СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕЛЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, фармакологии и может быть использовано для определения антимикробной активности гелей, содержащих в своем составе антибактериальные препараты, в отношении широкого спектра микроорганизмов.

Известен диско-диффузионный метод определения чувствительности бактерий к антибиотикам. На поверхность агара Мюллера-Хинтона наносят готовую взвесь тестируемых бактерий с оптической плотностью 0,5 по McF (1*10⁸ КОЕ/мл) и затем помещают диски, содержащие один антибактериальный препарат. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста (ЗПР) микроорганизмов вокруг диска. Результат учитывают через 18 часов по величине ЗПР в мм [1, 2].

Недостатками данного метода являются невозможность определения совместного действия двух и более антибактериальных веществ, содержащихся на одном диске, а также оценка действия геля, так как в настоящее время не зарегистрированы стандартные диски с различными по составу антимикробными гелями.

Наиболее распространенным является способ определения антимикробной активности гелей, при котором чашки с агаром Мюллера-Хинтона готовят таким образом, чтобы в толще агара были сформированы лунки ("колодцы"). Лунки формируют с помощью стерильных полых металлических цилиндров высотой 10 мм и диаметром 5 мм. Цилиндры из агара удаляют пинцетом, и остается лунка диаметром 5 мм. Готовят взвесь бактерий с оптической плотностью 0,5 по McF (1*10⁸ КОЕ/мл) и наносят ватным тампоном на поверхность агара. Дозатором в соответствующую лунку вносят 100 мкл исследуемого геля, оставляют на 10 минут и инкубируют при температуре 35°-37°С. Через 18-20 часов с помощью линейки измеряют диаметр зоны подавления роста (в мм). В случаях, если зоны подавления роста имеют овальную форму, то измеряют наибольший и наименьший диаметры зоны, вычисляют среднюю величину и принимают за показатель [3].

Недостатками данного метода являются его трудоемкость и точность соблюдения методики подготовки материалов, необходимость наличия в лаборатории металлических цилиндров, используемых для формирования лунок ("колодцев"), и их дополнительная стерилизация. Кроме того, необходимость формирования определенной толщины слоя агара в чашках Петри ограничивает применение этого метода в лабораториях с автоматическим разливом питательных сред и требует индивидуального подхода к каждой чашке.

Наиболее близким к заявленному способу является метод определения ингибирующей способности гелей диско-диффузионным методом. Исследуемую композицию геля лиофилизируют на дисках (диаметр 13 мм). Суспензию бактерий (30 мкл) дозатором вносят в чашки Петри, содержащие полутвердый агар Луриа-Бертани, равномерно распределяют по поверхности питательной среды. На поверхность бактериального газона вносят готовые диски с гелем и инкубируют 16 часов при 37°С. Антибактериальную активность приготовленных гелей оценивают путем измерения (в мм) ЗПР бактерий вокруг диска, насыщенного антимикробным агентом [4].

Недостатки известного способа: необходимость посева на полутвердый агар, что может искажать полученные результаты, особенно в случаях изучения активности в отношении облигатных аэробных микроорганизмов, которые при таком методе посева попадают в толщу питательной среды. Большой диаметр диска при высокой антимикробной активности гелей обеспечивает диффузию значительного количества действующего вещества и полное подавление видимого роста культуры, что ведет к невозможности учета полученных результатов. Также диаметр используемого диска не соответствует требованиям существующих нормативных документов по определению антибиотикочувствительности микроорганизмов.

Технический результат изобретения состоит в повышении точности определения антибактериальной активности гелей диско-диффузионным методом и возможности применения в рутинной практике бактериологической лаборатории определения активности антимикробных гелей.

Результат изобретения достигается за счет стандартизации нагрузки действующего вещества на бумажные диски диаметром 8 мм, соответствующим методическим указаниям и другим нормативным документам по оценке антибиотикочувстивительности бактерий, с последующей лиофилизацией и возможностью их хранения более 8 месяцев, применения плотных питательных сред и возможностью интерпретации результатов согласно нормативным документам (МУК 4.2.1892-04, EUCAST, CLSI) по оценке антибиотикочувствительности микроорганизмов.

Предлагаемый способ определения антимикробной активности гелей, содержащих антибактериальные компоненты, состоит из следующих этапов: 1. подготовка дисков, 2. выполнение исследования чувствительности бактерий к компонентам геля, 3. оценка и интерпретация результатов.

1. Подготовка дисков включает нанесение тестируемого геля на стандартные бумажные диски, соответствующих методическим указаниям и другим нормативным документам по оценке антибиотикочувстивительности бактерий.

В одном из вариантов на диск наносят 10 мкл исследуемого геля.

В одном из вариантов предварительно рассчитывают нагрузку геля на диск, исходя из требований нормативных документов (МУК 4.2.1892-04, EUCAST, CLSI) к конкретному микроорганизму и антибактериальному препарату.

Затем диски подвергают быстрой заморозке при температуре -80°С и лиофилизируют при отрицательном давлении с постепенным нагревом от -40°С до +40°С (нагревание на +20°С каждые 8 часов, общее время 40 часов, 5 этапов нагрева по 8 часов). Готовые диски хранят в холодильнике при температуре +2 - +4°С.

2. Выполнение исследования чувствительности бактерий к компонентам геля включает подготовку взвеси бактерий с мутностью 0,5 по шкале McF (1*10⁸ КОЕ/мл), далее ватным тампоном взвесь наносят на поверхность агара Мюллера-Хинтона в чашке Петри. На готовый бактериальный газон вносят диск с лиофилизированным препаратом. Чашки инкубируют при температуре 35°-37°С в течение 18-20 часов.

3. Оценка и интерпретация результатов включает измерение зоны подавления роста вокруг диска (в мм) при ее наличии.

В первом варианте, когда диск нагружали 10 мкл тестируемого геля без предварительного расчета нагрузочной дозы, результат считают положительным если диаметр зоны подавления роста составляет более 12 мм и расценивают как наличие антимикробной активности у тестируемого геля в отношении тестируемого микроорганизма.

Во втором варианте, когда на диск наносили гель в соответствии с предварительным расчетом нагрузочной дозы, интерпретацию полученных результатов выполняют в соответствии с требованиями нормативных документов (МУК 4.2.1892-04, EUCAST, CLSI) к конкретному антибиотику в составе тестируемого геля в отношении тестируемого микроорганизма. Если в составе геля присутствует два и более антимикробных компонента, то учет результатов выполняют по препарату с наибольшим значением диаметра зоны подавления роста в контрольной точке резистентности.

Приготовленные первым и вторым вариантом диски с препаратом хранят в условиях санитарного холода (+2° - +4°С). Лиофилизированные диски сохраняют свою первоначальную активность не менее 8 месяцев.

Это позволяет применять методики изучения чувствительности патогенов к гелям с антибактериальными компонентами в рутинной практике бактериологов и использовать данные гели для местного этиотропного лечения инфекционных заболеваний.

На фигурах изображено:

Фиг. 1. Зоны подавления роста, сформированные в течение 18 часов инкубации под действием геля с фосфомицином. Sa - Staphylococcus aureus АТСС 29213, MRSA - Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300.

Фиг. 2. Активность дисков с гелем в отношении MRSA через 8 месяцев хранения. MRSA - Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300.

Фиг. 3. Фотографии зон подавления роста бактерий вокруг дисков с гелем, содержащих амикацин (Р.а. - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, K.р. - Klebsiella pneumoniae ATCC 33495).

Фиг. 4. Зоны подавления роста, сформированные в течение 18 часов инкубации под действием геля с амикацином и диоксидином. Sa - Staphylococcus aureus ATCC 29213, MRSA - Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300.

Пример 1. Определение антимикробной активности геля с фосфомицином на основе поливинилпирролидона в отношении S. aureus и метициллин-резистентного S. aureus по первому варианту

Готовили взвесь бактерий Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) или Staphylococcus aureus ATCC 29213 и приводили к оптической плотности 0,5 по McF (1*10⁸ КОЕ/мл). Суспензию засевали на агар Мюллера-Хинтона. На поверхность бактериального газона вносили лиофилизированные диски с образцами геля в 3х повторах. Для этого предварительно готовили бумажный диск диаметром 6 мм и наносили 10 мкл исследуемого геля. Затем диск подвергали быстрой заморозке при температуре -80°С и лиофилизировали при отрицательном давлении с постепенным нагревом от -40°С до +40°С (нагревание на +20°С каждые 8 часов, общее время 40 часов, 5 этапов нагрева по 8 часов). Чашки инкубировали при температуре 37°С. Оценку антимикробного действия выполняли по наличию зоны подавления роста вокруг дисков с образцами через 18-20 часов.

На фиг. 1 представлена фотография зон подавления роста бактерий вокруг дисков с образцами геля, содержащего фосфомицин через 20 часов инкубации. Отчетливо видно, что гель оказывал выраженное антибактериальное действие в отношении S. aureus и MRSA.

Пример 2. Сохранение активности действующего вещества гелей, лиофилизированных на диске, в течение 8 месяцев

Изучена антимикробная активность геля с фосфомицином на основе поливинилпиролидона в отношении метициллин-резистентного Staphylococcus aureus через 6 месяцев хранения дисков.

Диски готовили как в примере 1 и хранили 8 месяцев в условиях санитарного холода (+2° - +4°С). Протокол дальнейшего исследования прописан в примере 1.

На фиг. 2 представлены зоны подавления роста MRSA вокруг дисков, с образцами геля, содержащего фосфомицин, хранившиеся в течение 6 месяцев.

Полученные результаты подтверждают возможность хранения дисков в течение длительного времени с сохранением их антимикробной активности.

Пример 3. Определение антимикробной активности геля с амикацином на основе поливинилпирролидона в отношении Klebsiella pneumoniae ATCC 33495 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 no второму варианту

Готовили взвесь бактерий K. pneumoniae и P. aeruginosa и приводили к оптической плотности 0,5 по McF (1*10⁸ КОЕ/мл). Суспензию засевали на агар Мюллера-Хинтона. На поверхность бактериального газона вносили лиофилизированные диски с образцами геля в 3х повторах. Диски готовили как в примере 1. Протокол дальнейшего исследования представлен в примере 1.

На фиг. 3 представлена фотография зон подавления роста K. pneumoniae и P. aeruginosa вокруг дисков с образцами геля, содержащего 30 мкг амикацина, через 20 часов инкубации.

Диаметр зоны подавления роста K. pneumoniae составил 22 мм, P. aeruginosa - 30 мм. Так как концентрация амикацина на диске соответствовала требованиям EUCAST 2020 года, то в дальнейшем была выполнена оценка антибиотикочувствительности данных штаммов к гелю с амикацином, которая показала, что данные культуры были чувствительны к действующему веществу геля.

Пример 4. Определение антимикробной активности геля с амикацином и диоксидином на основе поливинилпирролидона в отношении Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300 и Staphylococcus aureus ATCC 29213 по второму варианту

Готовили взвесь бактерий Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300 или Staphylococcus aureus ATCC 29213 и приводили к оптической плотности 0,5 по McF (1*10⁸ КОЕ/мл). Суспензию засевали на агар Мюллера-Хинтона. На поверхность бактериального газона вносили лиофилизированные диски с образцами геля в 3х повторах. Диски готовили как в примере 1. Протокол дальнейшего исследования представлен в примере 1.

На фиг. 4 представлена фотография зон подавления роста бактерий вокруг дисков с образцами геля, содержащего амикацин и диоксидин через 20 часов инкубации. Отчетливо видно, что гель оказывал выраженное антибактериальное действие в отношении S. aureus и MRSA.

Диаметр зоны подавления роста S. aureus - 25 мм, MRSA - 29 мм. В соответствии с требованиями EUCAST (2020) для золотистых стафилококков прописаны контрольные значения чувствительности/резистентности к амикацину - 18 мм, и, так как концентрация антибиотика на диске соответствовала требованиям нормативного документа, то полученные результаты были интерпретированы как наличие антимикробной активности тестируемого геля к изученным.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Решедько Г.К., Стецюк О.У. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. №4 (3), 2001. 348-354, МУК 4.2.1890-04.

2. Методические указания. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия 2004; 6(4): 306-359.

3. Государственная Фармакопея. - XI изд. - М.: Медицина, 1987. - Вып. 2. - 398 с.

4. Sa Y., Wang М., Deng Н., Wang Y., Jiang Т. Beneficial effects of biomimetic nano-sized hydroxyapatite/antibiotic gentamicin enriched chitosanglycerophosphate hydrogel on the performance of injectable polymethylmethacrylate. The Royal Society of Chemistry. 2015; 5: 91082-92. DOI: 10.1039/C5RA15915F.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, состоящий из последовательных этапов: 1. Исследуемый гель наносят на стандартный бумажный диск. 2. Диск с гелем подвергают быстрой заморозке и лиофилизируют. 3. Взвесь бактерий наносят на поверхность агара Мюллера-Хинтона. 4. На готовый бактериальный газон вносят диск с лиофилизированным препаратом. 5. Через 18-20 часов инкубации проводят оценку антимикробного действия в соответствии с нормативными документами, регламентирующими контрольные точки чувствительности/резистентности для конкретного антибиотика и микроорганизма (МУК 4.2.1892-04, EUCAST, CLSI). Изобретение позволяет повысить точность определения антибактериальной активности гелей и возможность применения в рутинной практике бактериологической лаборатории определения активности антимикробных гелей в конкретных клинических случаях. 4 пр., 4 ил.

Способ определения антимикробной активности гелей, содержащих антибактериальные компоненты, включающий следующие этапы: подготовку диска путем нанесения 10 мкл тестируемого геля на диски, диаметром 8 мм, с последующей быстрой заморозкой при температуре -80°С, лиофилизацией при отрицательном давлении с постепенным нагревом от -40°С до +40°С, при этом нагревают на +20°С каждые 8 часов, 5 этапов нагрева по 8 часов общее время 40 часов, далее хранят готовые диски при температуре +2 - +4°С, приготовление взвеси бактерий и приведение к оптической плотности 0,5 по McF (1*108 КОЕ/мл), засев суспензии на плотную питательную среду, внесение на поверхность бактериального газона лиофилизированных дисков с образцами геля, при этом наличие зоны подавления роста микроорганизма вокруг диска более 12 мм интерпретируют как наличие антимикробной активности у тестируемого геля в отношении тестируемого микроорганизма.