СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ МИКРОБНОЙ ЭТИОЛОГИИ Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/18 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для выбора антибиотика, наиболее эффективного для лечения воспалительного заболевания микробной этиологии.

При назначении лечения антибиотиками необходимо использовать такие из них, к которым чувствителен возбудитель воспалительного заболевания, и которые могут обеспечить терапевтический эффект не вызывая при этом никаких побочных эффектов. Применение антибиотиков рационально только тогда, когда оно обеспечивает излечение больного с ликвидацией в организме возбудителя. Воспалительные заболевания чаще всего вызываются ассоциациями микроорганизмов. При этом чувствительные к применяемому препарату микроорганизмы будут ликвидированы, а нечувствительные останутся и будут продолжать воспалительную реакцию. Кроме того, в процессе жизнедеятельности микробы-симбионты могут выделять вещества, усиливающие или подавляющие рост, размножение бактерий, экспрессию их биологических свойств, в частности уровень чувствительности к антибиотикам.

Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений антибиотика в питательной среде [1]. Этот метод используется в научно-исследовательских лабораториях для точного количественного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. В практических лабораториях используют диско-диффузионный метод [2]. Метод заключается в том, что на поверхность подсушенной питательной среды в чашке Петри наносят 1 мл взвеси исследуемой культуры, равномерно распределяют путем покачивания и удаляют избыток пипеткой. Посевы подсушивают при комнатной температуре 10-15 минут. Пинцетом накладывают диски, пропитанные антибиотиками, на равном расстоянии друг от друга и на 2 см от края чашки. Инкубируют 18-20 часов при t=35-37°С. В процессе инкубации антибиотик диффундирует в агар и влияет на рост исследуемой культуры. О чувствительности исследуемых культур к антибиотику и возможности его применения для лечения воспалительного заболевания судят по диаметру зоны задержки роста культур вокруг диска с антибиотиком.

В последние десятилетия в практике лабораторий применяется ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с помощью компьютерных систем, автоматически производящими выделение бактерий из исследуемых образцов и определяющие их чувствительность к антибактериальным препаратам [3].

Недостатком всех этих методов является то, что при определении чувствительности микроорганизмов к тому или иному антибиотику не учитывается феномен симбиоза микробов, в то время как большинство микроорганизмов в естественных условиях находятся в определенных взаимоотношениях друг с другом и с окружающей средой. Из этого следует, что при назначении любого антибиотика необходимо учитывать чувствительность к нему микробов в условиях межмикробных взаимодействий в исследуемой экологической нише тела человека.

Заявляемый способ решает задачу создания нового эффективного способа определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии из микрофлоры экологической ниши тела человека, являющейся очагом воспаления, выделяют чистые культуры возбудителя и условно-патогенных микроорганизмов, готовят их микробные взвеси, проводят штампом перекрестный посев микробных взвесей возбудителя с каждым из выделенных представителей условно-патогенных микроорганизмов на плотную питательную среду, контрольные посевы этих же культур проводят полосой, на место перекреста в опыте и на центр посева в контроле наносят индикаторный диск, пропитанный антибиотиком, инкубируют и измеряют диаметр зон задержки роста культур вокруг диска в опыте и контроле, при увеличении его у возбудителя в опыте по сравнению с контролем на 1 мм и более и одновременно уменьшении на 1 мм и более или неизменении у каждого из условно-патогенных микроорганизмов в опыте по сравнению с контролем считают антибиотик эффективным.

Новая совокупность признаков позволяет достичь при осуществлении изобретения новый технический результат, который состоит в том, что новый способ определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии за счет учета межмикробного взаимодействия микроорганизмов позволяет выбрать антибиотик, который губительно действует на возбудителя, вызывающего воспалительное заболевание, и не влияет на представителей условно-патогенных микроорганизмов данной экологической ниши.

Ранее авторами экспериментально установлены межмикробные связи в микрофлоре слизистой оболочки миндалин здоровых и больных хроническим тонзиллитом, влияющие на экспрессию факторов патогенности и персистенции [4].

Для исследования изменений чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в условиях межмикробных взаимодействий авторами проводились следующие работы.

Для стандартизации посевов авторами разработан штамп из нержавеющей стали (ГОСТ 5949-75), размеры поверхности соприкосновения 9×30 мм (30 мм - это значение максимального диаметра зон действия антибиотика, 9 мм - это двойной диаметр бумажного диска, пропитанного антибиотиком, - ТУ 9398-001-39484474-00 “Диски индикаторные картонные с противомикробными лекарственными средствами ДИ-ПЛС-50-01”, производитель ЗАО “Научно-исследовательский центр фармакотерапии” С.-Петербург) (фиг.1). Стерилизация производится прокаливанием в пламени спиртовки в течение 10 секунд, затем штамп остужается в стерильной дистиллированной воде в течение 10 секунд. Применение данного штампа обеспечивает равномерное нанесение микробной взвеси на поверхность агара.

Готовились одномиллиардные (1 млрд.) взвеси чистых культур микроорганизмов в стерильном физиологическом растворе. Для стандартизации методики на дно стерильной чашки Петри укладывался стерильный круг фильтровальной бумаги d=50 мм (ГОСТ 12026), на него помещался 1,0 мл 1 млрд. взвеси микроорганизма (для каждого штамма микроорганизмов использовалась своя чашка с кругом). Стерильный и остуженный штамп смачивался взвесью микроорганизмов путем соприкосновения с кругом. Прикрепившиеся микроорганизмы переносились на плотную питательную среду (1,5% мясопептонный агар): контрольные посевы - полосой по периферии чашки (отступя от края чашки на 2 см), опытные - перекрестом в центре. На место перекреста в опыте и в центр посева в контроле накладывался бумажный диск, пропитанный антибиотиком (ТУ 9398-001-39484474-00 “Диски индикаторные картонные с противомикробными лекарственными средствами ДИ-ПЛС-50-01”, производитель ЗАО “Научно-исследовательский центр фармакотерапии” С.-Петербург).

Чашки инкубировались в термостате при t=37°C 24 часа, затем измеряли диаметр зон задержки роста культур в опыте и в контроле, проводили учет результатов и судили об изменении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

В клинической практике, исходя из различных диаметров зон задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками, микроорганизмы распределяют на ряд групп по степени чувствительности к антибиотикам: устойчивые, среднеустойчивые, чувствительные [2]. Разница в диаметре зоны задержки роста микроорганизма при действии антибактериального препарата между этими группами составляет 1 мм. Поэтому нами предложено считать изменение диаметра зоны задержки роста микробов-симбионтов на 1 мм в сторону увеличения или уменьшения достоверным для оценки изменения чувствительности микроорганизмов к антибиотику. Если в опыте по сравнению с контролем диаметр зоны задержки роста возбудителя на 1 мм больше, то можно говорить об усилении чувствительности к данному антибиотику у патогена в ассоциации с представителем условно-патогенной микрофлоры, если, одновременно, микробы-ассоцианты, представители условно-патогенной микрофлоры, устойчивы или низкочувствительны к антибиотику как в монокультуре, так и в условиях симбиоза с патогеном, то предпочтительно применение данного антибиотика, так как он губительно действует на патогена и не действует на условно-патогенные микроорганизмы. Если же диаметр зоны задержки роста патогена уменьшится в опыте, то это говорит о снижении чувствительности возбудителя к данному препарату и его нельзя применять для лечения больного. Нежелательно применение антибиотика в случае чувствительности к нему микроорганизма, представителя условно-патогенной флоры как в монокультуре, так и в ассоциации с патогеном.

Авторами из клинического материала (слизистой оболочки миндалин больных хроническим тонзиллитом лиц) было выделено 95 штаммов микроорганизмов (86,3% составляли условно-патогенные микроорганизмы: коагулазоотрицательные стафилококки, стрептококки и другие микроорганизмы, 13,7% - S.aureus) и исследовано изменение чувствительности их к наиболее часто применяемым в практическом здравоохранении антибиотикам: пенициллинам (оксациллин, ампициллин), гликопептидам (ванкомицин), линкосамидам (клиндомицин), хлорамфениколу (левомицетин), макролидам (эритромицин), аминогликозидам (гентамицин) в условиях межмикробных взаимодействий.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Выделенные микроорганизмы образовывали между собой 2562 связи (366 связей в каждой группе антибиотиков). В большинстве случаев штаммы сохраняли прежнюю чувствительность к антибиотикам в условиях межмикробных взаимодействий. Однако снижение чувствительности к исследуемым препаратам отмечалось чаще, чем повышение ее, т.е. микроорганизмы взаимно повышали устойчивость к антибиотикам, что способствовало селекции антибиотикорезистентных биоваров.

В дальнейшем было проанализировано изменение чувствительности к каждому из исследуемых антибиотиков. Патогенные микроорганизмы (S.aureus) образовывали с остальными штаммами 47 связей, тогда как условно-патогенные - 319 связей в отношении изменения чувствительности к каждому антибиотику. Результаты в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что у патогена S.aureus в условиях межмикробных взаимодействий чаще снижалась или сохранялась прежняя чувствительность к антибиотикам, чем у условно-патогенных микроорганизмов. Тогда как у последних в условиях межмикробных взаимодействий чаще повышалась чувствительность к антибиотикам. Поэтому так важно при лечении воспалительных заболеваний микробной этиологии определить эффективный антибиотик, который губительно действует на возбудителя, вызывающего воспаление, и не влияет на представителей условно-патогенных микроорганизмов данной экологической ниши.

Способ осуществляется следующим образом.

Из микрофлоры экологической ниши тела человека, являющейся очагом воспаления, выделяют чистые культуры возбудителя и условно-патогенных микроорганизмов. Готовят одномиллиардные (1 млрд.) взвеси суточных культур микробов-симбионтов на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд. КОЕ/мл и проводят штампом перекрестный посев микробных взвесей возбудителя с каждым из выделенных представителей условно-патогенных микроорганизмов на 1,5% мясопептонный агар. Контрольные посевы этих же культур проводят полосой по периферии чашки Петри. На место перекреста в опыте и на центр посева в контроле наносят индикаторный диск, пропитанный антибиотиком (ТУ 9398-001-39484474-00 “Диски индикаторные картонные с противомикробными лекарственными средствами ДИ-ПЛС-50-01”, производитель ЗАО “Научно-исследовательский центр фармакотерапии” С.-Петербург) (фиг.2). Посевы инкубируют в термостате 24 часа при t=37°C и измеряют диаметр зон задержки роста культур вокруг диска в опыте и контроле (фиг.3), при увеличении его у возбудителя в опыте по сравнению с контролем на 1 мм и более и одновременно уменьшении на 1 мм и более или неизменении у каждого из условно-патогенных микроорганизмов в опыте по сравнению с контролем считают антибиотик эффективным.

Пример 1. Ребенок Р., 14 лет. Диагноз: хронический тонзиллит в стадии субкомпенсации, обострение. Со слизистой миндалин выделены чистые культуры условно-патогенных микроорганизмов (штаммы №1 КОС (S.saprophyticus), №2 КОС (S.hominis), №3 Str.mitis) и патогена (№4 S.aureus). Были приготовлены одномиллиардные (1 млрд.) взвеси этих микроорганизмов. С помощью штампа в центре чашки Петри проводился перекрестный посев микробных взвесей возбудителя с каждым из выделенных представителей условно-патогенных микроорганизмов на 1,5% мясопептонный агар, контрольные посевы проводились по периферии чашки полосой. На центр контрольных посевов и на место перекреста в опыте накладывались диски, пропитанные антибиотиком (ТУ 9398-001-39484474-00 “Диски индикаторные картонные с противомикробными лекарственными средствами ДИ-ПЛС-50-01”, производитель ЗАО “Научно-исследовательский центр фармакотерапии” С.-Петербург). Исследовалось изменение чувствительности к наиболее часто применяемым в практическом здравоохранении антибиотикам: пенициллинам (оксациллин, ампициллин), гликопептидам (ванкомицин), линкосамидам (клиндомицин), хлорамфениколу (левомицетин), макролидам (эритромицин), аминогликозидам (гентамицин) в условиях межмикробных взаимодействий. Посевы инкубировались в термостате 24 часа при t=37°C. При оценке изменений чувствительности выделенных штаммов к антибиотикам в условиях симбиоза установлено следующее (таблица 3).

Из таблицы 3 видно, что в условиях сокультивирования штаммов №1+№4 чувствительность штамма №4 повысилась к ванкомицину и оксациллину, тогда как к остальным антибиотикам чувствительность штаммов №1 и №2 снижалась. В паре №2+№4 чувствительность штамма №2 к ванкомицину не изменилась, у штамма №4 повысилась, тогда как к остальным антибиотикам чувствительность микробов-ассоциантов снижалась. В паре №3+№4 у штамма №3 наибольшее снижение чувствительности наблюдалось к ванкомицину и клиндомицину, тогда как у штамма №4 отмечалось значительное повышение чувствительности к ванкомицину и левомицетину, а к остальным антибиотикам чувствительность снижалась. Таким образом, ванкомицин можно считать эффективным для лечения данного ребенка, т.к. данный антибиотик подавляет рост патогена и не влияет на представителей нормофлоры. Был проведен курс лечения данным препаратом, отмечалось улучшение самочувствия, прекратилось выделение гнойных пробок из лакун миндалин. В течение последующего года случаев обострения хронического тонзиллита не наблюдалось.

Пример 2. Ребенок К., 13 лет. Диагноз: хронический тонзиллит в стадии компенсации, обострение. Со слизистой миндалин выделены чистые культуры условно-патогенных микроорганизмов (№1 Str.mutans и №4 КОС (S.lugdunensis)) и штаммы патогенов (№2 S.aureus и №3 S.aureus). Были приготовлены их микробные взвеси. С помощью штампа в центре чашки Петри проводился перекрестный посев микробных взвесей возбудителя с каждым из выделенных представителей условно-патогенных микроорганизмов на 1,5% мясопептонный агар, контрольные посевы проводились по периферии чашки полосой. На центр контрольных посевов и на место перекреста в опыте накладывались диски, пропитанные антибиотиком. Посевы инкубировались в термостате 24 часа при t=37°C. Изменение чувствительности каждого микроба-ассоцианта к антибиотикам в паре патоген - условно-патогенный микрооорганизм осуществлялось аналогично примеру 1. При оценке изменений чувствительности выделенных штаммов к антибиотикам в условиях симбиоза установлено, что при сокультивировании штаммов №1+№2 и №1+№3 не изменялась чувствительность данных штаммов к ванкомицину, клиндомицину, эритромицину, тогда как к другим препаратом отмечалось повышение чувствительности у условно-патогенной флоры и снижение у патогенов. При сокультивировании штаммов №2+№4 и №3+№4 не изменялась чувствительность к ампициллину, гентамицину, ванкомицину, клиндомицину, левомицетину, тогда как к другим препаратам было выявлено повышение устойчивости патогеной флоры при снижении устойчивости условно-патогенной. С учетом полученных данных рекомендовано лечение данного больного клиндомицином или ванкомицином, так как они подавляют рост патогена и не влияют на представителей нормальной микрофлоры. Проведено успешное лечение данного больного клиндомицином, в последующий период наблюдений обострение хронического тонзиллита не отмечалось.

Таким образом, заявляемый способ определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии позволяет выбрать антибиотик, который губительно действует на возбудителя, вызывающего воспалительное заболевание, и не влияет на представителей условно-патогенных микроорганизмов данной экологической ниши.

Источники информации

1. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Биргер М.О. - М., 1982, c.300.

2. Медицинская микробиология, часть первая./Под ред. Королюка А.М. и Сбойчака В.Б. - СПб., 1999, с.58-68.

3. Медицинская микробиология./Учебник для вузов. Под ред. Покровского В. - М.: ГЕОТАР Медицина, 2001, с.355.

4. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова Л.М. Некоторые особенности микрофлоры миндалин и межмикробного взаимодействия (в норме и при патологии). ЖМЭИ, 2000, №4, приложение, с.82-84.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для выбора антибиотика, наиболее эффективного для лечения воспалительного заболевания микробной этиологии. Способ осуществляют путем выделения из микрофлоры экологической ниши тела человека, являющейся очагом воспаления, чистых культур возбудителя и условно-патогенных микроорганизмов. Готовят из них микробные взвеси и проводят штампом перекрестный посев микробных взвесей возбудителя с каждым из выделенных представителей условно-патогенных микроорганизмов на плотную питательную среду. Контрольные посевы этих же культур проводят полосой, на место перекреста в опыте и на центр посева в контроле наносят индикаторный диск, пропитанный антибиотиком. Посевы инкубируют и измеряют диаметр зон задержки роста культур вокруг диска в опыте и контроле. При увеличении диаметра зон у возбудителя в опыте по сравнению с контролем на 1 мм и более и одновременно уменьшении на 1 мм и более или отсутствии изменения у каждого из условно-патогенных микроорганизмов в опыте по сравнению с контролем считают антибиотик эффективным. Способ позволяет выбрать антибиотик, который губительно действует на возбудителя, вызывающего воспалительное заболевание, и не влияет на представителей условно-патогенных микроорганизмов данной экологической ниши. 3 ил., 3 табл.

Способ определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии, отличающийся тем, что из микрофлоры экологической ниши тела человека, являющейся очагом воспаления, выделяют чистые культуры возбудителя и условно-патогенных микроорганизмов, готовят их микробные взвеси, проводят штампом перекрестный посев микробных взвесей возбудителя с каждым из выделенных представителей условно-патогенных микроорганизмов на плотную питательную среду, контрольные посевы этих же культур проводят полосой, на место перекреста в опыте и на центр посева в контроле наносят индикаторный диск, пропитанный антибиотиком, инкубируют и измеряют диаметр зон задержки роста культур вокруг диска в опыте и контроле, при увеличении его у возбудителя в опыте по сравнению с контролем на 1 мм и более и одновременно уменьшении на 1 мм и более или отсутствии изменения у каждого из условно-патогенных микроорганизмов в опыте по сравнению с контролем считают антибиотик эффективным.