Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения монокло- нальных антител (МкАт) против антигена мелиоидоза, применяемых для определения Ps-pseudomaHel в реакциях иммунофлюо- ресценции и преципитации в геле.
Для дифференцирования возбудителей, относящихся к роду Pseudomonas, используют набор тестов, осйованный на сравнении биотехнических и культуральных свойств микроорганизмов. Наряду с этим длительным и трудоемким методом применяют также более быстрые серологические методы дифференциации псевдомонад при помощи прликлональных антисыворрток. Однако,, при применении таких сывороток
практически не удается дифференцировать между собой возбудителей сапа и мелиоидоза, что свидетельствует об их чрезвычай- но высоком антигенном сходстве. Актуальным представляется использование возможностей гибридомной технологии для получения МкАт, обладающих видовой специфичностью к данным возбудителям, или специфичных к маркерам определенных биологических свойств.
Цель изобретения - штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., продуцирующий моноклональные антитела к антигену возбудителя мелиоидоза - маркеру вирулентности.
VI
ч
Ј ел о
Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L,.- продуцент монокло- нальных антител к поверхностному антигену 8 возбудителя мелиоидоза получен путем слияния клеток селезенки мышей BALB/с, предварительно иммунизированных суспензией убитых бактериальных клеток возбудителя мелиоидоза, с клетками мышиной миеломы РЗ-ХбЗ-Ад 8.653 с помощью полиэтиленгликоля (ЛЭГа), селекции на гипоксантин-аминоптерин-тимиди- новой среде (ГАТ) и последующего клонирования полученных гибридом методом предельных разведении.
Штамм депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматиче- ских клеток позвоночных Института цитологии АН СССР 05.07.88 под номером ВСКК(П)276Д и имеет авторское наименование ММ - Ppmi.
Полученный штамм Mus musculus L. ВСКК(П)276Д имеет следующие характеристики.
Условия культивирования штамма: температура 37°С, атмосфера с 5% С02 и 98% влажностью, среда RPM1-1640, содержащая 10% сыворотки плода коров, 10 мМ ГЭ.ПЭС (1М-2-гидроксмэтилпиперэзин-2-этансульфо новая кислота), 2мМ 1-глутамина, без антибиотиков или с добавлением пенициллина и стрептомицина 100 ЕД/мл.
Характер роста - стационарная суспензия. Культура представляет собой взвесь одиночных клеток или легко разъединяю щихся при встряхивании рыхлых агрегатов по 6-14 и более клеток. Оптимальная посевная доза- 1,5-2 х 10s клеток в 1 мл среды. Для поддержания культуры в профилирующем состоянии клетки рассеиеают два раза в неделю через 2-4 дня с кратностью рассева 1:4 - 1:10. Максимальная плотность насыщения с сохранением жизнеспособности - 8хЮ5-106 клеток в 1 мл, Клетки в культуре выглядят округлыми, прозрачными.
Для получения асцитной жидкости мышей линии BALB/c сенсибилизируют путем внутрибрюшинного введения 0,5 мл приста- на или вазелинового масла и через 7-14 дней после этого им вводят гибридные клетки в. дозе 3-5x106 клеток на мышь.
В реакциях иммунофлюоресценции, преципитации в геле и иммуноферментном анализе {ИФА) продуцируемые гибридома- ми антитела взаимодействуют с антигеном 8 возбудителя мелиоидоза с абсолютной специфичностью.
Моноклинальные антитела относятся к классу иммуноглобулинов (Ig) M. Титр имму- ноглобулинов в ИФА в культуральной жидкости-до 40. в асцитной жидкости -до 10 ;
титр МкАт в асцитной жидкости в непрямом иммунофлюоресцентном анализе (НИФлА) - до 103. Стабильность антителоп- родукции сохраняется на протяжении 50-52
пассажей в культуре и 5 пассажей на животных (срок наблюдения)
Проверка штамма на присутствие контактирующих микроорганизмов, проведенная на культурах постоянно выращиваемых
0 на среде без антибиотиков, показала отсутствие бактерий и грибов.
Штам хранят в замороженном состоянии при температуре -196°С. Среда крио- консераирования содержит: среды
5 RPMI-1640-73%, сыворотки плода коровы - 20%, диметилсульфоксида (ДМСО) - 7%. Ампулы, содержащие 0,5 мл суспензии клеток (6x10 /мл) после выдерживания в течение 30 минут при температуре 4°С и двух
0 часов при температуре -40°С погружают и хранят в жидком азоте. Жизнеспособность клеток проверяют после размораживания с помощью суправитального красителя - 0,2% раств.ора трипанового синего. Она со5 стэвляет 80-95%.
Пример 1. Использование штамма Mus musculus L. ВСКК(П)276Д для получения моноклональных анотител.
Моноклональные антитела к антигену 8 возбудителя мелиоидоза получают из куль0 туральной жидкости (среды), в которой клетки штамма выращивают вне организма и из. асцитной жидкости мышей, которым клетки штамма вводят внутрибрюшинно.
Для получения антител из культураль5 ной жидкости клетки штамма выращивают в стандартных условиях: при температуре 37°С, влажности 98%, в среде культивирования. Затем производят постепенный рассев культуры. Клетки выдерживают
0 для пролиферации без смены среды до достижения максимальной плотности, при которой клетки погибают. Культуральную жидкость осветляют центрифугированием и используют как источник антител.
5
Для определения титра моноклональных антител в ИФА титрование проб культуральной жидкости проводят путем 8 последовательных разведении образцов с
0 двукратным шагом (1:2 .- 1:128) в лунках планшетов, сенсибилизированных водно- солевым экстрактом возбудителя мелиоидоза. В качестве отрицательного контроля используют насадочную жидкость несекре5 тирующей антитела миеломной клеточной линии РЗ-ХбЗ-Ад 8.653, в качестве положительного - сыворотку мышей, иммунизированных убитыми бактериальными клетками возбудителя. Результаты реакции учитывают визуально или с помощью вертикального спектрофотометра.
За титр антител принимают величину обратную наибольшему разведению исследуемого образца антител, давшему положительную реакцию. Титр моноклональных антител кантигену возбудителя мелиоидоза в культуральной жидкости равен в ИФА 40.
Для получения асцитной жидкости, содержащей МкАт, мышам линии В ALB /с вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана или вазелинового масла, а спустя 7-14 дней также внутрибрюшинно вводят 3-5 мл. гибридных клеток штамма, выращенных ин витро. Асцмт развивается в течение 7-28 дней. Клетки опухоли отделяют путем центрифугирования асцита и перевивают новой группе мышей, а жидкость используют как источник антител. Объем асцитной жидкости, полученный от одной мыши, составляет 0,5-3 мл.
Определение титра антител с асцитной жидкости проводят также, как и в культуральной. Асцитную жидкость разводят с 10- кратным шагом начиная с 1:10, делая 8 последовательных разведении образцов в лунках планшетов. В качестве отрицательного контроля используют нормальную мышиную сыворотку мышей линии BALB/c. Титр антител в асцитной жидкости составляет 104-106,
Для определения титра антител в имму- нофлюоресцентном анализе делают б последовательных разведении асцитной жидкости с 10-кратным шэгом.{1:10- IHO6). Для разведения используют физиологический раствор NaCl, содержащий 0,05% тви- на-20. Пробы антител в разведениях в объеме 10 микролитров наносят на предметное стекло с предварительно фиксированными на нем микробными клетками. Стекла выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут, ополаскивают физиологическим раствором. Реакцию проявляют препаратом кроличьего антимышиного глобулина меченого ФИТЦ в рабочем разведении (производство ЙЭМ АМН СССР). Через 20-30 минут инкубации стекло отмывают физиологическим раствором, затем дистиллированной водой, высушивают и просматривают под масляной иммерсией в люминисцентном микроскопе. Положительной считается реакция имму- нофлюоресцении, оцениваемая на 3+ и выше при 4х -бальной системе оценки. Титр антител в асцитной жидкости гибридного штамма составляет в ИФлА 1:102 - 1:103.
Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток мышей ВСКК(П)276Д, полученные из культуральных и асцитной жидкостей, высаливают раствором сульфата аммония при
5 50%-ном насыщении, подвергают диализу против фосфатно-солевого буфера с последующей лирфилизацией и хранят при температуре 4°С в течение года без потери активности.
0
П р и м е р 2. Использование монокло- нэльных антител, полученных на основе предложенного штамма, для определения возбудителя мелиоидоза и его антигена в
5 ИФлА и реакции преципитации в геле.
Для выявления возбудителя мелиоидоза на стекле с предварительно фиксированными клетками исследуемых штаммов или
0 мазками-отпечатками органов наносят 5-10 микролитров антител в разведении, в 2-5 раз меньшем титра, установленного при оценке их активности. Стекла выдерживают в течение 30 минут при комнатной темпера5 туре и несколько раз отмывают физиологическим раствором. После этого на стекла наносят препарат кроличьего антимышиного глобулина меченого ФИТЦ в рабочем разведении. Через 20-30 минут стекла
0 отмывают физиологическим раствором, споласкивают дистиллированной водой и высушивают. Препараты просматривают в люминисцентном микроскопе при малом увеличении под масляной иммерсией, при
5 этом микробные клетки возбудителя мелиоидоза показывают специфическое свечение.
Выявление антигена 8 возбудителя мелиоидоза возможно при помощи реакции
0 преципитации по Ухтерлони, что обусловлено принадлежностью данных МаАт к IgM. - Появление зоны преципитации свидетельствуют о наличии данного антигена в исследуемом материале и позволяет
5 идентифицировать .вирулентные штаммы возбудителя мелиоидоза (Петере М. К., Пи- вень Н.Н., Илюхин В.И., Барков A.M. Характер изменений антигенного спектра возбудителя мелиоидоза при пассиро0 вании на животных. ЖМЭИ, 1983, № 8, с.47-49).
Штамм гибридных культивируемых клеток мыши продуцирует МкАт, позволяющие дифференцировать патогенные псевдомо5 нады (Pseudomonas pseudomalle и др.) по наличию у них маркера вирулентности - антигена 8-в иммунофлюоресценции, ИФА, в реакциях иммунодиффузии в геле, оценивают наличие антигена 8 в микробной клет71791450 8
ке на различных этапах ее развития. ДанныеФормула изобретения
методы быстры и экономичны, поскольку ис-Штамм гибридных культивируемых клеключают необходимость применения ис-ток Mus musculus L BCKK (II) № 276Д
пользуемых в настоящее время тестов,продуцент моноклональных антител к антиоснованных на сравнении биохимических и5 гену 8 возбудителя мелиоидоза Pseudoкультуральных свойств микроорганизмовmonas pseudomallel. рода Pseudomonas.
Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: штамм получают путем слияния клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных суспензией убитых бактериальных клеток возбудителя мелиоидоза, с клетками мышиной миеломы РЗ-ХбЗ-Ад 8.653. Штамм ВСКК(Н) 276 Д депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночника Института цитологии АН СССР. Продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к иммуноглрбулинам класса М (IgM), специфически направленные к антигену 8. Титр иммуноглобулинов в ИФА в культуральной жидкости до 40, а ас- цитной жидкости до 106, титр антител в ас- цитной жидкости в непрямом иммуноофлюоресцентном анализе до 103. Стабильность антителопродукции штамма сохраняется на протяжении 50-52 пассажей в культуре и 5 пассажей на животных (срок наблюдения).
| Пивень Н.Н., Илюхин В.И | |||
| Антигенная структура Pseudomonas pseudomallei | |||
| Ж МЭИ, 1981, №4, с.78 |
