СПОСОБ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОПРЕПАРАТАМ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается ускоренного способа определения чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам.

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам подразделяют на методы серийных разведении и диффузионные. Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность антибактериальных препаратов, величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК), которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной питательной среде. Для определения МПК заданные концентрации антибактериальных препаратов вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма, и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста. В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии антибактериальных препаратов из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация антибактериальных препаратов превосходит МПК. В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный (метод дисков, насыщенных антибактериальными препаратами) и Е-тест.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя антибактериальных препаратов используют бумажный диск. Образование видимой зоны подавления роста происходит в результате диффузии антибактериальных препаратов из носителя в питательную среду.

Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5×6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций антибактериальных препаратов (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация препарата, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации препарата в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю.

Существующие методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.2.1890-04, Москва, 2004, утвержденные Г.Г.Онищенко 4.03.2004), позволяют определять чувствительность к антибактериальным препаратам только через 24-48 часов.

Среди описанных ныне 27 видов буркхольдерий большинство являются сапрофитами, но два вида относятся к возбудителям 2 группы патогенности, это опасные инфекционные заболевания сап и мелиоидоз, включенные в список вероятных агентов биотерроризма (Rotz L.D. et al. Public healh assessment of potential biological terrorism agents // Emerging Infect. Dis. - 2002. - Vol.31. - 225-230). Отмечаемое в последние 20 лет резкое увеличение количества публикаций по выделению культур B.pseudomallei и регистрация клинических случаев мелиоидоза во всех частях света обязывает внедрению в практику работы бактериологов способа ускоренного определения чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам. При подозрении на заболевание человека острыми формами сапа и мелиоидоза принципиальное значение имеет раннее адекватное введение антибактериальных препаратов в фазе интенсивного лечения этих заболеваний (Srinivasan A, Kraus C.N. Deshazer D. et al. Glanders in a military research microbiologist // The New Engl. J. Med. - 2001. - Vol.345, N 4. - Р.256-258).

Наиболее близким аналогом ускоренного способа определения чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам является ускоренный колориметрический метод (Tunney М.М, Ramage G, Field TR et al. Rapid Colorimetric Assay for Antimicrobial Susceptibility Testing of Pseudomonas aeruginosa // Antimicrobial Agents and Chemoterapy. - 2004. - Vol.48, N 5. - Р.1879-1881). В настоящее время также используется метод проточной цитометрии (Розанов Ю.М. Проточная цитометрия // Методы культивирования клеток. Сб. научн. трудов. Ленинград, Наука, 1988, стр.136-146). Вышеуказанные методы имеют проблемы, осложненные режимными требованиями при работе с возбудителями особо опасных инфекций, кроме того, сами приборы очень дорогостоящие и далеки от внедрения в практическую медицину.

Целью изобретения является разработка ускоренного метода определения чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам на основе использования плотной среды с индикатором (ПСИ). Поставленная цель достигается за счет применения предлагаемой среды, содержащей триптон и глюкозу с индикатором бромтимоловым синим, зона перехода окраски для бромтимолового синего 6,0-7,6 (кислая - желтая, щелочная - синяя окраска), исходная рН среды 6,8, и предварительной подготовки перед посевом исследуемых буркхольдерий. Для этого готовят среду следующего состава:

Триптон2,0 гNaCl5,0 гК₂HPO₄0,3 гБромтимоловый синий0,08 гАгар15,0 гДистиллированная водадо 1000 млрН среды6,8

Стерильный раствор глюкозы (10 г/л) добавляют в среду перед разливом чашек при температуре 45°С. Чашки со средой готовят за сутки, подсушивают и перед нанесением дисков ставят в термостат для прогревания. На прогретые чашки со средой наносят 10⁸ м.к. взвеси испытуемого штамма буркхольдерий в количестве 0,2 мл, хорошо раскатывают шпателем и затем на чашки со средой помещают диски, пропитанные антибиотиками. После 3-5 часов инкубации (в зависимости от вида возбудителя) при температуре 37°С учитывают результат: зоны задержки роста микробов вокруг дисков остаются с неизмененным зеленоватым цветом, а в зонах роста культур вне действия антибиотиков отмечается пожелтение среды за счет закисления среды в результате расщепления глюкозы размножающимися бактериями.

Для контроля адекватности результатов в ускоренном методе параллельно помещают диски на стандартную среду Antibiotic medium 2 ("Difco", USA) следующего состава:

Мясной экстракт1,5 гДрожжевой экстракт3,0 гПептон6,0 гАгар15,0 гДистиллированная водадо 1000 мл

На поверхность агара Antibiotic medium 2, засеянного испытуемыми микробами, помещают диски, пропитанные антибиотиками. Результат учитывают согласно прилагаемой инструкции, путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска через 24-48 ч инкубации при 37°С. Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска говорит о том, что испытуемый штамм не чувствителен к данному антибиотику. Если диаметр зоны задержки роста бактерий превышает величину, указанную в проспектах к фирменным дискам, то штамм оценивается как чувствительный к данному антибиотику. В таблице 1 приведены сравнительные данные определения чувствительности буркхольдерий к антибиотикам на стандартной среде и плотной среде с индикатором.

Таблица 1.Величина зон задержки роста культур буркхольдерий на стандартной среде через 24 часа инкубации и плотной среде с индикатором через 3-5 часов инкубацииВид буркхольдерийntДиаметр зоны вокруг диска (Me)ДоксициклинЛомефлоксацинГентамицинЦефтазидимХлорамфениколВ.mallei5420 (22)20 (20)12 (15)12 (14)12 (14)B.pseudomallei5520 (22)20 (25)R18 (20)14 (15)В.thailandensis5520 (24)16 (20)R16 (18)14 (14)B.cepacia10312 (14)18 (20)10 (12)16 (20)18 (20)B.gladioli23RR10 (10)10 (10)RПримечание: в столбцах указан размер зоны ингибирования роста микроорганизмов в мм на ПСИ при учете изменения цвета среды через 3-5 часов; в скобках - на среде Antibiotic medium 2 через 24 часа; R - отсутствие зон подавления роста вокруг дисков; n - число штаммов; t - время пожелтения среды в часах; Me - средний показатель (медиана) зон ингибированного роста штаммов каждого вида.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. На поверхность ПСИ засевали суточную агаровую культуру исследуемых микроорганизмов и инкубировали при 37°С. При росте на ПСИ гликолитических бактерий происходит сдвиг рН среды в кислую сторону, и этот процесс визуализируется за счет индикатора бромтимолового синего через 3-5 часов инкубации. При росте культур цвет плотной агаровой среды с индикатором приобретает желтый цвет. В таблице 2 указано время изменения цвета ПСИ при росте исследуемых микроорганизмов.

Таблица 2.Рост микроорганизмов на плотной среде с индикаторомВид микроорганизмовnВремя изменения цвета (пожелтение) средыBurkholderia pseudomallei54-5 часовBurkholderia mallei53-4 часаBurkholderia cepacia104-5 часовBurkholderia thailandensis54-5 часовBurkholderia gladiloli23-4 часаPseudomonas aeruginosa23-4 часаEscherichia coli23-4 часаStenotrophomonas maltophilia24-5 часовKlebsiella pneumoniae23-4 часаProteus vulgaris23-4 часаПримечание: n - число штаммов;температура культивирования 37°С

Пример 2. Сравнительная оценка определения чувствительности В.pseudomallei 107 к гентамицину, хлорамфениколу, доксициклину, цефтазидиму, ломефлоксацину, выполненная стандартным методом дисков на специально предназначенной для этой цели среде Antibiotic medium 2 и с применением плотной среды с индикатором (ПСИ).

На поверхность агара Antibiotic medium 2, засеянного В.pseudomallei 107, помещали диски, пропитанные вышеуказанными антибиотиками. Результат учитывали согласно прилагаемой инструкции, путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска через 24 ч инкубации при 37°С (см. чертеж). Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска говорит о том, что испытуемый штамм не чувствителен к данному антибиотику. Если диаметр зоны задержки роста бактерий превышает величину, указанную в проспектах к фирменным дискам, то штамм оценивается как чувствительный к данному антибиотику.

При определении чувствительности B.pseudomallei 107 к гентамицину, хлорамфениколу, доксициклину, цефтазидиму, ломефлоксацину с применением плотной среды с индикатором стерильный раствор глюкозы (10 г/л) добавляли в ПСИ перед разливом чашек при температуре 45°С. Предлагаемую среду в чашки Петри разливали за сутки, подсушивали и перед нанесением дисков помещали в термостат для прогревания на 2 часа при 37°С. На прогретые чашки со средой наносили 10⁸ м.к. взвеси испытуемого штамма буркхольдерий в количестве 0,2 мл, хорошо раскатывали шпателем и затем на чашки помещали диски, пропитанные антибиотиками. После 5 часов инкубации при температуре 37°С учитывали результат: зоны задержки роста микробов вокруг дисков остаются с не измененным зеленоватым цветом, а в зонах роста культур вне действия антибиотиков отмечается пожелтение среды. На чертеже видно, что диаметр зон ингибирования роста микроорганизмов на обеих средах практически идентичен, в то же время учет результатов по предлагаемому способу на среде ПСИ значительно ускорен по сравнению со стандартной средой (3-5 часов и 18-24 часа соответственно).

Изобретение касается ускоренного способа определения чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам. Ускоренный метод определения основан на использовании плотной питательной среды с индикатором (ПСИ), содержащей триптон и глюкозу с индикатором бромтимоловым синим, зона перехода окраски для бромтимолового синего 6,0-7,6 (кислая - желтая, щелочная - синяя окраска), исходная рН среды 6,8, и предварительной подготовки перед посевом исследуемых буркхольдерий. Для определения готовят среду следующего состава (г/л): триптон - 2,0, NaCl - 5,0, К₂HPO₄ - 0,3, бромтимоловый синий - 0,08, агар - 15,0, дистиллированная вода до 1 л, рН 6,8. Стерильный раствор глюкозы (10 г/л) добавляют в среду перед разливом чашек при температуре 45°С и разливают слоем толщиной 4,0±0,5 мм за сутки до проведения определения. Исследуемую культуру микроорганизмов разводят до 10⁸ м.к./мл в 0,85% NaCl, прогретом до 37°С, и поддерживают эту температуру до момента посева. На прогретые чашки со средой наносят 10⁸ м.к. взвеси испытуемого штамма буркхольдерий в количестве 0,2 мл, затем на агаровую поверхность помещают диски, пропитанные антибиотиками. После 3-5 часов инкубации (в зависимости от вида возбудителя) учитывают результат: зоны задержки роста микробов вокруг дисков остаются с неизмененным зеленоватым цветом, а в зонах роста культур вне действия антибиотиков отмечается пожелтение среды за счет закисления среды в результате расщепления глюкозы размножающимися бактериями. Способ позволяет ускорить определение чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам, учет результатов на среде ПСИ значительно укорачивается по сравнению со стандартной средой (3-5 часов и 18-24 часа соответственно). 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ ускоренного определения чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам, включающий посев исследуемого микроорганизма на плотную питательную среду, нанесение дисков, пропитанных антибиотиками, инкубацию и последующий учет результатов определения, отличающийся тем, что взвесь исследуемых культур буркхольдерий наносят на плотную питательную среду с индикатором (ПСИ), содержащую, г/л:

Триптон2,0NaCl5,0К₂HPO₄0,3Бромтимоловый синий0,08Агар15,0Дистиллированная вода До 1 л

pH среды 6,8,

перед разливом среды в чашки Петри при температуре 45°С добавляют 10 г/л стерильного раствора глюкозы и разливают среду слоем толщиной 4,0±0,5 мм за 24 ч до проведения определения, а чувствительность буркхольдерий к химиопрепаратам определяют по наличию зоны подавления роста и отсутствию изменения исходного цвета питательной среды.