Способ получения средства, оказывающего гепатозащитное и желчегонное влияние Российский патент 2024 года по МПК A61K36/28 B01D11/02 A61P1/16 

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства, оказывающего гепатозащитное и желчегонное влияние.

Проблемы лечения и профилактики заболеваний печени остаются актуальными ввиду их почти эпидемической распространенности, что обусловлено загрязнениями внешней среды, в том числе воды и продуктов питания чужеродными химическими соединениями (ксенобиотиками), увеличением алкоголизации населения [3, 9], неконтролируемым приемом медикаментов и нерациональным питанием. Известно, что в мире насчитывается более 1 миллиарда человек, страдающих патологией печени, что превышает распространенность ВИЧ-инфекции. Эпидемиологические исследования последних лет показали, что хроническим гепатитом страдает более 5% взрослого населения. Заболеваемость вирусными гепатитами А, В, С, D, Е, G и ТТ неуклонно увеличивается и в настоящее время в мире насчитывается около 350 млн. носителей HBV и не менее 150 млн больных хроническим гепатитом С. Во многих странах продолжает возрастать употребление алкоголя. Установлено, что при алкогольной интоксикации повреждаются биологические мембраны клеток печени вследствие активации свободнорадикального окисления липидов [1, 2, 3, 4, 5, 9, 12, 13].

Несмотря на то, что в последние годы достигнут значительный прогресс в диагностике и лечении заболеваний печени, связанный с использованием молекулярно-биологических методов диагностики, появлением возможности этиотропного лечения вирусных гепатитов и применением фармакологических препаратов, тормозящих развитие фиброза печени, тем не менее лечение в целом представляет собой сложную проблему [8, 9]. Все эти факторы обусловливают необходимость поиска новых лекарственных средств, способных повысить резистентность печени к воздействию ксенобиотиков. При лечении и профилактике заболеваний печени целесообразно назначение гепатопротекторов растительного происхождения, имеющих выраженный терапевтический эффект, постепенность наступления эффекта, минимум побочного влияния и возможность длительного курсового назначения [15].

Самыми распространенными среди гепатопротекторов являются препараты расторопши пятнистой: карсил, легалон, лепротек, силибор, гепарсил. Расторопша также входит в состав комбинированных препаратов: гепатобене (дымянка лекарственная), гепатофальк (чистотел большой, турмерик яванский), сибектан (пижма, зверобой, береза). Главным действующим компонентом этих препаратов является силимарин, представляющий собой смесь четырех основных соединений флавоглинанов: силибинина, силидианина, силикристина и изосилибина.

В гепатологии нашли широкое применение препараты на основе суммы флавоноидов бессмертника песчаного (фламин). Они стимулируют желчеобразование. Кроме того, обладают спазмолитической активностью по отношению к гладкой мускулатуре желудочно-кишечного тракта и желчевыводящих путей в частности.

В лечебной практике применяется препарат хофитол, представляющий собой экстракт листьев артишока. Его лечебные эффекты обусловлены наличием в нем флавоноидов, фенолокислот, инулина и витаминов.

Из надземной части солянки холмовой получен гепатопротектор лохеин. Экспериментально доказано, что экстракт солянки холмовой является ингибитором свободнорадикальных реакций, уменьшает фиброз и воспалительную инфильтрацию внутридольковой соединительной ткани печени, угнетая синтез коллагена и гликозаминогликанов [10].

Известно, что одной из особенностей восточной медицины является использование для лечения многокомпонентных средств. Считается, что высокая фармакотерапевтическая эффективность многокомпонентных лекарств обусловлена гармоничным сочетанием содержащихся биологически активных веществ в исходных видах растительного сырья [6,7, 16].

Основываясь на данные литературы о химическом составе, фармакологическом действии лекарственных растений нами предлагается способ получения трехкомпонентного средства, оказывающего гепатозащитное и желчегонное влияние, на основе плодов расторопши пятнистой и цветков ноготков лекарственных и ромашки аптечной в виде экстракта сухого.

Препараты расторопши пятнистой являются одними из известных гепатопротекторов. Главным действующим компонентом этих препаратов является силимарин, представляющий собой смесь четырех основных соединений флавоглинанов: силибинина, силидианина, силикристина и изосилибина. Цветки ноготков лекарственных применяюь в медицинской практике как противовоспалительные, антисептические средства [10]. Цветки ромашки аптечной содержат эфирное масло, в составе которого имеется хамазулен, азулен, терпен, сесквитерпен, кадинен, фарнезен, флавоноиды (апигенин, рутин), органические кислоты (салициловая, изовалериановая, каприловая), полисахариды, витамины С, В3, каротин. Препараты ромашки аптечной применяют как противовоспалительные, спазмолитические средства [10].

Гепатопротекторные средства призваны повышать устойчивость печени к патологическим воздействиям, усиливать ее обезвреживающую функцию, стимулировать активность ее ферментных систем и способствовать восстановлению ее функционирования при различных повреждениях. Особое значение имеют гепатопротекторы в комплексной терапии инфекционных заболеваний печени.

В качестве прототипа данного изобретения принят карсил. Карсил относится к суммарным препаратам, содержащим силибинин, силикристин, силидианин, полученных из плодов расторопши пятнистой. Карсил применяют при острых токсических гепатитах, а также для поддерживающей терапии при хронических заболеваниях и при циррозе печени. Гепатопротекторное действие объясняют антиоксидантной активностью, стимуляцией синтеза белка, нормализацией обмена фосфолипидов, структурных элементов печени [10].

Недостатками указанного средства являются слабо выраженное желчегонное и гепатозащитное действие по сравнению со средством, полученным по предлагаемому способу.

Технический результат изобретения - расширение ассортимента лекарственных средств, обладающих гепатозащитным и желчегонным влиянием, за счет использования культивированного растительного сырья, а также доступного экстрагента.

Для этого растительный материал, состоящий из высушенной измельченной растительной смеси со степенью измельчения 1-3 мм, следующего состава (мас. части) расторопши пятнистой (плоды) -40, ноготков лекарственных (цветки) - 40, ромашки аптечной (цветки) - 20 - экстрагируют трехкратно при соотношении 1 мас. ч. сырья: 10 об. ч экстрагента. В качестве экстрагента применяют воду горячую (75°±3°С). При первом и втором контакте фаз экстракцию продолжают в течение 25 минут, третий контакт фаз -15 минут. Экстракцию выполняют при постоянном перемешивании. Водные извлечения после экстракций упаривают до 1/3 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений сепарируют. Полученный продукт доупаривают приблизительно до 1/5 и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта составляет 38% от массы растительного материала. Экстракт сухой, представляет собой аморфный порошок от коричневого до темно - коричневого цвета со специфическим запахом, потеря в массе при высушивании не более 5%. Гигроскопичен, комкуется. Данный способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Использование в качестве экстрагента горячей воды позволяет исключить дополнительные расходы, связанные с организацией хранения и использования спирта этилового на производстве.

При производстве экстрактов из лекарственный растений используют разные экстрагенты - различные концентрации спирта этилового, хлороформ, ацетон, вода очищенная и другие. Наиболее часто применяемый экстрагент этиловый спирт и его различные концентрации. Однако этиловый спирт имеет ряд существенных недостатков: значительно труднее, чем вода, проникает через стенки клеток, отнимая воду у белков и слизистых веществ, превращая их в осадки, тем самым закупоривая поры клеток и тем самым ухудшая диффузию биологически активных веществ. Кроме этого, этиловый спирт относится к веществам, находящимся на предметно-количественном учете, лимитированным продуктам, и отпускается фармацевтическим производством в установленном порядке. Существенным недостатком является огнеопасность и горючесть этилового спирта. Существуют особые требования к производству спиртосодержащей продукции, к условиям организации хранения, транспортирования и отпуска спирта этилового, что требует дополнительных капиталовложений [19]. Это может создать дополнительные трудности для малых предприятий и вновь открывающихся предприятий. В этом плане перспективным экстрагентом является вода, которая обладает следующими преимуществами: хорошо проникает через клеточные стенки, растворяет многие лекарственные вещества, фармакологически и химически индифферентна, соответствует всем требованиям техники безопасности. Для повышения растворимости веществ и интенсификации процесса экстракции можно использовать нагревание.

Отрасль лекарственного растениеводства является новой для Республики Бурятии. В последние годы предприняты попытки создать площади для выращивания лекарственных растений [18]. В состав нового средства нами включено культивируемое растительное сырье плодов расторопши пятнистой, цветков ноготков лекарственных и ромашки аптечной. Содержание биологически активных веществ культивируемого растительного сырья соответствовало требованиям нормативной документации.

Изучено влияние технологических факторов на процесс экстрагирования растительного материала: степени измельчения сырья, соотношение экстрагента и растительного сырья, температурного режима экстракции, продолжительности и кратности числа экстракций. Опыты выполняли в трехкратной повторности и использовали средние значения полученных данных. Эффективность экстракции оценивали по выходу экстрактивных веществ и содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

Определение содержания экстрактивных веществ проводили согласно ОФС.1.5.3.0006.15 «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» [11]. Определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин проводили согласно ФС.2.5.0030.15 «Ноготков лекарственных цветки Calendulae officinalis flores» [17].

В качестве экстрагентов использовали воду холодную и горячую. Полученные данные приведены в таблице 1. С увеличением температуры повышается выход БАВ. Для получения экстракта нами выбрана оптимальная температура 75°С.

Изучено влияние измельчение сбора на процесс экстракции. Растительный сбор измельчали <1,0; 1,0-3,0; 3,0-5,0; 5< мм. Результаты представлены в таблице 2. Экстрагирование выполняли горячей водой 75°С. Наиболее рациональная степень измельчения сырья 1,0-3,0.

Изучена зависимость извлечения экстрактивных веществ при экстракции растительной смеси от соотношения сырье-экстрагент. Экстрагирование выполняли горячей водой 75°С, степень измельчения сырья 1,0-3,0 мм. Результаты представлены в таблице 3. Наиболее оптимальное соотношение сырье-экстрагент 1:10. Дальнейшее увеличение объема экстрагента нерационально.

Чтобы установить продолжительность и кратность числа экстракций изучали время наступления равновесной концентрации в системе «сырье : экстрагент». Для этого проводили 3-хкратную экстракцию измельченной растительной смеси на водяной бане водой горячей при температуре 75°С при соотношении сырья и экстрагента 1:10 при постоянном перемешивании с обратным холодильником. После первого контакта фаз через заданные промежутки времени (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 мин.) извлечения фильтровали, определяли содержание суммы экстрактивных веществ, флавоноидов. В продолжении опыта проводили две последующие экстракции отжатого сырья при тех же промежутках времени, заливая во 2-ом к 3-ем контакте фаз водой горячей 75°С в количестве, равном объему предыдущих слитых извлечений. Извлечения также анализировали на содержание суммы экстрактивных веществ и суммы флавоноидов. Результаты определения представлены в таблице 4. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что равновесное состояние в системе «сырье : экстрагент» для сбора при I, II контакте фаз наступает через 25 минут, при III контакте фаз через 15 минут. Трехкратная экстракция обеспечивает максимальный выход биологически активных веществ.

Пример способа получения средства, оказывающего гепатозащитное и желчегонное влияние: 40,0 г расторопши пятнистой плодов, 40,0 г ноготков лекарственных цветков, 20,0 г ромашки аптечной цветков измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 1,0-3,0 мм. Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой. Заливают 1,0 л горячей водой с температурой 75°С в соотношении сырье : экстрагент 1:10. Экстракцию выполняют в течение 25 мин при постоянном перемешивании при температуре 75±5°С. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Вторую экстракцию выполняют также в течение 25 мин, подавая в экстрактор горячую воду 75°С в количестве, равном слитому от первой экстракций, третью экстракцию выполняют в течение 15 мин, подавая в экстрактор горячую воду 75°С в количестве, равном слитому от второй экстракций. Объединенное водное извлечение упаривают примерно до 1/3 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений подвергают очистке сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при 65-70°С 8 ч. Получают 38,0 г экстракта сухого. Средство, оказывающее гепатозащитное и желчегонное влияние, представляет собой аморфный порошок от коричневого до темно - коричневого цвета со специфическим запахом, потеря в массе при высушивании не более 5%. Гигроскопичен, комкуется.

Определение острой токсичности

Определение острой токсичности нового средства проводили согласно методическим рекомендациям [14]. DL₅₀ рассчитывали с использованием метода Спирмана-Кербера, класс токсичности определяли по классификации К.К. Сидорова (1973). Исследования проведены в соответствии с требованиями, протокол исследований одобрен этическим комитетом ИОЭБ СО РАН (№14 от 2 ноября 2023 г). Животные содержались в одинаковых условиях по 10 особей в клетке со свободным доступом к воде и пище в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики (GLP) и Постановлению Правительства РФ N 855 от 13 июня 2020 г. Экспериментальную работу осуществляли согласно правилам, принятым в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.).

Опыты проведены на интактных белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 250-270 г. Животным однократно внутрибрюшинно вводили средство, оказывающее гепатозащитное и желчегонное влияние, в дозах 1000-7000 мг/кг. Под наблюдением крысы находились 14 суток. В контрольной группе животным вводили в равном объеме дистиллированную воду. В результате исследований установлено, что при внутрибрюшинном введении указанного средства в дозах 1000-3000 мг/кг гибели животных не наблюдали в течение всего срока эксперимента. В первые часы после введения данного средства у крыс отмечали гиподинамию, отказ от корма, которые исчезали ко вторым суткам. При введении средства в дозах 4600-7000 мг/кг животные погибали в течение 1-2 суток. У животных, которым вводили указанное средство в дозах 3500-3800 мг/кг, также наблюдали выраженные признаки интоксикации: отказ от корма, снижение двигательной активности, тахикардию, учащение дыхания. DL₅₀ при внутрибрюшинном введении крысам указанного экстракта составил 4600,1±89,0 мг/кг. при вскрытии погибших крыс наблюдали полнокровие сосудов, стаз форменных элементов крови в сосудах, кровоизлияние под эпикардом, вздутие желудка, полнокровие сосудов печени, легких и сердца.

При введении указанного средства крысам per os (в желудок) в максимально возможной дозе 6000 мг/кг в течение 14 суток не наблюдали гибели животных, лишь в первые сутки при введении доз 3500-6000 мг/кг отмечали у некоторых крыс отказ от корма, взъерошенность шерстяного покрова, учащенное мочеиспускание в первые 1-2 суток, которые исчезали к 3 суткам опыта.

Таким образом, полученные данные позволяют отнести новое средство к группе практически безвредных веществ по классификации К.К. Сидорова (1973).

Определение желчегонной активности средства на интактных крысах.

Исследования проводили на интактных белых крысах линии Wistar с массой 250,0-270,0 г наркотизированных внутрибрюшинным введение гексана (40 мг/кг). Желчь получали по общепринятой методике с помощью полиэтиленовой канюли, вставленной в общий желчный проток. Водный раствор нового средства в экспериментально-терапевтических дозах 100 мг/кг, 300 мг/кг и 500 мг/кг вводили крысам в 12-перстную кишку. Животные в контроле получали в эквиобъемной количестве дистиллированную воду. О степени желчегонного действия судили по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи за 4 часа опыта. Наряду с этим в желчи определяли содержание общего холестерина и билирубина (Мирошниченко и др, 1978). Результаты исследований показали, что новое средство в экспериментально-терапевтических дозах 100 и 300 мг/кг ускоряет холеретическую реакцию на 20-31% с увеличением хотатов на 12-21% (табл. 5), а в дозе 500 мг/кг значимых преимуществ не имеет.

Таким образом, средство, оказывающее гепатозащитное и желчегонное влияние, характеризуется желчегонным действием с ускорением скорости секреции желчи и увеличением холатов в желчи.

Исследование гепатозащитной эффективности средства.

Опыты проведены на 53 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 160-180 г. Животные были распределены на группы: интактные, контрольные с CCl₄ гепатитом; крысы с CCl₄ гепатитом, получающие средство, оказывающее гепатозащитное и желчегонное влияние, в дозе 200 мг/кг; крысы с CCl₄ гепатитом, получающие средство, оказывающее гепатозащитное и желчегонное влияние, в дозе 300 мг/кг; крысы с CCl₄ гепатитом, получающие средство, оказывающее гепатозащитное и желчегонное влияние, в дозе 500 мг/кг. Экспериментальный четыреххлористный (CCl₄) гепатит у животных вызывали введением 50% масляного раствора тетрахлорметана (CCl₄) подкожно в объеме 0,4 мл на 100 г массы животных 1 раз в сутки в течение 4 дней подряд. Средство, оказывающее гепатозащитное и желчегонное влияние, в указанных дозах вводили крысам per os 1 раз в сутки в течение 10 дней. Исследования функционального состояния печени по рекомендации "Руководство…" (2012 г) проводили через 7 и 14 суток с начала эксперимента. Контрольным животным вводили дистиллированную воду в эквиобъемном количестве и аналогичном режиме. В качестве референтного средства использовали карсил в изоэффективной дозе (200 мг/кг) в таком же режиме. Результаты исследований свидетельствовали, что введение крысам тетрахлорметана сопровождается повышением активности в сыворотке крови животных трансминаз (АЛТ и ACT), угнетением холеретической реакцией, ускорением свободнорадикального окисления биомакромолекул, подавлением дезинтоксикационной функции печени и другими проявлениями нарушений печени. Введение животным указанного средства характеризовалось нормализацией активности АЛТ и ACT, ускорением холереза, мобилизацией дезинтоксикационных функций печени на фоне ингибирования свободнорадикального окисления биомакромолекул (таблицы 6, 7, 8). Применение препарата карсила также способствовало восстановлению указанных функций и было сопоставимо с действием нового средства. Выраженный эффект наблюдали на 14 сутки эксперимента при введении карсила, а новое средство оказывало позитивное действие с ранних сроков его применения.

В целом, новое средство характеризуется выраженной желчегонной активностью и гепатозащитной эффективностью при повреждении печени тетрахлорметаном.

Таким образом, исследуемое средство характеризуется гепатозащитным влиянием при токсическом гепатите.

Литература

1. Белов Б.С., Абдурахманов Д.Т. Вирус гепатита В и ревматические болезни //Научно-практическая ревматология. - 2020. - Т. 58, №2. - С. 207-213.

2. Белякин С.А., Бобров А.Н., Плюснин С.В. и др. Вклад алкоголя в летальность при циррозе печени //Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2009. - №1. - С. 386.

3. Белякин С.А., Бобров А.Н., Плюснин С.В. и др. Доля умерших пациентов трудоспособного возраста при алкогольном циррозе печени. //Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2009. - №1. - С. 409.

4. Белякин С.А., Бобров А.Н., Плюснин С.В. и др. Цирроз печени: летальность и непосредственные причины смерти в конце XX и начале XXI века.//Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2009. - №1. - С. 691.

5. Белякин С.А., Бобров А.Н., Плюснин С.В. и др. //Алкоголь - ведущий этиологический фактор циррозов печени с неблагоприятным исходом //Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2009. - №2 (26). - С. 29-33.

6. Гриневич М.А. Информационный поиск перспективных лекарственных растений. -Л.: Наука, 1990.

7. Ганбаяр Я. Монгол элшйн жорын гарын авлалга. - Улаанбаатар, 2001. (на монг. яз.).

8. Ивашкин В.Т., Райхельсон К.Л., Пальгова Л.К. и др. Лекарственные поражения печени у онкологических пациентов // Онкогематология. - 2020. - Т. 15, №3. - С. 80-94.

9. Ивашкин В.Т., Ющук Н.Д., Богомолов П.О. и др. Хронический вирусный гепатит С //Клинические рекомендации. - Москва, 2021.

10. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна, 2012. - С. 457.

11. ОФС.1.5.3.0006.15 Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах

12. Плеханов А.Н., Товаршинов А.И. Регенерация печени: решенные и проблемные вопросы (Сообщение 2) //Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. - 2021. - №2. - С. 88-93.

13. Плеханов А.Н., Товаршинов А.И. Регенерация печени: решенные и проблемные вопросы (Сообщение 1) //Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. - 2020. - №11. - С. 101-106.

14. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

15. Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям. - М.: Медицина, 1988.

16. Тибетский чжор - новый сборник рецептов. - Лхаса: Тиб. народное изд-во, 1975.

17. ФС.2.5.0030.15 «Ноготков лекарственных цветки Calendulae officinalis flores».

18. Шишмарев В.М., Шишмарева Т.М., Асеева Т.А. Культивирование некоторых лекарственных растений в Республике Бурятия // В сб.: Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии. Материалы IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной году науки и технологий в Российской Федерации и 40-летию Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. - Улан-Удэ, 2021. - С. 568-570.

19. https://base.garant.ru/403592562/ Приказ Минфин РФ №196н от 29.11.2021.

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства, оказывающего гепатозащитное и желчегонное влияние. Предлагается способ получения средства, оказывающего гепатозащитное и желчегонное влияние, для этого растительный материал, состоящий из расторопши пятнистой плодов, ноготков лекарственных цветков, ромашки аптечной цветков при соотношении компонентов в мас.ч. 4:4:2, измельченный до размера частиц диаметром 1,0-3,0 мм, экстрагируют трехкратно при температуре 75°С при отношении 1 мас.ч. растительного материала:10 об.ч. экстрагента водой горячей 75°С при постоянном перемешивании, первый и второй контакт фаз в течение 25 мин, третий контакт фаз в течение 15 мин, далее объединенные извлечения фильтруют, упаривают, очищают сепарированием, доупаривают, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате. Средство, полученное вышеописанным способом, обладает выраженным гепатозащитным, желчегонным действием. 8 табл.

Способ получения средства, оказывающего гепатозащитное и желчегонное влияние, для этого растительный материал, состоящий из расторопши пятнистой плодов, ноготков лекарственных цветков, ромашки аптечной цветков при соотношении компонентов в мас.ч. 4:4:2, измельченный до размера частиц диаметром 1,0-3,0 мм, экстрагируют трехкратно при температуре 75°С при отношении 1 мас.ч. растительного материала:10 об.ч. экстрагента водой горячей 75°С при постоянном перемешивании, первый и второй контакт фаз в течение 25 мин, третий контакт фаз в течение 15 мин, далее объединенные извлечения фильтруют, упаривают, очищают сепарированием, доупаривают, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате.