СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ БЕЛКОВЫХ ПЛЕНОК НА ТВЕРДЫХ ПОДЛОЖКАХ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/00 C12N11/12 C07K17/08 

Изобретение относится к таким областям как биохимия, биофизика, медицинская диагностика и может быть использовано в качестве модели клеточной мембраны при исследовании механизма действия лекарственных мембранопротекторных препаратов, а также для создания активных элементов биосенсорных устройств.

Известен метод создания белковых слоев на твердой подложке, моделирующий липопротеидные системы (О.М.Полторак и др. Липопротеидные слои на твердых носителях и свойства биомембран. // Вестник московского университета, 1970, №2, С.133-146). Сущность этого метода состоит в том, что из органического растворителя на подложку с большой удельной поверхностью наносится липидный слой, на котором в дальнейшем проводится адсорбция белка из водного раствора. Путем подбора полярности носителя-подложки и применяемого для липида растворителя осуществляется необходимая ориентация молекул в липидных слоях. Проведение работ по такому способу иммобилизации белковых глобул позволило установить, что монослои смеси липидов являются эффективными носителями для нековалентной иммобилизации ферментов. Недостатком метода является необходимость проведения большой предварительной работы по получению изотерм адсорбции и их анализу. При этом отсутствует точная информация об ориентационном расположении молекул липида, т.к. в процессе адсорбции белка при смене неполярного растворителя на водный раствор белка возможна переориентация молекул. При работе с пористыми носителями требуется значительное количество препарата белка.

Весьма перспективен способ формирования упорядоченных ансамблей белковых молекул на межфазной границе воздух-вода в ленгмюровской ванне, предложенный И.Ленгмюром. Широко реализуется подход к формированию слоя белка на субфазе, использующий электростатическую адсорбцию заряженных белков из водной субфазы на противоположно заряженный ленгмюровский монослой амфифильных молекул. Затем эти комплексные монослои переносят методом Ленгмюра-Блоджетт на подложки (С.Ю.Зайцев и др. Биосенсор на основе ленгмюровских пленок глюкозоксидазы. // Журнал аналитической химии, 1990, Т.45, №7, С.1452-1455). Недостатком этого метода организации белоксодержащих пленок является невозможность целенаправленного распределения белковых молекул в монослое. Распределение белка под монослоем амфифильного соединения контролируется диффузионными процессами в субфазе, отсюда возможна плохая воспроизводимость структуры пленки. Проведение иммобилизации белка в обьеме субфазы обычно требует большого расхода белкового препарата, что значительно удорожает формируемый образец. Кроме того, успешное проведение эксперимента требует предварительных длительных исследований условий иммобизизации белка в слое с оценкой влияния поверхностного давления и временного фактора. Необходим подбор оптимальных условий переноса смешанного монослоя на твердую подложку (J.Chovelon et al Influence of the surface pressure on the organization of mixed Langmuir films of behenic acid and glucose oxidase. // Journal of Biological Physics and Chemistry 2001, V.1, N.2, P.68-75).

Приведенные примеры демонстрируют многолетние усилия, предпринятые для создания упорядоченных белковых пленок с целью использования их в биосенсорах и элементах биоэлектроники. Процесс связывания белка сильно зависит от природы последнего. На сегодняшний день универсального и надежного метода для создания упорядоченных белковых моно- и мультислоев не разработано. Получаемые белковые пленки приближенно передают электрофизические и геометрические свойства отдельных элементов биомембранных структур, хотя моделирование химических и структурных свойств биомембран позволяет изучать отдельные свойства этих сложных систем.

Ближайшим техническим решением к предлагаемому способу является метод формирования упорядоченных белковых пленок путем нанесения монослоя иммобилизующего агента по технологии Ленгмюра-Блоджетт на твердую подложку с последующей адсорбцией на ней белковых молекул из водного раствора путем молекулярной самосборки и повторного нанесения монослоя иммобилизующего агента на поверхность образованного белкового слоя (Н.Н.Новикова и др. Исследование белково-липидных мембранных моделей с помощью рентгенофлуоресцентных методик. // Поверхность, 2005, №8, С.71-77). В данном способе проведена иммобилизация белковых молекул на монослое фосфолипида с целью изучения структурно-функциональных свойств биологических мембран и их компонентов при повреждении белковых молекул ионами тяжелых металлов. Иммобилизацию Са-АТФазы проводили на монослое фосфолипида DPPE, предварительно перенесенного методом Ленгмюра-Блоджетт на твердую кремниевую подложку. Адсорбцию белковых молекул из водного раствора проводили путем самосборки. Поднимая твердую подложку через вновь сформированный монослой DPPE, обеспечивали формирование покровного слоя фосфолипида на поверхности белкового монослоя. Таким образом, белковая пленка состояла из трех слоев:

I - монослой фосфолипида, II - белковые молекулы, III - монослой фосфолипида (фиг.1).

Данный способ формирования белкового слоя может быть принят за прототип.

Получение белкового слоя щелочной фосфатазы по указанному способу, когда в качестве иммобилизующего агента применен традиционно используемый тип липида - дипальмитоилфосфатидилхолин, показало, что распределение белка и липида на твердой подложке может быть дефектным и неоднородным, что является его недостатком из-за неустойчивой воспроизводимости, что видно на фиг.2. Неоднородность состава поверхности в этом случае может быть связана с тем, что природа контактирующей поверхности белка способна изменять характеристики упаковки липидного слоя. Кроме того, использование природных липидных компонентов ограничено рядом факторов: эти соединения являются дорогостоящими; хранятся на холоде и после разгерметизации быстро окисляются на воздухе, что затрудняет их хранение и ухудшает иммобилизирующие свойства липидного монослоя.

Целью данного технического решения является улучшение однородности белоксодержащей пленки за счет повышения степени заполнения, упорядоченности и прочности белковой пленки, а также удешевление способа получения образцов. Поставленная цель достигается тем, что в способе формирования белковых пленок путем нанесения монослоя иммобилизующего агента на твердую подложку по методу Ленгмюра-Блоджетт с последующей адсорбцией на ней белковых молекул из водного раствора путем молекулярной самосборки и повторного нанесения монослоя иммобилизующего агента на поверхность образованного белкового слоя в качестве иммобилизующего агента взят ацетопивалинат целлюлозы.

Авторами был проведен поиск иммобилизирующих соединений органической природы, обладающих достаточной связывающей способностью по отношению к белкам и устойчивостью при хранении с сохранением структурно-функциональных свойств адсорбиуемых ферментов. Также важную роль играет снижение финансовых затрат на используемые реактивы. Таким требованиям отвечает найденный в процессе поиска органический носитель - ацетопивалинат целлюлозы отечественного производства, стоимость которого на 3 порядка ниже фосфолипида. Его использование в качестве иммобилизующего соединения значительно удешевляет получение образцов. Ацетопивалинат целлюлозы отличается термоокислительной устойчивостью, не разрушается при использовании, не загрязняет экосистему его метаболитами, хранится более 7 лет на воздухе при комнатной температуре.

Сущность предлагаемого способа нанесения упорядоченных белковых пленок на твердую подложку основана на использовании в качестве иммобилизующего слоя для белковых молекул смешанного сложного эфира целлюлозы - ацетопивалината целлюлозы, который, не влияя на состояние белковой молекулы, повышает степень упорядоченности молекул белка (микрорельеф белковой пленки с шероховатостью не более 5 нм), увеличивает плотность заполнения белковой пленки и обеспечивает экономическую эффективность предлагаемого способа (снижение стоимости иммобилизирующего слоя и условий его хранения, а также экономное расходование дорогостоящих белковых препаратов). Прочность иммобилизации белка подтверждается увеличением степени плотности заполнения белковой пленки.

Выполнение способа заключается в том, что наносят раствор ацетопиволината целлюлозы на поверхность субфазы в ленгмюровской ванне и формируют ленгмюровский монослой при давлении 30 мН/м. Далее монослой полимера переносят методом вертикального лифта (Ленгмюра-Блоджетт) на гидрофобизированную твердую подложку, которую помещают в кювету на дно ванны. После удаления ленгмюровского слоя с поверхности субфазы кювету, наполненную водой, вынимают из ванны. Иммобилизацию белка на монослой ацетопивалината целлюлозы осуществляют в кювете путем введения в водную среду аликвоты водного буферного раствора белка. Проводят адсорбцию белковых молекул при комнатной температуре (или в холодильнике), промывают подложку водой, кювету с иммобилизованным белком снова помещают в ленгмюровскую ванну. Формируют новый монослой полимера, через который вынимают подложку уже с иммобилизованным белком. Конечный вариант иммобилизованной пленки схематично изображен на фиг.3. В качестве белковых молекул могут быть иммобилизованы металлоферменты, такие как щелочная фосфатаза, каталаза.

Характеристика структурно-функциональных свойств ацетопивалината целлюлозы

Получение ацетопивалината целлюлозы проводят методом смешанных ангидридов с использованием ангидрида трифторуксусной кислоты. Такая методика позволяет целенаправленно синтезировать эфиры целлюлозы с определенным количеством гидроксильных и ацитильных групп в глюкозидном кольце, что особенно важно при получении соединений, используемых в дальнейшем для формирования устойчивых ленгмюровских монослоев на жидкой субфазе и пленок Ленгмюра-Блоджетт. Оптимальное соотношение гидрофильных и гидрофобных остатков в жесткоцепном полимере - ацетопивалинате целлюлозы улучшает его иммобилизующие свойства.

Ацетопивалинат целлюлозы имеет следующее строение:

Количество заместителей ОН-группы (на 300 глюкозидных колец) в молекуле целлюлозы: х=175 (пивалинат), у=10 (ацетат), z - 115 (гидроксильные ОН - группы, оставшиеся незамещенные). Такая структура позволяет варьировать иммобилизующую способность полимера при изменении количества замещенных ОН-групп.

Монослой ацетопивалината целлюлозы не нуждается в специальном химическом модифицировании после нанесения на твердую подложку (как в патенте Р 63231257 от 1988-09-27, Yano E.J. и др.), т.к. использование ленгмюровской технологии предопределяет ориентацию гидрофильных функциональных групп эфира целлюлозы на межфазной границе воздух-вода. Это делает удобным его использование для создания плотной упаковки упорядоченного слоя адсорбированного белка, в отличие от липидного монослоя, использование которого в ряде случаев дает дефектное заполнение белкового монослоя.

2. Примеры реализации заявляемого способа

2.1. Для формирования белоксодержащей пленки были использованы:

Ацетопивалинат целлюлозы - 0,3 мг/мл;

Каталаза - 2,5 мг/мл;

Щелочная фосфатаза - 250 мкг/мл;

Кремниевые подложки размером 10×30 мм²;

Ленгмюровская ванна с весами Вильгельми для измерения поверхностного давления ленгмюровского монослоя с чувствительностью 0,0001Н/м и с подвижным барьером.

В качестве подложек использованы полированные кремниевые пластины монокристаллического кремния (100).

2.2. Получение иммобилизующего монослоя ацетопивалината целлюлозы на твердой подложке.

На поверхность водной субфазы (тридистиллированная вода рН 6,6) в ленгмюровской ванне наносят иммобилизующий компонент - 70 мкл раствора (0,3 мг/мл) ацетопивалината целлюлозы в хлороформе. После растекания раствора на поверхности водной субфазы и удаления растворителя (через 15 мин) монослой поджимают барьером со скоростью 0,01 м²/мин. Монослой поджимают до величины поверхностного давления Р=30 мН/м, переносят на твердую подложку (гидрофобизированный кремний) размером 30×10 мм методом вертикального лифта со скоростью 3 мм/мин. Подложку с монослоем иммобилизирующего агента помещают в кювету, находящуюся на дне ленгмюровской ванны. После удаления с поверхности субфазы монослоя ацетопивалината целлюлозы подложку в кювете, заполненной водой, вынимают из ванны и используют для адсорбции белка.

2.3. Иммобилизация белка на ЛБ-монослое ацетопивалината целлюлозы на твердой подложке

Адсорбционную иммобилизацию белковых молекул щелочной фосфатазы на перенесенном монослое иммобилизирующего ацетопивалината целлюлозы проводят из рабочего раствора с концентрацией белка 20 мкг/мл в течение 10 часов при комнатной температуре. Иммобилизацию белка каталазы из раствора (2 мг/мл) проводят на ЛБ монослое ацетопивалината целлюлозы в аналогичных условиях. Процедура формирования белковых пленок на основе вышеуказанных ферментов является оптимальной.

Для формирования защитного покровного слоя ацетопивалината на поверхности белкового монослоя кювету с образцом помещают на дно ленгмюровской ванны (субфаза без монослоя иммобилизирующего компонента). Далее формируют на субфазе монослой ацетопивалината целлюлозы и подложку вынимают через вновь сформированный монослой. На белковый слой переносят монослой иммобилизирующего компонента при поверхностном давлении 30 мН/м со скоростью вертикального движения подложки 1,5 мм/мин. Таким образом получены образцы иммобилизованных белков по предлагаемому способу.

2.4. Оценка методом атомно-силовой микроскопии морфологии поверхности белоксодержащих пленок.

Сравнительный анализ данных, полученных на атомно-силовом микроскопе по белковым пленкам на липидном слое (Фиг.2) и на целлюлозных слоях с щелочной фосфатазой (Фиг.4) и с каталазой (Фиг.5), доказывает, что применение ацетопивалината целлюлозы в качестве иммобилизующего агента значительно улучшает упорядоченность и прочность белковой пленки, что позволяет использовать предлагаемый способ для изготовления модельных систем клеточной мембраны и для создания активных элементов биосенсорных устройств.

Изобретение относится к таким областям как биохимия, биофизика, медицинская диагностика и может быть использовано в качестве модели клеточной мембраны при исследовании механизма действия лекарственных мембранопротекторных препаратов, а также для создания активных элементов биосенсорных устройств. Сущность способа нанесения белковых пленок на твердую подложку основана на использовании в качестве иммобилизующего слоя для белковых молекул смешанного сложного эфира целлюлозы - ацетопивалината целлюлозы, который повышает степень упорядоченности молекул белка, увеличивает плотность заполнения белковой пленки и обеспечивает экономическую эффективность предлагаемого способа. 5 ил.

Способ формирования белковых пленок на твердых подложках путем нанесения монослоя иммобилизующего агента по технологии Ленгмюра-Блоджетт с последующей адсорбцией на монослое белковых молекул из водного раствора путем молекулярной самосборки и повторного нанесения монослоя иммобилизующего агента на поверхность образованного белкового слоя, отличающийся тем, что в качестве иммобилизующего агента используют ацетопивалинат целлюлозы.