюкоза и галактоза, гликозидами дисахаридов или олигосахаридов, и др.
Этерифицированные вещества, приемлемые в качестве фармацевтического препарата или пищевого продукта или напитка включают, но не ограничены, например, ацетатами, пропионатами, фосфатами, сульфатами и др.
Композиция по настоящему изобретению, включающая в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, один вид, выбираемый из данных соединений, улучшает состояние инсулинорезистентности и, следовательно, является полезной в качестве средства для предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности, включая сахарный диабет.
Пренилфлавоноид, который является лигандом PPAR по данному изобретению, особо не ограничен, но предпочтительно является, по меньшей мере, одним соединением, выбираемым из группы, состоящей из производных 3-арилкумарина, производных изофлав-3-ена, производных изофлавана, производных изофлаванона, производных флавонола, производных флаванона, производных халькона и производных дибензоилметана.
Пренилфлавоноид, на который ссылаются в данном описании, определяют как соединение, имеющее, по меньшей мере, одно из следующего (А) и (В) в качестве боковой цепи флавоноида: (А) прениловая группа, или (В) структура, имеющая 6-членный цикл, в котором прениловая группа связана с соседней гидроксильной группой с образованием [-CH=CHC(CH3)2O-]. Термин "флавоноид" представляет собой общий термин, относящийся к группе веществ, имеющих 2 фениловых группы, связанные друг с другом посредством 3 атомов углерода, и его примеры включают флавон, флавонол, флаванон, флаванонол, изофлавон, изофлавонол, изофлаванон, изофлаван, изофлав-3-ен, 3-арилкумарин, халькон, дигидрохалькон, дибензоилметан, куместан, птерокарпан, катехин, антоцианидин и др.
Производные 3-арилкумарина, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но предпочтительные примеры их включают соединения, представленные общей формулой (1). И, например, могут быть упомянуты соединения, показанные в таблице 1, такие как глицикумарин, глицирин, ганкаонин W, глиасперин L, канзонол W и др. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них более предпочтительными являются глицикумарин и глицирин.
В формуле, по меньшей мере, один из R1-R7 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой H, OH или OCH3.
Производные изофлав-3-ена, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но их предпочтительные примеры включают соединения, представленные следующей общей формулой (2). Например, соединения, показанные в таблице 2, такие как дегидроглиасперин С, дегидроглиасперин D, глабрен и RL-S. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них предпочтительными являются дегидроглиасперин С, дегидроглиасперин D и глабрен. Дегидроглиасперин D представляет собой новое соединение, впервые обнаруженное в настоящем изобретении.
В формуле, по меньшей мере, один из R1-R7 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой Н, ОН или OCH3.
Производные изофлавана, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но их предпочтительные примеры включают соединения, представленные следующей общей формулой (3). Например, соединения, показанные в таблице 3, такие как глиасперин С, глиасперин D, глиасперин I, ликорицидин и ликоризофлаван А. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них более предпочтительными являются глиасперин D, глабридин, гиспаглабридин В, 4'-О-метилглабридин и 3'-гидрокси-4'-О-метилглабридин.
В формуле, по меньшей мере, один из R1-R7 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой Н, ОН или OCH3.
Производные изофлаванона, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но их предпочтительные примеры включают соединения, представленные следующей общей формулой (4). Например, соединения, показанные в таблице 4, такие как глиасперин В, глиасперин К, канзонол G, 3'-пренил-киевитон и глиасперин F. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них более предпочтительными являются глиасперин В и глицирризофлаванон.
В формуле, по меньшей мере, один из R1-R8 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой Н, ОН или OCH3.
Производные изофлавона, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но их предпочтительные примеры включают соединения, представленные следующей общей формулой (5). Например, соединения, показанные в таблице 5, такие как витеон, ганкаонин А, ганкаонин В, ганкаонин G и ганкаонин N. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них более предпочтительными являются глиураллин В, люпивитеон, семиликоизофлавон В и глицирризофлавон.
В формуле, по меньшей мере, один из R1-R9 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой Н, ОН или OCH3.
Производные флавонола, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но их предпочтительные примеры включают соединения, представленные следующей общей формулой (6). Например, соединения, показанные в таблице 6, такие как ликофлавонол, ганкаонин Р, топазолин, глиасперин А и изоликофлавонол. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них более предпочтительными являются изоликофлавонол, ликофлавонол и топазолин.
В формуле R1 представляет собой ОН или ОСН3, по меньшей мере, один из R2-R9 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой Н, ОН или OCH3.
Производные флаванона, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но их предпочтительные примеры включают соединения, представленные следующей общей формулой (7). Например, соединения, показанные в таблице 7, такие как 6-пренилпиноцембрин, 6-пренилнарингенин, 6-пренилериодиктиол, синофлаванон В и паратокарпин L. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них более предпочтительным является глаброл.
В формуле, по меньшей мере, один из R1-R8 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой Н, ОН или OCH3.
Производные халькона, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но их предпочтительные примеры включают соединения, представленные следующей общей формулой (8). Например, соединения, показанные в таблице 8, такие как ликохалькон С, ликохалькон D, глиинфланин G, канзонол В и канзонол С. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них более предпочтительным является ликохалькон С.
В формуле, по меньшей мере, один из R1-R9 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой Н, ОН или OCH3.
Производные дибензоилметана, которые являются пренилфлавоноидами, применяемыми в настоящем изобретении, особо не ограничены, но их предпочтительные примеры включают соединения, представленные следующей общей формулой (9). Например, соединения, показанные в таблице 9, такие как глицирдион А, глицирдион В, глицирдион С, глиинфланин В и глиинфланин D. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества. Среди них более предпочтительными являются глицирдион А и глицирдион С.
В формуле, по меньшей мере, один из R1-R7 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R группы образуют 6-членный цикл, включающий -CH=CHC(CH3)2O-, а другие R группы представляют собой Н, ОН или OCH3.
Производные халькона, исключая пренилфлавоноиды, применяемые в настоящем изобретении особо не ограничены, а их предпочтительные примеры включают эхинатин, изоликвиритигенин, ликохалькон А и ликохалькон В. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества.
Производные флавонола, исключая пренилфлавоноиды, применяемые в настоящем изобретении, особо не ограничены, а их предпочтительные примеры включают 3-О-метиловый эфир кемпферола. Также могут быть упомянуты их производные, такие как соли, гликозиды и этерифицированные вещества.
За названиями данных соединений можно обратиться к сообщению T. Hiraga & K. Kajiyama (Meiji Pharmaceutical University Bulletin, 27, 9-57, 1997) и сообщению T. Nomura & T. Fukai (Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe, 73, 1-158, 1998).
Лигандом PPAR по настоящему изобретению может быть любое соединение, получаемое из естественных источников, таких как растения, химически синтезированное или биосинтезированное в культивируемых клетках и др., если соединение является вышеупомянутым соединением, но предпочтительным является соединение, полученное из естественных источников, которые человек может есть. Способ получения таких соединений особо не ограничен и соединения могут быть получены из лакричника семейства Leguminosae, который человек может есть, или из других растений. Другие растения, упомянутые выше, особо не ограничены, при условии, что растения содержат лиганд PPAR, предпочтительно, лиганд PPARγ и в добавление к растениям семейства Leguminosae могут быть упомянуты другие семейства, такие как семейство Moraceae, семейство Eucommiceae, семейство Cannabaceae и семейство Urticaceae.
Ниже в качестве примера описан способ получения лиганда PPAR по настоящему изобретению из лакричника, но исходный материал не обязательно ограничен лакричником.
Используемый лакричник может быть растением рода Glycyrrhiza семейства Leguminosae и его примеры включают Glycyrrhiza uralensis Fisch. et DC, G. Inflata BAT., G. Glabra L., G. Glabra L. var. glandu rifera Regel et Herder, G. echinata L., G. pallidiflora Maxim и другие растения того же рода (Leguminosae). Такие растения выращивают, например, в Xin Jiang, северо-восточном Китае, северо-западном Китае, Монголии, России, Афганистане, Иране, Турции, и др. Среди них предпочтительными являются таковые, имеющие более высокое содержание активного ингредиента лиганда PPAR, такие как G. uralensis (области выращивания: северо-восточный Китай, северо-западный Китай, Монголия, Xin Jiang и др.), G. glabra (области выращивания: Россия, Афганистан, Иран, Турция и др.) и G. inflata (области выращивания: Xin Jiang и др.), а G. uralensis является особенно предпочтительной для применения.
В настоящем изобретении предпочтительно применяют корень, корневище или столон лакричника, упомянутого выше, и его применяют в форме мелко измельченного продукта, измельченного продукта, резаного продукта или перидермы вышеупомянутого лакричника. Мелко измельченный продукт обозначает порошкообразный или почти порошкообразный продукт, и измельченный продукт относится к продукту в форме нитей, волокон или ваты (например, продукту, имеющему длину около 5 - 10 мм). Резаный продукт представляет собой полученный путем нарезания корня, корневища или столона лакричника (например, тонкими круглыми ломтиками, имеющими длину обычно около 1-10 см, предпочтительно около 1-5 см, более предпочтительно около 2-4 см и толщину обычно около 3 см или менее, предпочтительно около 2 см и менее, более предпочтительно около 1 см или менее) обычно цилиндрической формы или практически цилиндрической формы. Мелко измельченный продукт, измельченный продукт и резаный продукт могут быть получены с применением обычной аппаратуры. Мелко измельченный продукт может быть получен в виде порошкообразного или почти порошкообразного продукта при помощи мельницы типа Masscolloider, ступки для измельчения и др., а измельченный продукт может быть получен при помощи измельчающей молотковой мельницы или подобных. Резаный продукт может быть получен путем нарезания корня или других частей лакричника на куски, имеющие вышеупомянутую длину с помощью обычной резальной машины.
Композиция и содержание активного ингредиента лакричника до некоторой степени варьируется в зависимости от его вида, территории выращивания, времени сбора урожая и др. Следовательно, предпочтительным является применение такового, в котором установлено с помощью предварительного эксперимента наличие большого количества активного ингредиента.
Способы экстрагирования включают способы, которые включают экстрагирование лакричника с помощью органического растворителя. Однако остаток от водной экстракции, полученный при экстрагировании лакричника водой, или сухое вещество остатка также может быть подвергнуто экстрагированию органическим растворителем.
Органический растворитель, применяемый в данном описании, особо не ограничен, но предпочтительно представляет собой безопасный растворитель, используемый для создания и обработки фармацевтических препаратов, пищевых продуктов, пищевых добавок и т.п. Их примеры включают ацетон, одноатомный спирт, имеющий 1-4 атома углерода, глицерин, сложные эфиры жирных кислот, диэтиловый эфир, циклогексан, диоксид углерода, пропиленгликоль и др., и два или более из этих растворителей могут применяться в виде смеси. Среди них, предпочтительно применяемыми растворителями являются сложные эфиры жирных кислот, такие как этилацетат, или водорастворимые органические растворители, такие как одноатомный спирт, имеющий 1-4 атома углерода, ацетон, пропиленгликоль, глицерин и др. и особенно предпочтительно водорастворимые органические растворители.
После экстрагирования, является предпочтительным увеличить содержание активного ингредиента в экстракте путем очистки, такой как абсорбция активированным углем, смолой или подобным, и/или фракционирование. Вещество, полученное экстрагированием, может быть подвергнуто колоночной хроматографии на силикагеле, ODS, ион-обменной смоле и др., где целевое соединение может быть концентрировано, фракционировано или выделено.
Ясно, что целевое соединение может быть получено другим химическим синтезом.
Ниже способ экстрагирования лакричника при помощи сложного эфира жирной кислоты или водорастворимого органического растворителя описан более детально, в качестве предпочтительного способа получения экстракта лакричника, содержащего лиганд PPAR, в соответствии с настоящим изобретением. Экстракт лакричника, выделенный с помощью сложного эфира жирной кислоты или водорастворимого органического растворителя, имеет тенденцию к проявлению лучшей активности лиганда PPAR, и водорастворимый органический растворитель является особенно предпочтительным для применения, так как может быть более эффективно получено активное вещество - лиганд PPAR.
Когда целевое вещество экстрагируют из лакричника с помощью сложного эфира жирной кислоты или водорастворимого органического растворителя, экстракции может подвергаться мелко измельченный продукт, измельченный продукт, резаный продукт или перидерма лакричника как таковые, но как описано выше, пре-экстрагированный остаток лакричника, полученный при предварительном экстрагировании из лакричника другим растворителем (например, водой, водным раствором щелочи и др.), может быть экстрагирован сложным эфиром жирной кислоты или водорастворимым органическим растворителем для удаления примесей и др.
После пре-экстрагирования из лакричника другим растворителем (вода, водный раствор щелочи и др.), предварительный экстракт может быть разделен на экстракт и остаток экстрагированного лакричника путем обычной методики разделения (например, фильтрации под давлением, фильтрации в вакууме, фильтровального пресса, центрифугирования, осаждения и др.) для получения остатка предварительно экстрагированного лакричника. В данной методике разделения, при необходимости могут применяться обычно используемые вспомогательные фильтрующие материалы и/или адсорбирующие вещества, такие как активированный уголь и активированная глина.
Полученный таким образом предварительно экстрагированный остаток применяют при экстрагировании сложным эфиром жирной кислоты или водорастворимого органического растворителя как таковой или после удаления частично или полностью другого применяемого растворителя (воды, водного раствора щелочи и др.) обычной методикой сушки (например, сушкой в стационарном состоянии, сушкой при перемешивании, смешанной сушкой, сушкой в псевдоожиженном состоянии, термической сушкой, распылительной сушкой, сублимационной сушкой, концентрированием вымораживанием и др.).
Сложные эфиры жирных кислот или водорастворимые органические растворители, которые предпочтительно могут применяться в данном способе экстракции, включают, но не ограничены, ацетатами, такими как этилацетат, одноатомными спиртами, имеющими 1-4 атома углерода, ацетоном, пропиленгликолем, глицерином и их смесями. Среди них предпочтительными являются ацетаты, такие как этилацетат, одноатомные спирты, имеющие 1-4 атомов углерода, ацетон или их смеси, и более предпочтительными являются этилацетат, этанол, ацетон или их смеси. В частности, этанол является предпочтительным ввиду безопасности растворителя для человеческого тела. Для уменьшения загрязнения водорастворимыми примесями, такими как глицирризин, описанный ниже, предпочтительными являются одноатомные спирты, имеющие 2-4 атома углерода, сложные эфиры жирных кислот и ацетон, особенно предпочтительными являются сложные эфиры жирных кислот и ацетон, более предпочтительными являются ацетаты и ацетон и еще более предпочтительными являются этилацетат и ацетон. Очевидно, что другие растворители могут сосуществовать в таком диапазоне, чтобы не иметь побочных эффектов.
В настоящем изобретении является важным увеличивать содержание активного ингредиента в экстракте лакричника, наряду с уменьшением содержания водорастворимых примесей, таких как глицирризин.
Глицирризин также используют в виде фармацевтического препарата, но он имеет побочные эффекты, такие как повышение артериального давления, сердечно-сосудистые заболевания и гидремия (на них ссылаются Harders, H. & Rausch-Stroomann, J. G., Munch. Med. Wschr. 95, 580 (1953)), гипокалиемия, снижение активности ренина плазмы, симптомы псевдо-альдостеронизма и расслабляющий паралич конечностей (на них ссылаются Conn, J. W., Rovner, D.R. & Cohen, E.L., J. Am. Med. Assoc. 205, 492 (1968)), сниженная секреция альдостерона в мочу, отеки, головная боль и сонливость (на них ссылаются Epstein, M.T., et al., Brit. Med. J., 1, 488 (1977)). Глицирризин в 150 раз слаще сахарозы. Загрязнение глицирризином ингибирует различные эффекты экстракта лакричника и вызывает побочные эффекты и сильную сладость, таким образом, вызывая неудобства при применении в пищевых продуктах и др.
Для увеличения содержания активного ингредиента в получающемся экстракте лакричника и в то же время уменьшения содержания водорастворимых примесей, таких как глицирризин, содержание воды, присутствующей во время экстрагирования вместе с органическим растворителем, предпочтительно снижают.
Для уменьшения содержания воды, является важным применение лакричника, высушенного до максимальной степени, а также применение безводного органического растворителя.
Однако необходимо заметить, что лакричник является растением и обычная сушка на солнце не всегда является достаточной для получения достаточно высушенного лакричника, следовательно, становится необходимым использовать сушильные машины и др. Это представляет собой серьезное слабое место в получении в коммерческих масштабах.
Даже при применении безводного органического растворителя является трудным полностью предотвратить загрязнение органического растворителя водой из применяемого лакричника и рабочей атмосферы и вследствие этого возвращать в цикл органический растворитель из-за повышенного содержания воды. Так как органический растворитель сложно возвратить в цикл как таковой, растворитель выбрасывают или используют необходимые специальные и дорогие средства и методы очистки для получения безводного растворителя, что ведет к увеличению издержек производства.
Соответственно, если достаточно легко и недорого может быть получен экстракт лакричника высокого качества с высоким содержанием активного ингредиента и более низким содержанием водорастворимых примесей, можно ожидать значительные преимущества.
В качестве результата интенсивных исследований, авторы настоящего изобретения обнаружили, что является предпочтительным использовать лакричник в такой форме, чтобы соотношение площади коры (оболочек) к общей площади его поверхности было высоким, обычно 30% или более, предпочтительно 50% или более, более предпочтительно 70% или более, еще более предпочтительно 80% или более, еще более предпочтительно 90% или более (особенно, резаный продукт или перидерма лакричника (включая продукт, главным образом содержащий перидерму)), с целью получения экстракта лакричника высокого качества. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что когда используется лакричник в вышеуказанной форме, может быть получен экстракт лакричника высокого качества, даже если применяется гидратированный водорастворимый органический растворитель.
Среди резаного продукта и перидермы (включая продукт, главным образом содержащий перидерму), резаный продукт является более предпочтительным для применения, так как он может быть легче обработан, и соотношение площади коры к общей площади поверхности резаного продукта обычно составляет 50% или более, предпочтительно 70% или более, более предпочтительно 80% или более и еще более предпочтительно 90% или более.
В соответствии с данным способом, эффект может быть доведен до максимума, особенно при применении вышеупомянутого водорастворимого органического растворителя, предпочтительно одноатомного спирта, имеющего 2-4 атома углерода, более предпочтительно этанола.
Содержание воды в применяемом органическом растворителе обычно составляет около 30% по объему или менее, предпочтительно около 20% по объему или менее, более предпочтительно около 10% по объему или менее, и еще более предпочтительно, около 8% по объему или менее. Нижний предел особо не ограничен, но обычно с практической точки зрения составляет около 3% по объему, предпочтительно 4% по объему.
Таким образом, предпочтительно может быть получен экстракт лакричника, имеющий более высокое содержание активного ингредиента и более низкое содержание водорастворимых примесей. Содержание глицирризина в получающемся экстракте может быть доведено до минимума предпочтительно до 0,5% по объему или менее. Даже когда применяют недорогой гидратированный водорастворимый органический растворитель в качестве экстрагирующего растворителя, может быть предпочтительно получен экстракт высокого качества (без специальной сушки лакричника).
Экстрагирование сложным эфиром жирной кислоты или водорастворимым органическим растворителем, упомянутыми выше, может проводиться в соответствии с обычным способом и особо не ограничено. Температура экстрагирования особо не ограничена, и экстрагирование может проводиться предпочтительно между температурой застывания и температурой кипения в системе, как правило от -20 до 100°С, обычно от 1 до 80°С, предпочтительно от 20 до 60°С.
Процедуру экстрагирования можно проводить, например, в течение 0,1 часа или более, предпочтительно, 0,2 часа или более, более предпочтительно 0,5 часа или более с применением сложного эфира жирной кислоты или водорастворимого органического растворителя в, например, 1-20-кратном избытке, предпочтительно 2-10-кратном избытке, на основании объема лакричника или предварительно экстрагированного остатка. Обычно время для каждого экстрагирования предпочтительно составляет около 1-10 часов. Верхний предел особо не ограничен и составляет около 1 дня, но экстрагирование может проводиться в течение более длительного времени. Экстрагирование можно проводить один или несколько раз при необходимости, и можно применять смешанный соответствующим образом растворитель. Давление во время экстрагирования особо не ограничено. Экстрагирование проводят при нормальном давлении или под давлением (одно-несколько атмосферных давлений), но при желании можно проводить при пониженном давлении. Экстрагирование можно проводить с дефлегмацией или в состоянии под слабым давлением.
После экстрагирования, предварительный экстракт может быть разделен на экстракт и остаток экстрагированного лакричника при помощи обычной методики разделения (например, фильтрации под давлением, вакуумной фильтрации, центрифугирования, седиментации и др.) и, если необходимо, промыт растворителем для получения экстракта лакричника. В методике разделения при необходимости могут применяться обычно используемые вспомогательные фильтрующие материалы и/или адсорбирующие вещества, такие как активированный уголь и смола.
Из полученного таким образом экстракта лакричника, применяемый растворитель может быть удален при помощи обычной методики удаления растворителя (например, концентрирования при нормальном давлении, вакуумного концентрирования, распылительной сушки, сублимационной сушки, концентрирования вымораживанием), посредством чего может быть получен экстракт лакричника без растворителя. После экстрагирования экстракт как описано выше, более предпочтительно очищают методом адсорбции с помощью активированного угля или глины и/или фракционирования, таким образом, увеличивая содержание активного ингредиента в экстракте.
В способе настоящего изобретения, ряд вышеуказанных процедур, особенно экстрагирование растворителем, или экстрагирование растворителем с последующими процедурами (разделение экстракта, удаления растворителя, адсорбция с помощью активированного угля, глины или подобного и/или фракционирование, и др.) предпочтительно проводят в бескислородной атмосфере, такой как инертная газовая атмосфера, с применением газообразного азота и др. С целью предотвращения окисления, методику можно проводить в присутствии антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота, аскорбат натрия, аскорбилпальмитат, аскорбилстеарат, токоферол и др.
Экстракт лакричника, полученный после удаления растворителя, обычно является коричневым (например, от желтовато-коричневого до темно-коричневого).
Массовое соотношение (на основании сухого веса) сухого экстракта лакричника, полученного при обработке лакричника как такового, обычно составляет около 0,01 или более.
Содержание глицирризина в экстракте по настоящему изобретению, на основании сухого веса, является обычно таким низким, как 0,5% по массе или менее, предпочтительно 0,3% по массе или менее, более предпочтительно 0,2% по массе или менее, еще более предпочтительно 0,1% по массе или менее. Когда содержание глицирризина в экстракте по настоящему изобретению составляет от 0,001 до 0,5% по массе на основании сухого веса, практически не существует проблемы побочных эффектов и недостатков применения.
Содержание глицирризина в экстракте может быть определено, например, при помощи анализа ВЭЖХ с применением коммерческого глицирризина или глицирризината в качестве стандартного вещества или подобного анализа. Содержание лиганда PPAR в экстракте может быть определено, например, при помощи анализа ВЭЖХ с использованием лиганда PPAR по настоящему изобретению в качестве стандартного вещества или подобного анализа. Лиганд PPAR в качестве стандартного вещества может быть соединением, выделенным из растения, такого как лакричник, или химически синтезированным соединением. Общее количество компонентов лиганда PPAR в экстракте может быть рассчитано в виде общего содержания измеренных компонентов лиганда PPAR.
Общее количество компонентов лиганда PPAR в экстракте по настоящему изобретению, на основании сухого веса, составляет обычно 0,5% по массе или более, предпочтительно 1% по массе или более и более предпочтительно 2% по массе или более. В частности, когда лиганд PPAR экстрагируют одноатомным спиртом, имеющим 1-4 атома углерода, его количество обычно составляет 5% по массе или более, предпочтительно 6% по массе или более, более предпочтительно 7% по массе или более, таким образом, показывая эффективное выделение активного ингредиента. Общее количество компонентов лиганда PPAR, содержащееся в экстракте по настоящему изобретению, на основании сухого веса, обычно составляет максимально не выше чем 50% по массе, но содержание может быть еще увеличено путем адсорбции при помощи активированного угля, смолы или подобного и/или фракционирования.
Например, экстракт по настоящему изобретению предпочтительно включает, например, по меньшей мере, один вид, выбираемый из группы, состоящей из глицикумарина, глицирина, дегидроглиасперина С, дегидроглиасперина D, глиасперина В и глиасперина D в качестве главного компонента в количестве обычно 0,5% по массе или более, предпочтительно 1% по массе или более на основании сухого веса. Более предпочтительно, экстракт включает глицикумарин, глицирин, дегидроглиасперин С, дегидроглиасперин D, глиасперин В и глиасперин D соответственно в количестве обычно 0,5% по массе или более, предпочтительно 1% по массе или более на основании сухого веса. Данные компоненты содержатся в большем количестве в экстракте лакричника, особенно G. uralensis.
Кроме того, экстракт по настоящему изобретению предпочтительно включает, например, по меньшей мере, один вид, выбираемый из группы, состоящей из глицирризофлаванона, глицирризофлавона, глиураллина В, семикоизофлавона В и изоликвиритигенина в количестве обычно 0,01% по массе или более, предпочтительно 0,02% по массе или более на основании сухого веса. Более предпочтительно, экстракт включает глицирризофлаванон, глицирризофлавон, глиураллин В, семикоизофлавон В и изоликвиритигенин соответственно в количестве обычно 0,01% по массе или более, предпочтительно 0,02% по массе или более на основании сухого веса.
Более того, экстракт по настоящему изобретению предпочтительно включает, например, по меньшей мере, один вид, выбираемый из группы, состоящей из глабрена, глабридина, глаброла, 3'-гидрокси-4'-О-метилглабридина, 4'-О-метилглабридина и гиспаглабридина В в количестве обычно 0,5% по массе или более, предпочтительно 1% по массе или более на основании сухого веса. Более предпочтительно, экстракт включает глабрен, глабридин, глаброл, 3'-гидрокси-4'-О-метилглабридин, 4'-О-метилглабридин и гиспаглабридин В соответственно в количестве обычно 0,5% по массе или более, предпочтительно 1% по массе или более на основании сухого веса. Данные компоненты содержатся в большем количестве в экстракте лакричника, особенно G. glabra.
Кроме того, экстракт по настоящему изобретению предпочтительно включает, например, по меньшей мере, один вид, выбираемый из группы, состоящей из ликохалькона А, ликохалькона В, ликохалькона С, глицирдиона А и глицирдиона С в количестве обычно 0,5% по массе или более, предпочтительно 1% по массе или более на основании сухого веса. Более предпочтительно, экстракт более предпочтительно включает ликохалькон А, ликохалькон В, ликохалькон С, глицирдион А и глицирдион С соответственно в количестве обычно 0,5% по массе или более, предпочтительно 1% по массе или более на основании сухого веса. Данные компоненты содержатся в большем количестве в экстракте лакричника, особенно G. inflata.
Композицией по настоящему изобретению для улучшения состояния инсулинорезистентности или для предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности и композицией по настоящему изобретению для предотвращения и/или улучшения состояния при воспалениях или раке являются композиции, включающие лиганд PPAR по настоящему изобретению. То есть, они представляют собой композиции, которые включают, по меньшей мере, одно соединение, выбираемое из группы, состоящей из пренилфлавоноида, производного халькона, отличного от пренилфлавоноидов, производного флавонола, отличного от пренилфлаванидов, и их солей, гликозидов и этерифицированных веществ, приемлемых в качестве фармацевтического препарата или пищевого продукта или напитка.
Как описано выше, пренилфлавоноид особо не ограничен, но предпочтительно является, по меньшей мере, одним соединением, выбираемым из группы, состоящей из производного 3-арилкумарина, производного изофлав-3-ена, производного изофлавана, производного изофлаванона, производного изофлавона, производного изофлаванола, производного флаванона, производного халькона и производного дибензоилметана.
Вышеуказанное соединение может являться чистым соединением или полуочищенным или неочищенным соединением, таким, что не содержит примесей, неподходящих для фармацевтических препаратов или пищевых продуктов. В таком случае, экстракт может применяться как таковой или может быть в дальнейшем очищен. Соединение не ограничено в своей форме и может применяться в виде, например, пищевых продуктов или напитков, таких как оздоровительные пищевые продукты (специализированные оздоровительные продукты, питательные функциональные пищевые продукты), здоровые пищевые продукты и вспомогательные питательные пищевые продукты, фармацевтические препараты и псевдолекарства.
Композиция по настоящему изобретению можно вводить человеку, а также комнатным или домашним животным, таким как собаки, кошки, виды коров, виды лошадей, виды свиней, куры, овцы, козы, мыши и крысы. Для применения в качестве пищевого продукта или напитка, она может непосредственно проглатываться или может быть представлена легко глотаемыми продуктами, такие как капсулы, таблетки, гранулы, порошки и др., с помощью известных носителей, вспомогательных агентов или подобных для приема внутрь. Дополнительно, может подходящим образом быть добавлено и смешано обычными способами вещество для композиции, иное, чем лиганд PPAR по настоящему изобретению. Такое вещество особо не ограничено, и могут быть упомянуты, например, эксципиенты, дезинтегранты, лубриканты, связывающие агенты, антиоксиданты, красящие агенты, ингибиторы агрегации, активаторы адсорбции, стабилизаторы и др. Количество лиганда PPAR по настоящему изобретению в продукте, созданном таким образом может быть 0,1-100% по массе, предпочтительно 10-90% по массе. Кроме того, он может быть смешан с сырьем для всех типов пищевых продуктов или напитков, например, кондитерских изделий, таких как жевательная резинка, шоколад, конфеты, желе, печенье и крекеры; замороженных сладостей, таких как мороженое и замороженные конфеты; напитков, таких как чай, безалкогольные напитки, питательные напитки и напитки для косметических целей; лапша, такая как японская пшеничная лапша, китайская лапша, спагетти и лапша быстрого приготовления; продукты из рыбной пасты, такие как рыба рубленая и распаренная (камабоко), рыбные сосиски (чикува) и рубленое мясо (ханнпен); приправы, такие как подливы, майонез и соусы; масляные продукты, такие как маргарин, масло и салатное масло; булочные продукты, ветчины, супы, печеные продукты, замороженные продукты и так далее. При потреблении композиций таких продуктов или напитков, рекомендуемое суточное потребление для взрослого человека составляет 0,1-3000 мг/кг, более предпочтительно 1-300 мг/кг, в виде лиганда PPAR по настоящему изобретению. Такие композиции также могут применяться в качестве питания для комнатных и домашних животных или в виде кормов для животных, и рекомендуемое суточное потребление при таком применении составляет предпочтительно 0,1-3000 мг/кг в виде лиганда PPAR по настоящему изобретению.
Для применения в качестве фармацевтического продукта, лекарственная форма особо не ограничена и включает капсулы, таблетки, гранулы, порошки, препараты для инъекций, суппозитории, пластыри и др. Такие лекарственные формы могут быть получены из подходящим образом созданных фармацевтически приемлемых веществ для лекарственных препаратов, таких как эксципиенты, дезинтегранты, лубриканты, связующие агенты, антиоксиданты, красящие агенты, ингибиторы агрегации, активаторы адсорбции, солюбилизаторы и стабилизаторы. Суточная дозировка таких композиций для взрослого человека составляет 0,1-3000 мг/кг, предпочтительно 1-300 мг/кг в виде лиганда PPAR по настоящему изобретению, эта доза может вводиться в один прием или в несколько отдельных приемов в течение дня. Композиция также может применяться в качестве фармацевтического препарата для комнатных и домашних животных и суточная дозировка при таком применении составляет предпочтительно 0,1-3000 мг/кг в виде лиганда PPAR по настоящему изобретению.
Когда композиция по настоящему изобретению представлена в форме таблеток, капсул или порошков и когда вышеуказанный экстракт содержится в виде лиганда PPAR, композиция предпочтительно включает экстракт в количестве 0,1-1000 мг в таблетке.
Лиганд PPAR по настоящему изобретению представляет собой компонент - экстракт, полученный из растения или связанное с ним соединение, и считают, что он обладает низкой токсичностью. Экстракт, полученный по настоящему изобретению, также может быть добавлен в пищевые продукты, для которых сладость или подобное является нежелательным. Он является высокостабильным, при сравнении с высоконенасыщенными жирными кислотами, которые обычно считают лигандами PPARγ, и является лучшим, что касается формы, подходящей для пищевых продуктов и фармацевтических композиций.
Наилучший вариант осуществления изобретения
Ниже настоящее изобретение описано более детально при помощи ссылок на примеры, но диапазон настоящего изобретения не ограничен данными примерами.
(Пример 1) Экстрагирование и выделение соединения из лакричника (1)
Мелко измельченный продукт (1,2 кг) лакричника (G. uralensis) погружали в 5,5 л этилацетата и экстрагировали в течение 7 дней при комнатной температуре при затенении. Затем смесь фильтровали для получения экстракта. Экстракт концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали 74,0 г экстракта. Полученный экстракт подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (1500 мл) для получения фракции, элюируемой хлороформом: метанолом 19:1 (об/об). Элюирующую фракцию концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали 55,4 г необработанной фракции. Данную необработанную фракцию очищали, повторяя колоночную хроматографию на силикагеле, колоночную хроматографию на ODS силикагеле, высокоэффективную жидкостную хроматографию, оснащенную колонкой ODS, гель-фильтрационную колоночную хроматографию и фракционную тонкослойную хроматографию. Таким образом, получали соединение 1 (225 мг), соединение 2 (80,7 мг), соединение 3 (19,6 мг), соединение 4 (22,2 мг), соединение 5 (3,9 мг), соединение 6 (72,8 мг), соединение 7 (28,3 мг), соединение 8 (12,0 мг), соединение 9 (6,8 мг), соединение 10 (8,5 мг), соединение 11 (58,7 мг) и соединение 12 (10,2 мг).
В результате структурного анализа, соединения 1-3 и 5-12 являются известными соединениями и соответственно идентифицированы как следующие: соединение 1 представляет собой гликумарин, соединение 2 представляет собой глицирин, соединение 3 представляет собой глиураллин В, соединение 5 представляет собой эхинатин, соединение 6 представляет собой изоликофлавонол, соединение 7 представляет собой дегидроглиасперин С, соединение 8 представляет собой глиасперин В, соединение 9 представляет собой глицирризофлаванон, соединение 10 представляет собой люпивитеон, соединение 11 представляет собой глиасперин D и соединение 12 представляет собой семиликоизофлавон В. Кроме того, при структурной идентификации данных соединение, спектральные данные, описанные в работах S. Demizu, et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 36, 3474-3479 (1988) относятся к соединению 1, Kinoshita, et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 26, 1350140 (1978) относятся к соединению 2, M. Shibano, et al., Heterocycles, 45, 2053-2060 (1997) относятся к соединениям 3 и 7, K. Kajiyama, et al., Phytochemistry, 31, 3229-3232 (1992) относятся к соединению 5, T. Hatano, et al., chemical and Pharmaceutical Bulletin, 36, 2090-2097 (1988) относятся к соединениям 6 и 9, L. Zeng, et al., Heterocycles, 34, 575-587 (1992) относятся к соединениям 8 и 11, Y. Hashidoko, et al., Agricultural and Biological Chemistry, 50, 1797-1807 (1986) относятся к соединению 10 и F. Kiuchi, et al., Heterocycles, 31, 629-636 (1990) относятся к соединению 12.
Соединение 4 является новым соединением, и его структура была определена как 3-(2',4'-дигидроксифенил)-6-(3'', 3''-диметилаллил)-5,7-диметокси-2Н-хромен при помощи спектрального анализа, центрированного на пространственном ЯМР (1Н-1Н COSY, HMQC, HMBC, PHNOESY), оно было названо дегидроглиасперином D.
Характеристика и спектральные данные соединения 4 были следующие:
Дегидроглиасперин D, коричневый порошок, C22H24O5.
EI-MS m/z: 368,1610[M] + (рассчитанное значение; C22H24O5 368,1624).
Уфλмакс (метанол) нм: 330 (logε = 4,25), 243 кор. (logε = 4,21).
ИК (таблетка KBr) см-1: 3375, 2929, 1613, 1516, 1458, 1308, 1198, 1164, 1114, 1092, 1024, 978, 837.
1H-ЯРМ (диметилдисульфоксид) м.д.: 7,06 (1H, д, J=8,4 Гц, H-6'), 6,68 (1H, c, H-4), 6,34 (1H, д, J=2,3 Гц, H-3'), 6,33 (1H, с, H-8), 2,26 (1-H, дд, J=8,4, 2,3 Гц, H-5'),5,09 (1H, шир.т, J=6,9 Гц, H-10), 4,90 (2H, с, H-2), 3,75 (3H, с, C-7-OMe), 3,67 (3Н, с, C-7-OMe), 3,18 (2H, шир.д, J=6,7 Гц, H-9), 1,71 (3H, с, Me-13), 1,63 (2H, с, Me-12).
13C-ЯРМ (диметилдисульфоксид) м.д.: 67,9 (C-2), 128,8 (C-3), 114,7 (C-4), 110,4 (C-4a), 154,9 (C-5), 115,6 (C-6), 158,0 (C-7), 95,8 (C-8), 153,2 (C-8a), 22,6 (C-9), 124,1 (C-10), 130,4 (C-11), 26,0 (C-12), 18,1 (C-13), 116,8 (C-1'), 156,7 (C-2'), 103,3 (C-3'), 158,7 (C-4'), 107,4 (C-5'), 129,2 (C-6'), 62,3 (C-5-OMe), 56,3 (C-7-Me)
(Пример 2) Экстрагирование и выделение соединения и лакричника (2)
В той же методике, что и в примере 1, соединения 13-17 получали путем экстрагирования мелко измельченного продукта лакричника (G. uralensis) этанолом для проведения различной хроматографии. В результате структурного анализа были идентифицированы следующие соединения; соединение 13 представляло собой изоликвиритигенин, соединение 14 представляло собой 3-О-метиловый сложный эфир кемпферола, соединение 15 представляло собой ликофлавонол, соединение 16 представляло собой топазолин и соединение 17 представляло собой глицирризофлавон.
(Пример 3) Экстрагирование и выделение соединения из лакричника (3)
В той же методике, что и в примерах 1 и 2, соединения 18-23 и соединения 24-28 получали путем экстрагирования мелко измельченного продукта лакричника (G. glabra) и мелко измельченного продукта лакричника (G. inflata) этанолом соответственно. В результате структурного анализа были идентифицированы следующие соединения; соединение 18 представляло собой глабридин, соединение 19 представляло собой глабрен, соединение 20 представляло собой гиспаглабридин В, соединение 21 представляло собой 4'-О-метилглабридин, соединение 22 представляло собой 3'-гидрокси-4'-О-метилглабридин, соединение 23 представляло собой глаброл, соединение 24 представляло собой ликохалькон А, соединение 25 представляло собой ликохалькон В, соединение 26 представляло собой ликохалькон С, соединение 27 представляло собой глицирдион А и соединение 28 представляло собой глицирдион С.
В таблицах 10-13 показаны структурные формулы соединений 1-28.
(Пример 4) Измерение активности лиганда PPARγ
Клетки CV-1 (культивируемые клетки, полученные из почки самца Африканской зеленой макаки) инокулировали в 96-луночный планшет для культивирования в концентрации 6×103 клеток/лунку и инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 24 часов. Применяемой средой была DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла: GIBCO), содержащая 10% ФТС (FBS) (фетальной телячьей сыворотки), 10 мл/л раствора пенициллина и стрептомицина (содержащего 5000 МЕ/мл и 5000 мкг/мл, соответственно:GIBCO) и 37 мг/л аскорбиновой кислоты (Wako Chemical Industries, Ltd). Клетки промывали OPTI-MEM (GIBCO) и затем проводили трансфекцию pM-mPPARγ и 4xUASg-luc посредством Lipofect Amine Plus (GIBCO). PM-mPPARγ представляет собой плазмиду для экспрессии химерного белка, включающего ген фактора транскрипции дрожжей GAL4 (последовательность аминокислот 1-147) и связанный с ним мышиный ген участка связывания лиганда PPARγ (последовательность аминокислот 174-475). 4xUASg-luc представляет собой репортерную плазмиду, включающую четыре последовательности ответа GAL4 (UASg), встроенные в участок, выше гена люциферазы. Через приблизительно 24 часа после трансфекции, среду меняли на среду, содержащую образец, и клетки культивировали в течение 24 часов (n=4). Среду, содержащую образец получали путем растворения образца в диметилсульфоксиде (ДМСО) в количестве 1/1000 из расчета на среду, тогда как для контрольной группы, применяли ДМСО в количестве 1/1000 из расчета на среду, вместо образца. После того как клетки промывали Са- и Mg-содержащим фосфатным буферным физиологическим раствором (ФБС), к ним добавляли LucLite (Packard) и измеряли интенсивность люциферазной люминесценции с помощью избирательного счетчика сцинтилляции/люминесценции Topcount (Packard).
В контрольной группе оценивали рМ (плазмиду, из которой удалили участок гена, связывающий лиганд PPARγ) на месте pM-mPPARγ таким же образом, как и в исследуемой группе. Для каждого образца рассчитывали соотношение (исследуемая группа/контрольная группа) средней интенсивности люминесценции исследуемой группы (n=4) к таковой контрольной группы, и специфическую активность относительно активности необработанного контроля рассматривали как активность лиганда PPARγ образца.
В таблицах 14-17 показаны результаты измерений активности лиганда PPARγ соединений 1-28, полученных в примерах 1-3. В качестве сравнительных соединений измеряли глицирризин (глицирризовая кислота, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), глицирретиновую кислоту (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и кверцетин (Sigma), по их активности лиганда PPARγ.
(глицикумарин)
(глицирин)
(глиураллин В)
(дегидроглиасперин D)
(эхинатин)
(изоликофлавонол)
(дегидроглиасперин С)
(глиасперин В)
(глицирризофлаванон)
(люпивитеон)
(глиасперин D)
(семиликоизофлавон B)
(изоликвиритигенин)
(кемпферол-3-О-метиловый эфир)
(ликофлавонол)
(топазолин)
(глицирризофлавон)
(глабридин)
(глабрен)
(гиспаглабридин B)
(4'-О-метилглабридин)
(3'-гидроксил-4'-О-метилглабридин)
(глаброл)
(ликохалькон А)
(ликохалькон В)
(ликохалькон С)
(глицирдион А)
(глицирдион С)
Вышеуказанную активность лиганда PPARγ каждого соединения сравнивали с таковой положительного контроля, троглитазона (Sankyo Co., Ltd.). В результате было обнаружено, что соединения 1-19, 21-24, 26 и 27 имеют более высокую активность лиганда PPARγ, чем положительный контроль, содержащий 0,5 мкмоль троглитазона. Также было обнаружено, что соединения 20, 25 и 28 имеют активность лиганда PPARγ, хотя она несколько слабее, чем таковая у положительного контроля, содержащего 0,5 мкмоль троглитазона. Однако глицирризин, который является гидрофильным соединением и главным компонентом лакричника, глицирретиновая кислота (производное глицирризина, у которого углеводный остаток гидролизован) и кверцетин (флавоноловое производное соединения 6, в котором ОН группа замещает прениловую группу), не имело активности лиганда PPARγ. Тот факт, что кверцетин не имеет активности лиганда PPARγ, соответствует информации в литературе (Liang, Y. C., et al., FEBS Letters, 496, 12-18, 2001).
(Пример 5) Действие на модели сахарного диабета 2 типа у мышей
С применением мышей линии KK-Ay, которые генетически страдают ожирением и сахарным диабетом типа 2, оценивали действие соединения 2 на сахарный диабет. В качестве положительного контроля использовали пиоглитазон, то есть средства для улучшения состояния инсулинорезистентности/средства для лечения сахарного диабета типа 2.
Мышей линии KK-Ay (самки, в возрасте 15 недель) делили на 3 группы, каждая из которых состояла из 5 мышей, и им свободно давали корм, включающий только основную диету, то есть порошкообразный CE-2 (CLEA Japan, Inc.) для группы, не получающей добавок (контрольной группы), корм, включающий основную диету и пиоглитазон, группе, получающей пиоглитазон, и корм, включающий основную диету и соединение 2, группе, получающей соединение 2. Для пиоглитазона, таблетки ACTOS 30 (содержащие 30 мг пиоглитазона в таблетке, Takeda Chemical Industries, Ltd.) размалывали в агатовой ступке и добавляли в основной рацион, так, чтобы содержание пиоглитазона в окончательном корме составляло 0,02%. Соединение 2 получали при помощи той же методики, что и в примере 1, и добавляли к основному рациону так, чтобы содержание соединения 2 в окончательном корме составило 0,1%. За день до введения и через 4 дня после введения из хвостовой вены мышей брали небольшое количество крови и измеряли уровень глюкозы крови при помощи простого аппарата для измерения глюкозы Glutest Ace (Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.). В таблице 18 показаны результаты.
После того как смешанный корм давали в течение 1 недели, мыши голодали в течение ночи, а затем им проводили тест толерантности к глюкозе. То есть 20 мг/кг пиоглитазона или 100 мг/кг соединения 2, растворенного в 0,5%-ном растворе карбоксиметилцеллюлозы натрия (КМЦ-Na (CMC-Na)), принудительно водили перорально голодным мышам. Группе, которой не вводили препарата (контрольной группе), вводили 0,5%-ный раствор КМЦ-Na в количестве 5 мл/кг. Через 30 минут после введения, мышам давали 2 г/кг 40%-ного раствора глюкозы. Перед нагрузкой сахаром и через 30 минут, 1 час и 2 часа после нагрузки сахаром из хвостовой вены мышей брали небольшое количество крови и измеряли в них уровень глюкозы крови при помощи простого аппарата для измерения глюкозы Glutest Ace (Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.). В таблице 19 показаны результаты.
Как видно из таблицы 18, уровень глюкозы крови (среднее ± СО, n=5) мышей из группы, получающей соединение 2, был статистически достоверно снижен таким же образом, что и таковой у мышей из группы, получающей пиоглитазон, на четвертый день после введения. Как видно из таблицы 19, соединение 2, как пиоглитазон, статистически достоверно ингибировал быстрое повышение уровня глюкозы крови после нагрузки сахаром. Данные результаты подтверждают, что соединение 2 обладает снижающим действием и действием ингибирующим повышение уровня глюкозы крови, следовательно, было предположено, что данное соединение обладает действием, улучшающим состояние инсулинорезистентности, подобно пиоглитазону.
(Пример 6)
К мелко измельченному продукту (500 г) лакричника (G. uralensis) (Kaneka Sun Spice Co., Ltd) добавляли 5 кг этанола (99,5% (об)). Смесь экстрагировали при 25°С в течение 5 часов и остаток фильтровали для получения экстракта. Растворитель удаляли из полученного экстракта при пониженном давлении и получали 45 г экстракта лакричника, имеющего цвет от желто-коричневого до темно-коричневого. Данный экстракт лакричника проявлял хорошую активность лиганда PPARγ. В таблице 20 показано содержание ингредиентов, обладающих активностью лиганда PPARγ и глицирризин, содержащийся в данном экстракте лакричника.
Кроме того, содержание данных активных ингредиентов и глицирризина было получено методом анализа ВЭЖХ при следующих условиях.
(Условия анализа глицирризина)
Колонка; J'sphere ODS-H80 (YMC Co., Ltd.) 4,6 мм (внутренний диаметр) × 250 мм (длина); температура колонки: 40°С; подвижная фаза: ацетонитрил/10 ммоль раствора фосфорной кислоты = 33/67 (об/об); скорость потока: 1 мл/мин; длина волны детекции: 254 нм; время удерживания: 27,1 мин.
(Условия анализа активного ингредиента)
Колонка; J'sphere ODS-H80 (YMC Co., Ltd.) 4,6 мм (внутренний диаметр) × 250 мм (длина); температура колонки: 40°С. Подвижная фаза: градиент, при котором соотношение ацетонитрила относительно 10 ммоль раствора фосфорной кислоты поддерживается на уровне 35% до 15 мин после начала анализа, затем повышается до 70% с постоянной скоростью в период от 15 мин до 65 мин, а затем поддерживается 70% в период от 65 мин до 70 мин. Скорость потока: 1 мл/мин, длина волны детекции: 254 нм. Время удерживания для каждого компонента является следующим: 5,2 мин для ликохалькона В, 13,3 мин для глицирризофлаванона, 14,7 мин для изоликвиритигенина, 32,7 мин для глицикумарина, 34,2 мин для семиликоизофлавона В, 35,9 мин для глабрена, 36,3 мин для глицирризофлавона, 37,2 мин для дегидроглиасперина С, 39,1 мин для ликохалькона С, 40,2 мин для ликохалькона А, 44,7 мин для глабридина, 48,1 мин для глицирина, 51,1 мин для глиасперина В, 51,8 мин для глаброла, 52,7 мин для глиасперина D, 53,4 мин для глицирдиона А, 53,5 мин для 3'-гидроксил-4'-О-метилглабридина, 55,2 мин для дегидроглиасперина D, 58,7 мин для глиураллина В, 59,8 мин для 4'-О-метилглабридина, 63,0 мин для глицирдиона С и 74,1 мин для гиспаглабридина В.
(Пример 7)
Экстракт лакричника (18 г) получали той же самой методикой, как в примере 6, кроме того, что экстрагирование проводили с помощью ацетона, вместо этанола. Полученный экстракт лакричника проявлял хорошую активность лиганда PPARγ. Содержание активных ингредиентов и глицирризина, содержащегося в таком экстракте лакричника, оценивали таким же образом, что и в примере 6, и в таблице 21 показаны результаты.
(Пример 8)
Экстракт лакричника (18 г) получали той же самой методикой, как в примере 6, кроме того, что экстрагирование проводили с помощью этилацетата, вместо этанола. Полученный экстракт лакричника проявлял хорошую активность лиганда PPARγ. Содержание активных ингредиентов и глицирризина, содержащегося в таком экстракте лакричника, оценивали таким же образом, что и в примере 6, и в таблице 22 показаны результаты.
(Сравнительный пример 1)
Экстракт лакричника получали той же самой методикой, как в примере 6, однако экстрагирование проводили с помощью воды, вместо этанола. Полученный экстракт лакричника не проявлял активности лиганда PPARγ.
(Пример 9)
К мелко измельченному продукту (500 г) лакричника (G. uralnsis) (Kaneka Sun Spice Co., Ltd) добавляли 5 кг воды, и смесь экстрагировали при 60°С в течение 1 дня. Затем остаток фильтровали и сушили при пониженном давлении. К полученному пре-экстрагированному остатку добавляли 2,5 кг этанола (99,5% об) и затем экстрагировали при 25°С в течение 5 часов и остаток фильтровали для получения экстракта. Растворитель удаляли из полученного экстракта при пониженном давлении и получали 47 г экстракта лакричника, имеющего цвет от желто-коричневого до темно-коричневого. Полученный экстракт лакричника проявлял хорошую активность лиганда PPARγ. В таблице 23 показано содержание активных ингредиентов лиганда PPARγ и глицирризина, содержащегося в данном экстракте лакричника.
(Пример 10)
Экстракты лакричника (25,8 г и 29,5 г) были получены путем экстрагирования резаных продуктов (соотношение общей площади поверхности коры составляет около 80% общей площади поверхности лакричника) лакричника (G. uralensis) 99,5% (об) и 95% (об) этанола (содержание воды было 0,5 и 5,0% (об) соответственно), соответственно, при помощи той же самой методики, что и в примере 6. Полученные экстракты лакричника проявляли хорошую активность лиганда PPARγ. В таблице 24 показано содержание ингредиентов, проявляющих активность лигандов PPARγ и глицирризина, содержащихся в данных экстрактах лакричника.
(Пример 11)
Экстракт лакричника получали из мелко измельченного продукта лакричника (G. glabra) той же самой методикой, как в примере 6. Содержание активных ингредиентов и глицирризина, содержащегося в таком экстракте лакричника, оценивали таким же образом, что и в примере 6, и в таблице 25 показаны результаты.
(Пример 12)
Экстракт лакричника получали из мелко измельченного продукта лакричника (G. inflata) той же самой методикой, как в примере 6. Содержание активных ингредиентов и глицирризина, содержащегося в таком экстракте лакричника, оценивали таким же образом, что и в примере 6, и в таблице 26 показаны результаты.
(Пример 13)
Кукурузный крахмал, лактозу, карбоксиметилцеллюлозу и стеарат магния смешивали с экстрактом лакричника, полученном в примере 6. Кроме того, к ним добавляли водный раствор поливинилпирролидона в качестве связующего агента и смесь гранулировали обычными способами. К продукту добавляли тальк, смешивали и прессовали в таблетки, имеющие следующий состав.
Промышленная применимость
В соответствии с настоящим изобретением, лиганд рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPAR), и композиция, содержащая его, может быть получена просто и эффективно. Композиция по настоящему изобретению является полезной для улучшения состояния инсулинорезистентности или в качестве средства для предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности.
Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств, в частности, обеспечивает лиганд рецептора, активируемого пролифератором пероксисом γ (PPAR γ), и композицию, включающую указанный лиганд, для улучшения состояния инсулинорезистентности или для предотвращения и/или улучшения состояния синдрома инсулинорезистентности. Настоящее изобретение относится к лиганду рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, который включает пренилфлавоноид, производное халькона, производное флавонола, и их соль, гликозид и/или этерифицированную форму; к композиции, содержащей вышеуказанный лиганд; к растительному экстракту, содержащему вышеуказанный лиганд; к новому соединению (дегидроглиасперину D), представленному формулой:
4 н. и 29 з.п. ф-лы, 26 табл.
где, по меньшей мере, один из R1-R7 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл, включающий -СН=СНС(СН3)2О-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3;
производное изофлав-3-ена общей формулы (2)
где, по меньшей мере, один из R1-R7 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл, включающий -СН=СНС(СН3)2О-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3;
производное изофлавана общей формулы (3)
где, по меньшей мере, один из R1-R7 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл, включающий -СН=СНС(СН3)2О-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3;
производное изофлаванона общей формулы (4)
где, по меньшей мере, один из R1-R8 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл, включающий -СН=СНС(СН3)2О-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3;
производное изофлавона общей формулы (5)
где, по меньшей мере, один из R1-R9 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл,
включающий -СН=СНС(СН3)2О-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3;
производное флавонола общей формулы (6)
где R1 представляет собой ОН или ОСН3, по меньшей мере один из R2-R9 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл, включающий -СН=СНС(СН3)2О-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3;
производное флаванона общей формулы (7)
где, по меньшей мере, один из R1-R8 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл, включающий -СН=СНС(СН3)2О-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3;
производное халькона общей формулы (8)
где, по меньшей мере, один из R1-R9 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл, включающий -СН=СНС(СН3)2O-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3; или
производное дибензоилметана общей формулы (9)
где, по меньшей мере, один из R1-R7 представляет собой прениловую группу или структуру, где 2 соседние R-группы образуют 6-членный цикл, включающий -СН=СНС(СН3)2O-, а другие R-группы представляют собой Н, ОН или ОСН3;
производное халькона, отличное от пренилфлавоноидов, представляющее собой эхинатин, изоликвиритигенин, ликохалькон А или ликохалькон В; и
производное флавонола, отличное от пренилфлавоноидов, представляющее собой 3-О-метиловый эфир кемпферола.
где содержание глицирризина составляет 0,001-0,5% по массе по сухому весу.
| LIANG Y | |||
| C | |||
| et al., FEBS Letters, 496, 12-18, 2001 | |||
| FUKAI Т et al, Cytotoxic activity of low molecular weight polyphenols against human oral tumor cell lines | |||
| Anticancer Res | |||
| ЩИТОВОЙ ДЛЯ ВОДОЕМОВ ЗАТВОР | 1922 |
|
SU2000A1 |
| SUH N, et al, A new ligand for the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-gamma), GW7845, inhibits rat mammary | |||
