Способ повышения чувствительности холерных вибрионов к антибактериальным препаратам Российский патент 2019 года по МПК A61K31/196 G01N33/50 

Описание патента на изобретение RU2688165C1

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторных или экспериментальных исследованиях при изучении антибиотикочувствительности холерных вибрионов.

В основе лечения холеры лежит патогенетическая терапия. Наряду с этим, использование антибактериальных препаратов позволяет сократить продолжительность заболевания, уменьшить объемы регидратационной терапии, предупредить формирование вибриононосительства. В инструктивно-методических документах (1-6) для лечения и профилактики холеры рекомендуется использовать фуразолидон, триметоприм / сульфаметоксазол, эритромицин, хлорамфеникол, фторхинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, норфлоксацин, ломефлоксацин (с 18 лет)), тетрациклин и доксициклин (у лиц старше 8 лет), рифампицин, канамицин.

Однако, в настоящее время повсеместно распространены штаммы Vibrio cholerae, устойчивые к вышеперечисленным препаратам и обладающие множественной антибиотикорезистентностью. Последняя резко ограничивает выбор эффективных средств этиотропной терапии холеры и требует поиска веществ, повышающих антибиотикочувствительность возбудителя.

Известен способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий (7), заключающийся в применении антибиотиков в комбинации с ингибиторами бактериальных ферментов: клавулановая кислота (клавуланат), сульбактам и тазобактам, на их основе созданы комбинированные препараты, содержащие аминопенициллиновый или цефалоспориновый антибиотик и один из ингибиторов бета-лактамаз (амоксициллин/клавуланат, ампициллин/ сульбактам, цефоперазон/ сульбактам, тикарциллин / клавуланат).

Недостатком данного способа является то, что указанные комбинации препаратов преодолевают резистентность микробов, обусловленную только выработкой бета-лактамаз.

Известен способ повышения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (8), основанный на воздействии препарата бактериального происхождения. В качестве активного вещества, оказывающего одновременно бактерицидное, противовоспалительное и

иммуностимулирующее действие, используют водный раствор пиластина. Однако использование пиластина может привести к развитию аллергических реакций.

Известен способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий, включающий комбинированное применение двух антибиотиков с различным механизмом действия: пенициллина и стрептомицина, гентамицина и ампициллина (9).

Недостаток этого способа - ограниченный спектр активности данных комбинаций в отношении антибиотикорезистентных штаммов V. cholerae.

За прототип выбран способ повышения антибиотикочувствительности микроорганизмов, включающий комбинированное воздействие антибактериального препарата и нестероидного противовоспалительного средства диклофенака в субингибирующей концентрации (10)

Недостатком этого способа является использование диклофенака в концентрации 80 мг/л, что не обеспечивает статистически значимое повышение антибиотикочувствительности.

Техническим результатом предполагаемого изобретения является разработка нового эффективного способа, позволяющего повысить чувствительность холерных вибрионов к антибактериальным препаратам при их совместном применении с диклофенаком в отношении антибиотикорезистентных штаммов холерных вибрионов Эль Top in vitro и vivo.

Технический результат достигается за счет того, что в способе повышения чувствительности холерных вибрионов к антибактериальным препаратам, включающем использование препаратов снижающих экспрессию генов антибиотикорезитентности, в качестве экспрессирующего препарата, применяют диклофенак в количестве 500 мг/л, при этом исследования осуществляют in vivo и in vitro, причем в последнем случае используют метод серийных разведений и диско- диффузионный метод, а затем проводят оценку результатов исследований, соответствующую проведенным методам.

Кроме того при методе серийных разведений готовят два ряда чашек с питательной средой Мюллера-Хинтона с двукратными разведениями выбранного антибиотика, а именно левомицетина, стрептомицина, фуразолидона - 1-2-4-8-16-32-64-128-256-512 мг/л среды; цефтриаксона - 0,5-1-2-4 мг/л среды; ципрофлоксацина - 0,0001-0,00025-0,0005-0,001-0,0025-0,005-0,01-0,025-0,05-0,1-0,25-0,5-1-2-4 мг/л среды, при этом во второй ряд чашек дополнительно вводят диклофенак в концентрации 500 мг/л, затем на все чаши засевают 0,05 мл исследуемого штамма V. cholerae из предварительно подготовленной бактериальной взвеси, содержащей 106 м.кл по оптическому стандарту мутности в количестве 5 ед., в качестве контроля используют среду Мюллера-Хинтона без антибиотика и диклофенака, посевы инкубируют при 37 С в течение 16-18 часов, учет результатов проводят по величине минимальной подавляющей концентрации (МПК), которая полностью подавляет рост культуры V. cholerae при обязательном росте бактерий на контрольных чашках, уменьшение значений МПК в присутствии диклофенака, в сравнении со значениями МПК этих препаратов без воздействия диклофенака, свидетельствует о его способности повышать чувствительность V. cholerae к антибиотикам.

При этом для диско-диффузионного метода готовят чашки с агаром Мюллера-Хинтона в два ряда, в один из которых добавляют 500 мг/л диклофенака, затем на поверхность агара засевают бактерии исследуемых штаммов V.cholerae из предварительно подготовленной суспензии, содержащей n×106 м.кл/мл посев производят в объеме 0,2-0,3 мл, равномерно распределяя шпателем, после впитывания суспензии в агар на его поверхность накладывают диски с отобранным антибиотиком, а на контрольные чашки с 500 мг/л диклофенака и без него диски не накладывают, посевы инкубируют в течение 16-18 часов при 37°C, оценку результатов проводят визуально по размеру зон подавления роста бактерий на среде, содержащей диклофенак или без него.

Для проведения in vivo белых мышей массой 18-20 г. заражают внутрибрюшинно взвесью 18 часовой агаровой культуры 37°С холерного вибриона в 0,3% агаризованном 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 108 м.кл в объеме 0,2 мл, лечение антибактериальными препаратами и диклофенаком начинают сразу после заражения и проводят по отдельности либо одновременно в течение 3-х дней (один раз в сутки) в дозах, соответствующих среднесуточным человекодозам, а именно диклофенаком в дозе 0,25 мг/мышь/сут, ципрофлоксацином - 2,0 мг/мышь/сут, стрептомицином - 2,0 мг/мышь/сут, цефтриаксоном 10,0 мг/мышь/сут, фуразолидоном - 4,0 мг/мышь/сут, левомицетином - 10,0 мг/мышь/сут, наблюдают животных в течение 10 суток, результаты оценивают по числу выживших животных, выраженному в процентах.

Предварительную подготовку при методе серийных разведений исследуемых штаммов проводят по следующей технологии: готовят бактериальную взвесь из 18 часовой агаровой культуры V. cholerae, выращенной на агаре Мартена при рН 7,6 затем готовят 1 млрд. взвесь по отраслевому стандарту мутности, для этого в стерильной бактериологической пробирке суспендируют культуру в 5 мл физиологического раствора.

Способ осуществляется следующим образом

В работе используют 4 штамма V. cholerae El Tor: 19191, 18826, 19242, 19667. Все штаммы получены из музея живых культур ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора, где они хранятся в лиофилизированном состоянии.

Культуры выращивают на среде Мюллера-Хинтона (Himedia, Индия).

В исследовании использован диклофенак (производства ООО «Хемофарм», Россия).

Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) диклофенака проводят методом двукратных серийных разведений этого препарата в плотной питательной среде (агар Мюллера-Хинтона). МПК определяют по минимальной концентрации вещества, подавляющей рост микробов.

За субингибирующую дозу принимают максимальную концентрацию диклофенака, не приводящую к подавлению роста бактерий исследуемых штаммов. Посевы инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч. Учет результатов проводят при наличии роста культуры на контрольных чашках (без диклофенака).

Способ реализуют путем совместного действия на штаммы V. cholerae, в том числе антибиотикоустойчивые, диклофенака в концентрации 500 мг/л и двукратных разведений антибактериальных препаратов.

Способ повышения чувствительности V. cholerae к антибактериальным препаратам реализуется по общепринятой методике определения чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций к антибактериальным препаратам методом серийных разведений в плотной питательной среде или диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.2495-09 (11). Отличием является добавление в среды с антибактериальными препаратами раствора диклофенака до конечной концентрации 500 мг/л

В основу заявленного способа положено обнаружение повышения чувствительности к антибактериальным препаратам V. cholerae, в том числе антибиотикоустойчивых штаммов, при совместном действии антибиотика и диклофенака. Данный эффект связан со способностью диклофенака снижать экспрессию бактериальных генов антибиотикорезистентности (10).

1. Метод серийных разведений в плотной питательной среде.

1.1 Подготовка чашек Петри с питательной средой.

Для метода серийных разведений в плотной питательной среде готовят два ряда чашек с питательной средой Мюллера-Хинтона: 1-й ряд содержит двукратные разведения исследуемого антибиотика (левомицетина, стрептомицина, фуразолидона - 1-2-4-8-16-32-64-128-256-512 мг/л среды; цефтриаксона - 0,5-1-2-4 мг/л среды; ципрофлоксацина - 0,0001-0,00025-0,0005-0,001-0,0025-0,005-0,01-0,025-0,05-0,1-0,25-0,5-1-2-4 мг/л среды). Параллельно готовят такой же ряд чашек, но в среду дополнительно вводят диклофенак в концентрации 500 мг/л.

1.2 Подготовка культуры

Из 18 часовой агаровой культуры V. cholerae, выращенной на агаре Мартена (рН 7,6±0,1) либо щелочном агаре (рН 7,8±0,1), готовят 1 млрд. взвесь по отраслевому стандарту мутности ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО-42-28-86). Для этого в стерильной бактериологической пробирке суспендируют культуру в 5 мл физиологического раствора.

На чашки засевают по 0,05 мл (капля) исследуемого штамма из бактериальной взвеси, содержащей 106 м.кл./мл по оптическому стандарту мутности 5 ед. либо используют для этого штамп-репликатор (при большом количестве исследуемых культур). В качестве контроля используют среду Мюллера-Хинтона (без антибиотика и диклофенака). Посевы инкубируют при 37°С в течение 16-18 ч. Результаты учитывают по величине МПК (минимальная подавляющая концентрация) при обязательном росте бактерий на контрольных чашках.

1.3 Учет результатов.

Результат учитывают по величине минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибактериального препарата, которая полностью подавляет рост культуры V. cholerae. Уменьшение значений МПК антибактериальных препаратов в присутствии диклофенака, в сравнении со значениями МПК этих препаратов без воздействия диклофенака, свидетельствуют о его способности повышать чувствительность V. cholerae к антибиотикам.

2. Диско-диффузонный метод.

2.1 Подготовка сред.

Для диско-диффузионного метода готовят чашки с агаром Мюллера-Хинтона в два ряда, в один из которых добавляют 500 мг/л диклофенака,

2.2 Подготовка культуры.

Для определения уровня устойчивости исследуемого штамма Vibrio cholerae готовят суспензию, соответствующую n×109 м.кл./мл по оптическому стандарту мутности ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО-42-28-86). Из суспензии n×107 м.кл./мл производят посев в объеме 0,2-0,3 мл, равномерно распределяя шпателем. После впитывания суспензии в агар на его поверхность накладывают диски с левомицетином, цефтриаксоном, ципрофлоксацинолл, стрептомицином, фуразолидоном. На контрольные чашки с 500 мг/л диклофенака и без него диски не накладывают. Посевы инкубируют в течение 16-18 часов при 37°С, оценку результатов проводят визуально по размеру зон подавления роста бактерий на среде, содержащей диклофенак или без него.

Статистическую обработку полученных результатов проводят с использованием парного t-критерия Стьюдента для зависимых совокупностей (12).

Варианты примеров, проведенных in vitro и in vivo подтверждающих возможность использования диклофенака для повышения

чувствительности холерных вибрионов к антибактериальным препаратам. Пример 1.

Изучены значения МПК антибактериальных препаратов в присутствии диклофенака (500 мг/л) и без него в отношении 4 клинических изолятов V. cholerae El Tor: 19191, 18826, 19242, 19667, полученных из музея живых культур ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.

Таким образом, в присутствии диклофенака в отношении штаммов V. cholerae El Tor наблюдают снижение значений МПК в 2-4 раза левомицетина, ципрофлоксацина, фуразолидона, триметоприма/ сульфаметоксазола.

Пример 2.

Проверяют действие диклофенака на антибиотикочувствительность штаммов V. cholerae El Tor 18826, 19667, 19242, 19191 диско-диффузионным методом (таблица 2).

Результаты учитывают по увеличению диаметров зон задержки роста V. cholerae вокруг дисков с антибиотиками на среде с диклофенаком (500 мг/л) в сравнении с диаметрами зон задержки роста вокруг таких же дисков с антибиотиками на среде, не содержащей диклофенак. Достоверность различий полученных результатов определяют с использованием парного t-критерия Стьюдента для зависимых совокупностей (12).

В сравнении с диаметрами зон задержки роста вокруг дисков с антибиотиками (левомицетином, цефтриаксоном, ципрофлоксацином, стрептомицином, фуразолидоном) на среде без диклофенака (500 мг/л), наблюдается достоверное увеличение диаметров зон задержки роста вокруг дисков с этими же антибиотиками в отношении всех изученных штаммов V. cholerae El Tor (18826, 19667, 19242, 19191) на среде, содержащей диклофенак (500 мг/л).

Пример 3.

Для сравнительной оценки эффективности антибактериальных препаратов, действующих самостоятельно, а так же совестно с диклофенаком, в опытах in vivo используют модель генерализованной формы холеры у беспородных белых мышей массой 18-20 г, которых заражают с помощью шприца внутрибрюшинно взвесью 18-часовой агаровой культуры (37°С) холерного вибриона в 0,3% агаризованном 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 108 м.к. в объеме 0,2 мл. Диклофенак и антибиотики вводят перорально каплями (0.05 мл), для этого таблетки растирают в ступке и смешивают с растительным маслом до требуемой концентрации. Препараты вводимые внутримышечно разводят физ. раствором до требуемой концентрации (см. таблицу 3).

Для исследования проводят три схемы лечения:

1) применяют диклофенак в дозе 0,25 мг/мышь/сут

2) антибиотик в расчетной дозе (см.таблицу 3).

3) -антибиотик плюс диклофенак (в тех же дозах).

Лечение антибактериальными препаратами и диклофенаком по отдельности либо одновременно антибактериальными препаратами и диклофенаком начинают сразу после заражения и проводят в течение 3-х дней, один раз в сутки, в дозах, рассчитанных по формуле J.E. Paget, J.M. Barnes (13), исходя из среднесуточных человекодоз:

где,

Дч(мг) - суточная доза для человека в мг;

Дм (мг/мышь) - суточная доза для мышей в мг/мышь;

50 - количество мышиных доз на 1 кг массы тела животного;

70 - масса тела человека;

Км - коэффициент для мышей (=3);

Кч - коэффициент для человека (=37).

Проводят не менее двух опытов при числе животных в группе не менее 10. Наблюдают за животными в течение 10 дней. Осуществляют бактериологический контроль заражения и эффективности лечения. Опыт учитывают по числу выживших животных, выраженному в процентах, при 100% гибели контрольных (нелеченых) животных. Для статистической обработки данных по сравнительному изучению эффективности антибактериальных препаратов использовали таблицы А.Я. Боярского (1955), вычисляя доверительный интервал I95 для р=0,05 для группы белых мышей не менее 20 для каждого препарата [14].

Из таблицы 3 видно, что при лечении животных только диклофенаком в дозе 0,25 мг/мышь/сут, либо только ципрофлоксацином - 2,0 мг/мышь/сут, или стрептомицином - 2,0 мг/мышь/сут, или цефтриаксоном 10,0 мг/мышь/сут, или фуразолидоном - 4,0 мг/мышь/сут, или левомицетином - 10,0 мг/мышь/сут, их выживаемость составила 50% и менее. При одновременном использовании таких же доз ципрофлоксацина, стрептомицина, цефтриаксона, фуразолидона, левомицетина и диклофенака, процент выживших белых мышей составил 80-100%, что свидетельствует о повышении эффективности антибактериальных препаратов при совместном действии с диклофенаком.

Использование предполагаемого изобретения позволяет при совместном действии антибиотика и диклофенака, повышать эффективность антибактериальных препаратов за счет повышения их чувствительности в отношении антибиотикорезистентных штаммов холерных вибрионов Эль Тор в опытах in vitro и in vivo.

Источники информации

1. Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения. МУК 3.4.2552-09.

2. Стандарт специализированной медицинской помощи детям при холере легкой степени тяжести. Приложение к приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. N 809н.

3. Стандарт специализированной медицинской помощи детям при холере средней степени тяжести. Приложение к приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. N 808н.

4. Стандарт специализированной медицинской помощи детям при холере тяжелой степени тяжести. Приложение к приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. N 810н.

5. Клинические рекомендации (протокол лечения) оказания медицинской помощи детям, больным холерой ФГБУ НИИДИ ФМБА России. Утверждено на заседании Профильной комиссии 9 октября 2015 г.

6. Клинический протокол диагностики и лечения. Холера. Одобрено Объединенной комиссией по качеству медицинских услуг Министерства здравоохранения и социального развития Республики Казахстан от «16» августа 2016 года. Протокол №9.

7. Friese S. Prophylaxin in gynaecological surgery: a prospective randomized comparision between single dose profilaxis with amoxicillin clavulanate and the combination of cefuroxime and metronidazole. // Antimicrob. Chemother. - 1989. - V.24, Suppl. В. - P. 213-6.

8. Патент RU на изобретение №2052198. Анисимова Т.И., Попова А.Е., Наумов А.В., Шведун Г.П., Майскова Т.С., Попов В.И., Никитина Г.А., Кривошеев В.А. Способ повышения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

9. Навашин С.М. и Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. Справочник., 4-е изд., перераб. и доп., М., Медицина, 2002, 496 с.

10. Riordan J.Т., Dupre J M., Cantore-Matyi S.A., Kumar-Singh A., Song Y., Zaman Sh., Horan S., Helal N.S., Nagarajan V., Elasri M.O., Wilkinson B.J., Gustafson J.E. Alterations in the transcriptome and antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus grown in the presence of diclofenac // Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2011; 10: 30.

11. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам МУК 4.2.2495-09. - М., 2009. - 59 с.

12. http://www.medstatistic.ru/calculators/calcpars.html

13. Paget J.E., Barnes Y.M. Toxicity tests // Evaluation of drug activities pharmacometric. - London, 1964. - Vol.1. - P. 135-167.

14. Боярский А.Я. Статистические методы в экспериментальных медицинских исследованиях. - М.: Медицина, 1955. - 262 с.

Похожие патенты RU2688165C1

название год авторы номер документа
Способ оценки чувствительности биоплёнок холерных вибрионов к антибактериальным препаратам 2015
  • Селянская Надежда Александровна
  • Веркина Людмила Михайловна
  • Титова Светлана Викторовна
RU2628098C2
СПОСОБ ОЦЕНКИ МЕСТНОГО ГУМОРАЛЬНОГО ПРОТИВОХОЛЕРНОГО ИММУНИТЕТА IN VITRO НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ 2013
  • Омельченко Наталья Дмитриевна
  • Иванова Инна Александровна
  • Телесманич Наталья Робертовна
  • Беспалова Ирина Александровна
  • Киселева Алла Константиновна
RU2536707C1
Способ подавления адгезивных свойств холерных вибрионов 2020
  • Селянская Надежда Александровна
  • Водопьянов Сергей Олегович
RU2763400C1
АВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ VIBRIO CHOLERAE НЕ-01 СЕРОГРУППЫ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА (ВАРИАНТЫ), ВАКЦИНА 1994
  • Капер Джеймс
  • Левин Майрон
RU2140981C1
"АНТИБАК" - ИНГИБИТОР РОСТА БОЛЕЗНЕТВОРНЫХ БАКТЕРИЙ 1996
  • Глубокий Геннадий Иванович
RU2120295C1
Способ профилактики холеры с использованием везикул для моделирования противохолерного иммунитета у экспериментальных животных 2022
  • Иванова Инна Александровна
  • Омельченко Наталья Дмитриевна
  • Дуванова Ольга Викторовна
  • Шипко Елена Сергеевна
  • Филиппенко Анна Владимировна
  • Труфанова Анастасия Александровна
RU2792160C1
АВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio cholerae KM 263 БИОВАРА ЭЛЬТОР СЕРОВАРА ИНАБА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО О1 АНТИГЕНА 2010
  • Ливанова Людмила Федоровна
  • Стрельникова-Ааб Екатерина Николаевна
  • Заднова Светлана Петровна
  • Смирнова Нина Ивановна
RU2425867C1
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus. musculus L - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К О-АНТИГЕНУ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 СЕРОГРУППЫ 2010
  • Алексеева Людмила Павловна
  • Евдокимова Вероника Вячеславовна
  • Фатеева Оксана Фёдоровна
RU2425874C1
АВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio cholerae КМ 262 БИОВАРА ЭЛЬТОР СЕРОВАРА ОГАВА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО О1 АНТИГЕНА 2010
  • Стрельникова-Ааб Екатерина Николаевна
  • Ливанова Людмила Федоровна
  • Горяев Артем Анатольевич
  • Заднова Светлана Петровна
  • Смирнова Нина Ивановна
RU2425868C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Francisella tularensis И Brucella spp 2009
  • Павлович Наталья Владимировна
  • Цимбалистова Марина Викторовна
  • Рыжко Инна Васильевна
RU2417376C2

Реферат патента 2019 года Способ повышения чувствительности холерных вибрионов к антибактериальным препаратам

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии, и предназначено для лабораторных или экспериментальных исследований при изучении антибиотикочувствительности холерных вибрионов. Для повышения чувствительности холерных вибрионов к антибактериальным препаратам используют средство, снижающее экспрессию генов к антибиотикорезитентности. В качестве экспрессирующего средства применяют диклофенак в количестве 500 мг/л. Использование изобретения позволяет повысить чувствительность холерных вибрионов к антибактериальным препаратам при их совместном применении с диклофенаком в отношении антибиотикорезистентных штаммов холерных вибрионов in vitro и vivo. 4 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 688 165 C1

1. Способ повышения чувствительности холерных вибрионов к антибактериальным препаратам, включающий использование средств снижающих экспрессию генов к антибиотикорезитентности, отличающийся тем, что в качестве экспрессирующего средства, применяют диклофенак в количестве 500 мг/л, при этом исследования осуществляют in vivo и in vitro, причем в последнем случае используют метод серийных разведений и диско-диффузионный метод, а затем проводят оценку результатов исследований, соответствующую проведенным методам.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при методе серийных разведений готовят два ряда чашек с питательной средой Мюллера-Хинтона с двукратными разведениями выбранного антибиотика, а именно левомицетина, стрептомицина, фуразолидона - 1-2-4-8-16-32-64-128-256-512 мг/л среды; цефтриаксона - 0,5-1-2-4 мг/л среды; ципрофлоксацина - 0,0001-0,00025-0,0005-0,001-0,0025-0,005-0,01-0,025-0,05-0,1-0,25-0,5-1-2-4 мг/л среды, при этом во второй ряд чашек дополнительно вводят диклофенак в концентрации 500 мг/л, затем на все чаши засевают 0,05 мл исследуемого штамма V.cholerae из предварительно подготовленной бактериальной взвеси, содержащей 106 м.кл по оптическому стандарту мутности в количестве 5 ед., в качестве контроля используют среду Мюллера-Хинтона без антибиотика и диклофенака, посевы инкубируют при 37°С в течение 16-18 часов, учет результатов проводят по величине минимальной подавляющей концентрации (МПК), которая полностью подавляет рост культуры V. cholerae при обязательном росте бактерий на контрольных чашках, уменьшение значений МПК в присутствии диклофенака, в сравнении со значениями МПК этих препаратов без воздействия диклофенака, свидетельствует о его способности повышать чувствительность V.cholerae к антибиотикам.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для диско-диффузионного метода готовят чашки с агаром Мюллера-Хинтона в два ряда, в один из которых добавляют 500 мг/л диклофенака, затем на поверхность агара засевают бактерии исследуемых штаммов V.cholerae из предварительно подготовленной суспензии, содержащей n×1O7 м.кл/мл посев производят в объеме 0,2-0,3 мл, равномерно распределяя шпателем, после впитывания суспензии в агар на его поверхность накладывают диски с отобранным антибиотиком, а на контрольные чашки с 500 мг/л диклофенака и без него диски не накладывают, посевы инкубируют в течение 16-18 часов при 37°С, оценку результатов проводят визуально по размеру зон подавления роста бактерий на среде, содержащей диклофенак или без него.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для проведения in vivo белых мышей массой 18-20 г. заражают внутрибрюшинно взвесью 18 часовой агаровой культуры 37°С холерного вибриона в 0,3% агаризованном 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 108 м.кл в объеме 0,2 мл, лечение антибактериальными препаратами и диклофенаком начинают сразу после заражения и проводят по отдельности либо одновременно в течение 3-х дней, дин раз в сутки, в дозах соответствующих среднесуточным человекодозам, а именно диклофенаком в дозе 0,25 мг/ мышь/ сут, ципрофлоксацином - 2,0 мг/ мышь/ сут, стрептомицином - 2,0 мг/ мышь/ сут, цефтриаксоном 10,0 мг/ мышь/ сут, фуразолидоном - 4,0 мг/ мышь/ сут, левомицетином - 10,0 мг/ мышь/ сут, наблюдают животных в течение 10 суток, результаты оценивают по числу выживших животных, выраженному в процентах.

5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что предварительную подготовку исследуемых штаммов проводят по следующей технологии: из 18 часовой агаровой культуры V. cholerae, выращенной на агаре Мартена при рН 7,6 готовят 1 млрд. взвесь по отраслевому стандарту мутности, для этого в стерильной бактериологической пробирке суспендируют культуру в 5 мл физиологического раствора.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2688165C1

RIORDAN JT et al
Alterations in the transcriptome and antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus grown in the presence of diclofenac
Ann Clin Microbiol Antimicrob., 2011, 21, 10:30
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ 2013
  • Мамонова Ирина Александровна
  • Бабушкина Ирина Владимировна
  • Гладкова Екатерина Вячеславовна
RU2529367C1
Способ снижения резистентности возбудителя туляремии к цефалоспоринам (варианты) 2016
  • Павлович Наталья Владимировна
  • Цимбалистова Марина Владимировна
RU2630645C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ in vitro ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ПСЕВДОАЛЛЕРГЕНАМ И ПОДБОРА ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 2014
  • Чаусова Светлана Витальевна
  • Гуревич Константин Георгиевич
  • Бондарева Галина Петровна
  • Усанова Елена Алексеевна
  • Филатов Олег Юрьевич
  • Малышев Игорь Юрьевич
RU2575567C2
PONGKORPSAKOL P et al
Inhibition of cAMP-activated intestinal chloride secretion by diclofenac: cellular mechanism and potential application in cholera
PLoS Negl Trop Dis., 2014, 4; 8(9), p.e3119.

RU 2 688 165 C1

Авторы

Селянская Надежда Александровна

Егиазарян Лиана Альбертовна

Даты

2019-05-20Публикация

2018-07-02Подача