СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНОЙ АКТИВНОСТИ СТРЕПТОМИЦИНА С ПОМОЩЬЮ СПОРОВО ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ШТАММА Bacillus anthracis Davies "R" БАЛ №31 Str В ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ, БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ И ЖИДКОСТЯХ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/00 

Способ определения остаточной активности стрептомицина с помощью спорово тест-культуры штамма Bacillus anthracis Davies "R" БАЛ №31 Str^D в питательных средах.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается определения остаточной активности антибиотиков в исследуемых объектах.

В России ежегодно регистрируется случаи заболевания людей и животных сибирской язвой [1].

Особую актуальность возбудителей сибирской язвы приобрел как агент биологического оружия, поскольку споры Bacillus anthracis обладают чрезвычайно высокой устойчивостью к воздействию различных факторов, а также имевшее место загрязнение спорами возбудителя сибирской язвы почтовых зданий и других помещений в США и последовавшая при этом гибель людей подтвердили высокую вероятность использования спор В.anthracis в качестве биологического оружия при проведении биотеррористических актов [2].

Ведущее место при экстренной профилактике и лечении сибирской язвы принадлежит антибиотикам широкого спектра действия, таким как стрептомицин или его сочетаниям с другими лекарственными средствами [3, 4].

Однако широкое применение антибиотиков (в том числе и стрептомицина) создает серьезные проблемы, в частности формирование лекарственно-устойчивых штаммов бактерий.

Появление в популяции В.anthracis клонов, устойчивых к антибиотику, представляет серьезную проблему в лечении и экстренной профилактики сибиреязвенной инфекции.

Комитет экспертов ВОЗ одобрил два определения устойчивости бактерий к лекарственным препаратам [5]. Первое из них ориентируется на потребление клиники. Микроорганизм признается устойчивым, если он может переносить действие препарата в концентрации, которая превышает возможный уровень его содержания в тканях организма. Второе определение имеет бактериологическую направленность. Микроорганизм признают устойчивым, если он переносит действие препаратов более высокой концентрации, чем другие штаммы микроорганизма того же вида.

В любом случае - врачам клиники, лечащим сибирскую язву любых форм, экспериментаторам, занимающимся определением чувствительности возбудителя к лекарственному препарату, либо производственнику антибиотиков необходимо знать истинную активность (концентрацию) препарата, которым он располагает. Тем более, если данный препарат хранился в непермессивных условиях.

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов, среди которых наиболее распространены: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или в питательной агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ряд ускоренных методов [6].

Определение чувствительности микробов к антибиотикам in vitro проводится в условиях, значительно отличающихся от тех, в которых препарат действует в организме.

Концентрация стрептомицина в сыворотке крови человека при внутримышечном введении терапевтических доз препарата составляет всего 5-10 мкг/мл [6]. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) стрептомицина для обычных чувствительных штаммов B.anthracis колеблется от 0,25-10 мкг/мл. [7].

Питательные среды для определения чувствительности микробов к антибиотикам должны отвечать следующим требованиям [6]:

1) быть стандартными и обеспечивать оптимальные условия роста микроорганизмов;

2) не содержать ингибиторов бактериального роста и чрезмерного количества стимуляторов;

3) не содержать веществ, подавляющих действие антибиотиков. Существенное влияние на результаты исследования оказывает pH среды. Например, активность стрептомицина значительно повышается с увеличением pH среды от 7,0 до 8,0. Большое воздействие на результаты исследования чувствительности B.anthracis к стрептомицину оказывают величина посевной дозы, возраст культуры бацилл, условия культивирования и др. факторы. При использовании метода диффузии в агар на результаты исследований влияют толщина слоя питательной среды, ее влажность, скорость диффузии антибиотика, скорость роста исследуемого (тестового) микроорганизма и др.

При определении концентрации антибиотика в биологических жидкостях и тканях используют также микробиологические методы исследования: метод диффузии в агар и метод серийных разведении антибиотика в жидкой или плотной питательных средах.

Метод диффузии в агаре. Метод основан на сравнении степени угнетения (или в стимуляции в случае Str^D) роста микробов определенными концентрациями антибиотика (стрептомицина) в испытуемом материале с угнетением (или стимуляции) его роста известными концентрациями стандартного антибиотика (стрептомицина). Подавление (или стимуляция) роста тест-микроба осуществляется за счет диффузии антибиотика из исследуемого материала в плотную питательную среду. Рабочими стандартами служат специально изготовленные очищенные образцы антибиотиков [8], активность которых устанавливают по международным стандартным препаратам. Они сохраняются в запаянных ампулах при соответствующей (пермессивной) температуре. На этикетках указано содержание единиц или микрограммов активного вещества в 1 мг препарата.

Антибактериальная (или бактериостимулирующая у Str^D тест-микроба) активность антибиотика (стрептомицина) выражается в единицах действия (ЕД), соответствующих действию определенной весовой части химически чистого препарата на тест-микроб. Для большинства антибиотиков (стрептомицин, канамицин, доксициклин и др.) 1 БД соответствует 1 мкг химически чистого препарата, а 1 мг такого препарата содержит 1000 ЕД.

Методом диффузии в агар можно определить концентрации любых антибиотиков (при наличии соответствующих тест-микробов), содержащихся в жидкостях (в крови, спинномозговой жидкости, моче, желчи, асцитической жидкости и тд.) и тканях организма (в легких, печени, почках, мозге, мышцах и т.д.).

Для определения концентрации антибиотика (стрептомицина) в сыворотке, кровь после образования сгустка центрифугируют, сыворотку отсасывают. Приготовленную сыворотку вносит в специальные лунки, изготовленные в агаровых пластинках, или цилиндрике без разведения (если предполагаемая концентрация антибиотика в крови не превышает контрольную), либо разводят нормальной сывороткой человека или буфером раствора (в случае определении активности стрептомицина используют фосфатный буфер с pH 7,5-8,0).

Для определения концентрации антибиотика (стрептомицина) в тканях органы, после удаления остатков крови взвешивают и гомогенизируют путем растирания с кварцевым песком или в специальном смесителе (дезинтеграторе). К гомогенату добавляют дистиллированную воду или соответствующий буфер. Полученную взвесь центрифугируют 30 мин при 2500-3000 об/мин. Концентрацию определяют в надосадочной жидкости.

Для получения воспроизводимых результатов необходима строгая стандартизация опытов. Скорость диффузии экстрактов в агар зависит от буфера, в котором готовят растворы стандартного антибиотика (стрептомицина) и испытуемого материала, температуры и времени инкубации. Поэтому при определении концентрации антибиотиков (стрептомицина) в испытуемых субстратах подбирают условия для культивирования тест-культуры в определенной питательной среде, оптимальную pH среды, буферные растворы, обеспечивающих максимальную диффузию раствора антибиотика в среду и четкость очертания зон. Схема определения активности стрептомицина состоит из нескольких этапов.

Подготовка чашек со средами и тест-микробом. Для определения концентрации антибиотика (стрептомицина) в биологических субстратах или активности стрептомицина во флаконе с нарушением сроков и др. параметров хранения препарата можно проводить на двухслойном («градиентные пластинки») или однослойной питательной среде, содержащей различные концентрации антибиотика.

Метод «градиентных пластинок» описан Szybalski [9] и Брауном [10].

Среду с градиентом стрептомицина готовят следующим образом: питательный агар на основе казеина (КГА) [11] выливают в наклоненную чашку Петри; как только агар застынет, чашку устанавливают горизонтально и поверх первого слоя наносят слой агара с антибиотиком (рис.1). В результате диффузии антибиотика в нижний слой агара его концентрация становится пропорциональной толщине слоя агара и, таким образом, устанавливается линейный градиент концентрации.

Целью настоящего изобретения является определение активности (концентрации) стрептомицина в питательной среде в биологических тканях и жидкостях с помощью тест-культуры Bacillus anthracis Davies "R" БАЛ №31 Str^D, депонированные нами в коллекционном центре ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» и ему присвоен номер В.anthracis KM104.

Для контроля точности и стандартности проведения исследований в каждом опыте необходимо использовать тест-культуры с известной чувствительностью (или зависимостью) к антибиотикам. ВОЗ рекомендует для этой цели три культуры Американской коллекции типовых культур: Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

Тест-культуры, применяемые в России при определении концентрации антибиотиков методом диффузии в агар, приведены в табл.20 [6].

Наиболее близким аналогом (прототипом) нашей тест-культуре B.anthracis Davies "R" БАЛ №31 Str^D для определения концентрации стрептомицина в различных средах является Bacillus cereus var.mycoides 537 (шероховатая форма); 20000000 спор на 1 мл среды [6].

Однако вид В.cereus хотя и считается сапрофитом, но недавно опубликованы материалы [12] о том, что В.cereus может вызвать смертельные случаи у людей.

Штамм B.anthracis Davies "S" выделен из костей трупа [13] в 1955 году, автором предполагалось использовать его в качестве вакцинного штамма, но в последствии выяснилось, что хотя штамм Davies S авирулентен, но протективным эффектом он не обладает, поскольку у него отсутствует плазмида токсинообразования pXO1, а содержит он только плазмиду pXO2, детерминирующую капсулообразование.

Нами элиминирована у B.anthracis Davies "S" плазмида pXO2 (капсулообразования) и способом [7] придано свойство стрептомицинзависимости, т.е. получен бесплазмидный (полностью авирулентный) стрептомицинзависимый (Str^D) в диссоциативный R форме штамм, пригодный для использования в качестве тест-культур при определении активности стрептомицина.

Предварительно из штамма B.anthracis KM104 необходимо получить варианты a, b, c с различными уровнями стрептомицинзависимости (Str^D).

Для этого штамм B.anthracis KM104 (в споровой форме) высеивают продольным штрихом на градиентную чашку со Str 25 мкг/мл от min к max (рис.2).

Через трое суток на конусной части выросшего штриха обозначают участки a, b, c от более широкого (а), среднего по ширине участка (b) и острого участка штриха (с) (см. рис.2).

Для определения уровня стрептомицинзависимости вариантов тест-культуры a, b и c бактериальную массу в споровой форме (т.е. 3-5 суточного роста) из участков a, b и c суспендируют в дистиллированной воде до концентрации ≈10⁷ спор/мл и высевают бактериологической петлей на питательные среды со стандартными концентрациями стрептомицина 10,5; 2,5; 1,25; 0,625 мкг/мл. Рост регистрируют через 24-48 часов инкубации при 35°С.

Пример №1.

Для определения уровня инактивации стрептомицина в питательной среде (КГА), хранящейся в течение 10 суток при комнатной (≈25°С) температуре, предварительно готовят: градиентные пластинки (чашки) (рис.3) со стрептомицин сульфата 50, 25, 10 мкг/мл, а также чашки с КГА однослойные, содержащие различные концентрации: 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 мкг/мл стандартного стрептомицина, - оставляют подготовленные питательные среды на 10 суток при комнатной температуре. Затем через 10 суток готовят еще партии питательных сред с такими же концентрациями стрептомицина. На каждую из питательных сред (свежеприготовленную и выдержанную в течение 10 суток) сеют штрихами 10-20·10⁶ спор тест-культуры B.anthracis KM 104 (вариантов a, b и с). Результат роста (через 24-48 ч культивирования при 35°С) сравнивают (см. табл.№1). Анализ результатов, приведенных в табл.№1, позволяют утверждать, что ≈50% активности стрептомицина в питательной среде, хранившейся при комнатной температуре в течение 10 суток, инактивировалось.

Пример №2.

Для определения уровня инактивации стрептомицина в препаратах «стрептомицин сульфат» различного срока хранения использовали:

1) «стрептомицин сульфат» - серии 8151083 годен до XI-86 г.

2) «стрептомицин сульфат» - серии 1280791 годен до VIII-94 г.

3) «стрептомицин сульфат» - серии 3032000 годен до IV-2003 г.

4) «стрептомицин сульфат» - серии 150905 годен до Х-2008 г.

Предварительно готовят: градиентные пластинки (чашки) со Str 50, 25, 10 мкг/мл, а также чашки с КГА однослойные, содержащие различные концентрации: 10, 5, 2,5, 1,25 и 0,625 мкг/мл каждой серии препарата «стрептомицин сульфат».

На каждую из питательных сред, содержащих различные расчетные концентрации стрептомицина, четырех серий препарата сеют штрихами ≈20000000 спор тест-культуры B.anthracis Davies "R" Str^D №31 БАЛ (вариатов a, b и с). Результаты роста (через 24-48 ч) культивирования при 35°С сравнивают (см. табл.№2) и делают соответствующие выводы.

Литература

1. Черкасский Б.Л. Закономерности территориального распространения и проявления активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999 - №2. - С.48-52.

2. Jnglesby Т., O. Toole Т., Henderson D., et al. Anthrax as a biological weapon, JAMA, 2002, - 287, - P.2236-2252.

3. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности: Санитарные правила. - М: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России. - 152 с. (С.42-43).

4. Проскурина В.А., Гребенкина Н.Б., Буравцева Н.П. и др. Сравнительная терапевтическая активность антибиотиков и химиопрепаратов при сибирской язве в эксперименте // Актуальные вопросы профилактики особо опасных инфекционных заболеваний: материалы науч.-практ. конф. 60 лет противочумной службы Кавказа. - Ставрополь, 1995. - С.218-220.

5. Соловьев В.Н. Стратегия современной химиотерапии бактериальных инфекций. - М: - «Медицина», 1973 - С.218-219.

6. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. // Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам. - М: «Медицина», 1982 - С.38-72.

7. Способ получения стрептомицинрезистентных вариантов возбудителей сибирской язвы из симбиотической смеси клеток Bacillus anthracis и скользящих бактерий - Myxococcus xanthus. Буланцев А.Л. (Ru), Липницкий А.В. (Ru). Патент №2233883., Бюл. №22, - 2004.

8. Государственная фармакопея СССР. М: «Медицина», изд. XI - 1987 - Т.1 - С.296-302.

9. Szybalski W., Bryson V. Developments in industrial microbiolog. // J. Bacteril. - 1952, - №64. - P.489.

10. Браун В. Генетика бактерий. - М: «Наука», 1968, - С.134-145.

11. Питательная среда для выращивания сибиреязвенных микробов. Александров Н.И., Николаенко Ю.П., Фатхинурова Т.И., Лазарева Е.С. Автор. свид. №400620, 1973, Бюл. №40.

12. Avashia S.B., W.S.Riggins et al. Fatal pneumonia among metalworkers due to inhalation exposure to Bacillus cereus containing B.anthracis taxin genes. Clin. Infect.Dis., 2007 - 44 (3) - P.414-416.

13. Davies D.Y., Harvey B.W.S. The isolation of Bacillus anthracis from bones. // Lancet, 1955 - Vol.269 - №2 - P.86-87.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Предварительно получают на градиентные пластинки Str 25 мкг/мл споры авирулентного бесплазмидного штамма в трех вариантах а, b, c с различным уровнем стрептомицинзависимости, а затем с помощью этих вариантов определяются степени зависимости этих трех вариантов в исследуемом объекте, содержащем остаточную активность стрептомицина. Настоящее изобретение позволяет определять активность (концентрацию) стрептомицина в питательной среде в биологических тканях и жидкостях. 3 ил.

Способ определения остаточной активности стрептомицина с помощью споровой тест-культуры штамма Bacillus anthracis KM 104 (Bacillus anthracis Davies "R" БАЛ №31 Str^D) в питательных средах, включающий посев спор (≈20000000 на мл. среды) на среды, содержащие различные расчетные концентрации антибиотика или его препарата, культивирование и последующее определение остаточной активности антибиотика, характеризующийся тем, что предварительно получают на градиентной пластинке Str 25 мкг/мл споры авирулентного бесплазмидного штамма Bacillus anthracis KM 104 в трех вариантах (а), (в), (с) с различным уровнем стрептомицинзависимости, для получения этих вариантов споры штамма В.anthracis KM 104 высевают одним длинным штрихом на градиентную чашку со Str 25 мкг/мл от минимальной (min) к максимальной (max) концентрации антибиотика, через 72 ч в конусной части выросшего штриха обозначают участки а, в и с от более широкого (а), среднего (в) и острого узкого участка (с), определяют уровни стрептомицин-зависимости вариантов а, в и с путем высева бактериальной массы соответствующего варианта бактериологической петлей на питательные среды со стандартными концентрациями стрептомицина 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 мкг/мл, рост вариантов а, в, с тестовой культуры учитывает через 24-48 ч культивирования в термостате при 35°С, об остаточной активности стрептомицина судят по отсутствию роста тест-культуры штамма на среде, содержащей стрептомицин в любой из приведенных концентраций.