ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К КОНФОРМАЦИОННО-ЗАВИСИМЫМ ДЕТЕРМИНАНТАМ ОПУХОЛЬ-АССОЦИИРОВАННОГО АНТИГЕНА MUC I ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2008 года по МПК C12N5/20 

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus - продуцент моноклональных антител к конформационно-зависимым детерминантам опухоль-ассоциированного антигена Muc I человека.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и касается получения моноклональных антител к опухоль-ассоциированному Muc I антигену человека (онкомаркеру Muc I) с помощью гибридных культивируемых клеток (гибридом) животных. Наличие панели моноклональных антител к онкомаркеру Muc I перспективно для создания различных диагностикумов в клинической онкологии, в частности для применения в диагностическом двухсайтовом иммунометрическом способе определения концентрации Muc I в сыворотке крови человека (Br. Cancer Res. And Treat. 81: 195-207, 2003).

Известны некоторые штаммы-продуценты моноклональных антител, которые обладают специфичностью к различным эпитопам молекулы онкомаркера человека Muc I (Cancer Res.47:5476-5482, 1986). В связи с расширением представлений о строении иммунодоминантной области молекулы Muc I, а также конформационных различиях в организации опухоль-ассоциированного и нормального Muc I антигенов особенно актуальным становится поиск антител, высокоспецифичных к конформационно-зависимым областям Muc I молекулы (J. Biomol. Struct. Dyn. 13:245-260, 1995). Критерием отбора антител с такими свойствами может служить зависимость эффективности взаимодействия антител с Muc I антигеном: а) от степени полимерности VNTR области молекулы Muc I и б) степени ее гликозилирования. Ближайшим аналогом заявляемого изобретения по специфичности моноклональных антител является штамм гибридом С595 ISOBM TD-4 N172. Штамм продуцирует моноклональные антитела, специфичные как к нативной молекуле онкомаркера, так и к пептидному каркасу молекулы Muc I (VNTR) (Br. Cancer Res. And Treat. 61:681-686, 1990). Известно, что моноклональные антитела С595 распознают линейный пептидный участок молекулы антигена как в виде мономера (TR), так и в виде полимеров VNTR с разной степенью полимеризации (TR₅-TR₁₀₀), в то же время зависимость специфической активности С595 от степени полимерности каркасного пептида Muc I антигена не установлена.

Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал штаммов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к опухоль-ассоциированному антигену Muc I человека.

Задача решена путем получения штамма M3F1 гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела, обладающие высоким сродством к конформационно-зависимым детерминантам онкомаркера человека Muc I.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет номер ВКПМ Н-97.

Штамм получен путем гибридизации лимфоцитов иммунизированной мыши (Balb/c) с клетками миеломы (Sp2/0/Agl4) и применения подкожной схемы иммунизации с последующим выделением лимфоузельных В-лимфоцитов мыши. В качестве иммуногена применен Sav- VNTR₂₂ - рекомбинантный конъюгат стрептавидина (Sav) и VNTR - области тандемных повторов онкомаркера человека (Биоорганическая химия: 26, 6, 381-389, 2000).

Для оценки продуктивности полученных гибридом и специфичности вырабатываемых ими антител использован тест иммуноферментного анализа (ИФА) (ELISA) (В кн. «Антитела», т.2 // изд. «Мир», под ред. Д.Кэтти, 223-230, 1991) с использованием нескольких маркеров специфичности, а именно:

- природного очищенного антигена Muc I, выделенного из молока человека (J.Immunol.: 135, 3610-3616, 1985);

- VNTR₂₂-полипептида (J.Biochem.: 263, 12820-12823, 1988);

- синтетического мономерного полипептида (TR₁) (Encyclopedia of Polimer Science and Technology // by J.Wihey and S.Iuc, 3-49, 2004);

- дегликозилированного антигена Muc I (de-Muc), полученного в результате химического окисления природного Muc I (Anal. Biochem.: 82, 289-309, 1977);

- гипогликозилированного Muc I (о-Muc I), полученного в результате периодатного окисления природного антигена (J.Immunol. Methods: 78, 143-153, 1985).

Для установления взаимосвязи между степенью полимеризации полипептида и специфической активностью полученных антител использовали мономерный пептид (TR₁) и полипептид - VNTR₂₂, состоящий из 22 пептидных остатков. Природный очищенный антиген Muc I, VNTR₂₂-полипептид, гипогликозилированный и дегликозилированный антигены (о-Muc и de-Muc) представляют собой изоформы онкомаркера Muc I с различной степенью гликозилирования. Выделенный из молока антиген Muc I содержит комплекс гликопротеинов, состоящих из полипептидного скелета с вариабельным числом тандемных повторов из 20 аминокислот (VNTR) и олигосахаридных цепей. Этот антиген использован как контроль при оценке взаимодействия моноклональных антител с менее гликозилированными антигенами. Дегликозилированный антиген (de-Muc) содержит не более 1% углеводных цепей, а о-Muc I, полученный в результате более мягкого периодатного окисления, характеризуется абберантным гликозилированием (гипогликозилированный антиген). Таким образом, указанные выше маркеры специфичности позволяют установить специфичность моноклональных антител в отношении изоформ Muc I онкомаркера человека с различной протяженностью пептидного участка и различной степенью гликозилирования.

Конечный продукт.

Моноклональные антитела класса IgG 1 (тест-система для изотипирования - ISO 2-1КТ, Sigma), обладающие высокой специфичностью к конформационно-зависимым детерминантам антигена Muc I.

Культивирование штамма в питательной среде.

Для культивирования используют среду ДМЭМ (фирма Sigma), содержащую 10% фетальной сыворотки, 1% глутамина и пирувата, 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5-7% CO₂. Для культивирования используют пластиковые или стеклянные планшеты или флаконы объемом 50 мл (фирма Lux). Характер роста - стационарная суспензия. Частота пассирования 2-3 суток. Кратность рассева 1:3-1:4. Титр антител в культуральной жидкости 1:128.

Культивирование штамма в организме животного.

Для получения асцитов мышам вводят внутриперитонеально 0,5 мл пристана (В кн. «Моноклональные антитела» // изд. Медицина, под. ред. Р.Кеннета, 396-397, 1983). Подготовленные животные отдыхают 3 недели. Гибридомные клетки отмывают от содержащейся в среде сыворотки и вводят 4·10⁶ клеток в растворе Хенкса (производитель - Московский завод бактериальных препаратов). Рост асцитной опухоли отмечают на 7-10 день. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:128, а в асцитической - 1:10000.

Продуктивность.

Концентрация антител, продуцируемых штаммом, составляет в культуральной жидкости 12 мкг/мл, в асцитной жидкости - 6 мг/мл. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре и 7 пассажей на животных, если гибридома перевивается.

Контаминация.

Бактерии и грибы в культурах не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на стандартные питательные среды (МПА-для выявления бактерий и агар Сабуро - для грибов). Заражение микоплазмой не выявлено (тест-система Mycoplasma Stain Kit, фирмы Flow Lab.).

Консервация клеток.

Клетки замораживают после 2 и 3-го клонирования на 10 и 15 пассажах в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах. Клетки в криозащитной среде следующего состава (мас.%): ДМЭМ - 50, фетальной сыворотки - 40 и диметилсульфоксида - 10, помещают в холодильник при - 70°С, после чего переносят в жидкий азот. Выживаемость после размораживания составляет 70%.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графического изображения.

Фиг.1. Иммуноспецифичность моноклональных антител заявляемого штамма к гипогликозилированным и дегликозилированным изоформам опухоль-ассоциированного антигена Muc I человека.

Фиг.2. Иммуноспецифичность моноклональных антител заявляемого штамма к мономерному пептиду - TR₁ и полипептиду - VNTR₂₂ опухоль-ассоциированного антигена Muc I человека.

Пример 1. Получение штамма ВКПМ Н-97.

Мышей линии Balb/c иммунизируют Sav- VNTR₂₂ в полном адъюванте Фрейнда в подушечки задних лапок (по 50 мкг на мышь). На 13-й день мышей иммунизируют в подушечки задних лапок тем же количеством Sav- VNTR22 в неполном адъюванте Фрейнда (В кн. «Моноклональные антитела» // изд. Медицина, под. ред. Р.Кеннета, 371-382, 1983). На 16-й день мышей забивают, выделяют подколенные лимфоузлы и клетки лимфоузлов сливают с клетками миеломы Sp2/0/Agl4 с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). Соотношение клеток лимфоузлов и клеток миеломы составляет 5:1. После слияния клетки рассевают в лунки 96-луночного планшета (фирма Nunc) в количестве 200 тыс. клеток на лунку, в которые предварительно высевают перитонеальные макрофаги мыши по 10 тыс. клеток на лунку. Селекцию гибридом ведут в среде ДМЭМ, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ) (В кн. «Моноклональные антитела» // изд. Медицина, под. ред. Р.Кеннета, 371-382, 1983). Рост гибридов в среде культивирования, содержащей 15% фетальной сыворотки, наблюдают на 3-7 день.

Отбор растущих клонов клеток, секретирующих антитела заданной специфичности, проводят на 10-12 день на основе ИФА с использованием указанных ранее маркеров специфичности.

В результате получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-97 - продуцент моноклональных антител к конформационно-зависимым детерминантам опухоль-ассоциированного антигена Muc I человека.

Дважды проведенное клонирование полученных гибридом методом лимитирующих разведений путем рассева в лунки 96-луночного планшета из расчета 1 клетка на лунку в среде ДМЭМ и последующее тестирование на секрецию антител показало, что доля клонов, сохраняющих продукцию антител заданной специфичности, составляет 100%.

Пример 2. Получение, выделение и очистка моноклональных антител, продуцируемых штаммом ВКПМ Н-97.

Для получения моноклональных антител клетки штамма гибридомы выращивают в 24-луночных планшетах (фирма Nunc) на среде культивирования. При достижении концентрации клеток в лунке 10⁶ собирают культуральную жидкость, содержащую клетки, центрифугируют 10 мин при 2000 g и удаляют надосадочную жидкость. Собранные клетки переводят в бессывороточную среду (ДМЭМ) и вводят мышам внутрибрюшинно из расчета 4·10⁶ клеток/мышь. Через 7-10 дней наблюдают визуальный рост асцитной опухоли, мышей забивают и шприцем собирают асциты из брюшной полости. Асцитную жидкость центрифугируют 10 мин при 2000g, чтобы освободится от клеток, и надосадочную жидкость используют для выделения моноклональных антител.

С этой целью к асцитной жидкости мыши, содержащей моноклональные антитела, добавляют равный объем насыщенного (4 М) раствора сульфата аммония и центрифугируют при 5000 g 20 мин. Осадок растворяют, тщательно диализуют против 0,5 М фосфатного буфера рН 7,2 и очищают на колонке с DEAE целлюлозой (DE-5) (Иммунология: 4, 40-44, 1980). Из 1 мл асцитной жидкости получают 6 мг моноклональных антител. Чистота выделенных таким образом моноклональных антител подтверждена электрофоретически и составляет 90-95%.

Пример 3. Определение специфичности и концентрации моноклональных антител в культуральной и асцитной жидкостях методом ИФА.

В лунки 96-луночного планшета вносят по 100 мкл раствора антигена (Muc I, VNTR₂₂-полипептид, мономерный полипептид TR₁, de-Muc I, о-Muc I) с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют 2 ч при 37°С. После 4-кратной отмывки планшета от избытка антигена в лунки вносят рабочий буфер, фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20 (В кн. "Антитела", т.2 // под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991). Инкубируют 30 мин. Готовят серию 10-кратных разведений культуральной или асцитной жидкостей в рабочем буфере. Анализируемые пробы в объеме 50 мкл с 2-кратным повтором вносят в лунки планшета с антигеном и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После инкубации удаляют содержимое лунок, промывают планшет и вносят по 50 мкл на лунку раствора конъюгата кроличьих антител к иммуноглобулину мыши с пероксидазой в разведении 1:3000. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буфера (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5)(В кн. "Антитела", т.2 // под ред. Д.Кэтти, 153-183, 1991), содержащего 4 мг/10 мл 0-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода. Планшеты инкубируют 10-15 мин и останавливают реакцию добавлением 10% серной кислоты по 100 мкл на лунку. Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов (фирма Labsystems) при длине волны 492 нм. Концентрацию антител определяют по калибровочной кривой, которую получают одновременно с проведением теста. Для построения калибровочной кривой вместо образцов в лунки планшета вносят разведения стандартных препаратов очищенных антител заявляемого штамма в известной концентрации.

Концентрация антител в культуральной жидкости составляет 12 мкг/мл, а в асцитной - 6 мг/мл.

На Фиг.1 и 2 представлены данные о гликопептидной специфичности полученных моноклональных антител. По оси Х отложены концентрации моноклональных антител, по оси Y - оптическая плотность при длине волны 492 нм. Активность взаимодействия моноклональных антител с антигеном увеличивается по мере возрастания концентрации антител от 1 нг до 1 мкг.

Как следует из представленных на Фиг.1 данных моноклональные антитела заявляемого штамма взаимодействуют с дегликозилированным (de-Muc 1) и гипогликозилированным (о-Muc I) антигенами на том же уровне, что и с природным антигеном. Эти данные свидетельствуют о высоком сродстве полученных антител к молекуле Muc I антигена независимо от степени гликозилирования.

Данные, представленные на Фиг.2, демонстрируют практически полную зависимость эффективности взаимодействия полученных антител с антигеном от протяженности полипептидного участка.

Таким образом, получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-97 - продуцент моноклональных антител, обладающих специфичностью к конформационно-зависимым детерминантам Muc I онкомаркера человека.

Моноклональные антитела, продуцируемые заявляемым штаммом, распознают клинически значимые изоформы антигена Muc I и пригодны для определения его концентрации в сыворотке крови человека при ранней диагностике опухолей.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител к опухоль-ассоциированному антигену Muc I человека. С помощью гибридомных технологий получают штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-97 - продуцент моноклональных антител, обладающих специфичностью к конформационно-зависимым детерминантам опухоль-ассоциированного антигена Muc I человека. Оценку продуктивности штамма и специфичности продуцируемых антител проводят на основе иммуноферментного анализа с использованием нескольких маркеров специфичности: природного очищенного антигена Muc I, выделенного из молока человека; VNTR₂₂-полипептида; синтетического мономерного полипептида (TR₁); дегликозилированного антигена Muc I (de-Muc I), полученного в результате химического окисления природного Мис I; гипогликозилированного антигена Muc I (о-Muc I), полученного в результате периодатного окисления природного Muc I. Моноклональные антитела, продуцируемые заявляемым штаммом, распознают клинически значимые изоформы антигена Muc I и позволяют определить его концентрации в сыворотке крови человека при ранней диагностике опухолей. 2 ил.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВКПМ Н-97 - продуцент моноклональных антител к конформационно-зависимым детерминантам опухоль-ассоциированного антигена Muc I человека.