Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к инсулину человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши MUS musculus, используемого для получения моноклональныхантител к новой детерминанте на молекул инсулина человека, 4jo дает возможность разработать двусайтовый иммунометрический способ определения концентрации инсулина.

Отличие моноклонального антитела, получаемого с помощью предлагаемого штамма, от известных состоит в том, что антигенная детерминанта, против которой он получен, включает остаток А4 на А-цепи

молекулы инсулина и является-конформационной. т.е. антитело не связывается с отдельными цепями. В литературе не найдено данных о получении антител к антигенной детерминанте, включающей остаток А4 на А-цепи и являющейся конформациониой.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ВALB/с иммунизируют инсулином человека (получен от НПО Фермент) в полном адьюванте Фройнда в подушечки заданных лапок (по 50 мкг на мышь). Чистота инсулина проверялась электрофоретически и составляет 98%. На 13-й день мышей иммунизируют в подушечки задних лапок тем же количеством инсулина в неполном адъюванте Фройнда. На 16-й день мышей забивают, достают подколенные

лимфоузлы и клетки лимфоузлов сливают с клетками миеломы Р 3. Х63, Ад8.653 с помощью полиэтиленгликоля ПЭГ 2000 (Merck). Соотношение клеток лимфрузлов и клеток миеломы составляет 5:1. После слияния клетки рассеивают в лунки 96-ячеечного планшета (Nunc) в количестве 100 тыс. клеток на лунку, в которые предварительно высева1рт перитонеальные макрофаги мыши по 500 клеток на лунку. Селекцию гибридом ведут в среде rAT{RPMJ 1640, содержащий гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Отбор растущих культур клеток, секретирующих антитела нужной специфичности, проводят с помощью радиоиммунологического анализа: в лунки полихлорвинилового планшета, покрытые антителами против иммуноглобулинов мыши, вносят культуральные жидкости растущих культур клеток, инкубируют 2 ч при комнатной темпеоатуре, лунки промывают и инкубируют с 1 меченым инсулином. Лунки нарезают и просчитывают в гамма-счетчике. Гибридому, секретирующую антитела к инсулину, дважды клонировали методом лимитирующих разведений. То есть клетки рассеивают в лунках 96-ячеечных планшеток из расчета 1 клетка на лунку в ростовой среде (RP.MJ 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мм L-глютамина, 1% пирувата натрия, 50 ЕД/мл пенициллина и 2 мкг/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина). Выросшие клоны тестируют на секрецию антител. Доля клонов, сохраняющих продукцию антител заданной специфичности, составляет 100%. Штамм обозначает D4B8. Штамм D4B8 хранится в специализирован ной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 440 Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Среда для культивирования - RPMJ 1640 или DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мм L-глютамина, 1% пирувата натрия,ВО ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОа. Для выращивания штаммов можно использовать стеклянную и пластиковую культуральную посуду. Характер роста стационарная суспензия.

Частота пассирования 2-3 сут. Кратность рассева 1:3-1:4. При введении мышам BALB/C, предварительно обработанным пристаном, по 1 млн. клеток, асцит образуется через 10-15 дней. Стабильная продукция наблюдается в течение 7 пассажей на мышах, Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:128 а в асцитической 1:100000. Продуктивность.

Концентрация антител, продуцируемых

штаммом D4B8, составляет в культуральной жидкости 50 мкг/мл, в асцитной жидкости 20 мг/мл. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре и 7 мпассажей на живо0 тных, если гибридома перевивается. Контаминация.

Бактерии и грибы в культурах не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение

5 микроплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновом промечивании культуральной среды. Консервация клеток. Клетки штаммов замораживают после 2

0 и 3-го клонирования на 10 и 15 пассгажах в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах. Криозащитна среда 50% ростовой среды, 40% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфокси5 да.

Режим замораживания: клетки в криозащитной среде помещают на сутки в холодильник при -70° С, после чего переносят в жидкий азот. Выживаемость клеток после

0 размораживания составляет 50%. Полезный продукт.

Моноклональные антитела IgG 1 класса. Специфичность - инсулин человека, проинсулин человека. Метод оценки сохранения

5 специфичности: кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши сорбируют на поверхности лунок гибкого планшета, в лунки вносят супернатанты клеток D4B8, затем планшет отмывают и в лунки вносят 125

0 1-инсулин, планшет вновь отмывают, лунки вырезают и просчитывают в гамма-счетчике.

П р и м е р 1. Получение антител D4B8 с помощью штамма гибридом D4B8.

5 Для получения моноклональных антител D4B8 клетки штамма гибридом D4B8 выращивают в пластиковых флаконах на среде для культивирования: RPMJ 1640 (или DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 1% пирувата натрия, 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Концентрация клеток в среде не должна превышать 0,5 мпн./мл. Когда число клеток достигнет 20 млн, клетки вводят внутрибрюшинно в мышей, которым за 10-14 дней ввели по 0.5 мл пристана. Для этого перед введением клеток в мышей культуральную жидкость, содержащую клетки шта1«/ма, центрифугируют 10 мин при 2000д, надосадочную культуральную жидкость удаляют, клетки штамма переводят в среду без 10% эмбриональной телячьей сыворотки и вкалывают внутрибрюшиино по 1 млн. клеток на мышь. Через 10-14 дней, когда у мышей вырастет асцит, мышей забивают и с помощью шприца забирают асцитную жидкость. Асцитную жидкость центрифугируют при 20QOg в течение 10 мин, чтобы освободиться от клеток, и надосадочную жидкость используют для выделения моноклональных антител.

К асцитно.й жидкости мыши, содержащей моноклональные антитела D4B8, добавляют равный объем насыщенного сульфата аммония и центрифугируют при 5000д 10 мин. Осадок растворяют, тщательно диализуют против 0,5 М фосфатногобуфера рН 7,2 и наносят на колонку с DEAE-52, целлюлозой, уравновешенную этим же бУ фером. Моноклональные антитела выходят не задерживаясь на колонке. Из 1 мл асцитной жидкости получается 18,5 мг моноклональных антител D4B8.:

Концентрацию антител в асцитной и культуральной жидкостях штамма D4B8 опг ределяют с помощью иммуноферментного анализа. 100 мкл раствора инсулина в концентрации 10 мкг/мл в 0,2 М боратном буфере вносят в лунки 9б-луночного планшета для иммуноферментного анализа и инкyбИjруют 2 ч при комнатной температуре. По окончании инкубации лунки пррмы.вают 3 раза, водопроводной водой. Готовят серию пятикратных разведений исследуемых проб в 0,2 М буферном растворе рН 8,0, содержащем исследуемых проб в 0,2 М буферном растворе рН 8,0, содержащем 0,1% желатины. Анализируемые пробы в объеме 50 мкл вносят с 2-кратным повтором в лунки планшета, покрытого инсулином и контрольным

белком (БСА) и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После инкубации содержимое лунок удаляют, лунки промывают и в каждую вносят по 50 мкл раствора конъюгата кроличьих антител с пероксидазой хрена к иммуноглобулинам мыши, предварительно разведенного буферным раствором в 1000 раз. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буферного раствора, содержащего о-фенилендиамин (4 мг/мл) и 0,0003% перекись водорода. Планшеты инкубируют 15-20 мин и в лунки вносят по 50 мкл 2.5 М с ерной кислоты для остановки реакции. Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов при длинб волны 492 нм. Концентрацию антител в анализируемых образцах определяют по калибровочной кривой, которую получают одновременно с проведением теста. Для построения калибровочной кривой процедуру проводят так же, но вместо анализируемых образцов в лунки вносят разведения стандартных препаратов очищенных антител D4B8 в известной концентрации. Концентрация антител D4B8 в культуральной жидкости штамма Р4В8 равна 50 мкг/мл, в асцитной жидкости 20 мг/мл.

Таким образом, предлагаемый штамм позволяет получить моноклональные антитела к инсулину человека, распознающие новую детермийанту на молекуле инсулина, что расширяет возможности разработки двусайтового способа определения концентрации инсулина.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L ВСКК (П) 440 D-продуцент моноклональных антител к инсулину человека.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом. Цель изобретения -получение штамма гибридомы - продуцента моноклональных антител к новой детерминанте на молекуле инсулина человека. Штамм D4B3 получают гибридизацией иммунных клеток лимфоузлов мыши BALB/c с клетками миеломы Р3-Х63-Ад8.653. Штамм D4B8 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 440 Д. Клетки штамма D4B8 растут на среде RPMJ 1640 или DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Концентрация антител, продуцируемых штаммом D4B8, составляет в культуральной жидкости 50 мкг/мл, в асцит- ной жидкости 20 мг/мл. Антигенная детерминанта для антител D4B8 включает остаток А4 А-цепи и является конформаци- онной.^fcrf^