СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОНИХОМИКОЗА КИСТЕЙ И СТОП Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к разделу медицины, в частности к дерматологии, и может быть использовано как самостоятельный способ для диагностики онихомикоза кистей и стоп.

Совершенствование способов диагностики и контроля лечения дерматомикозов весьма актуально в связи с высокой частотой заболеваемости среди населения всех возрастных групп. Необходимость дифференциальной диагностики и идентификации грибковых поражений кожи и ногтей приобретает особую важность в связи с различиями схем лекарственного лечения при микозах различного генеза. В настоящее время применяются различные способы диагностики грибковых заболеваний кожи и ногтевых пластинок:

Характерная симптоматика онихомикозов во многих случаях дает возможность диагностировать заболевание по клиническим признакам. Однако во многих случаях симптомы болезни бывают слабо выражены, особенно в начальной стадии заболевания или после курса лечения.

В качестве уточняющего способа диагностики традиционно применяется микроскопия образцов ногтей или соскобов кожи, просветленных с помощью концентрированного раствора щелочи [Разнатовский К.И., Родионов А.Н., Котрехова Л.П. Дерматомикозы (руководство для врачей). СПб.: Изд. дом СПбМАПО, 2003, 159 стр.]. Способ позволяет быстро провести ориентировочную дифференциальную диагностику основных видов онихомикоза по морфологии нитей и спор. Однако микроскопия исследуемых образцов не всегда точна при малой интенсивности инфекции или глубоком поражении тканей.

«Золотым стандартом» в медицинской микологии является способ культивирования грибков - выращивание грибков из образцов клинического материала, который проводится в специальных микробиологических средах [В.М.Рукавишникова. Микозы стоп (2-е издание). М.: ЭликсКом, 2003, 332 с]. Учет результатов осуществляется по характерному виду колоний и микроскопии полученных чистых культур. Способ весьма точен и обеспечивает надежную идентификацию возбудителя грибкового заболевания. Однако его недостатками является большая длительность культивирования (до двух-трех недель) и в ряде случаев отсутствие роста грибка, особенно на фоне проводимого лечения больного [Родионов А.Н. Грибковые заболевания кожи. СПб.: Питер. - 1998, 288 с.].

В целом из обзора существующих способов диагностики следует, что ни один из применяющихся видов идентификации грибков не позволяет достаточно быстро и точно диагностировать онихомикоз кистей и стоп, в особенности вызываемого грибками рода Trichophyton.

В то же время сейчас развивается новое направление клинических исследований - ДНК-диагностика грибков, основанная на выявлении их минимальных количеств в исследуемом материале. В частности, полимеразная цепная реакция ДНК (ПЦР ДНК) зарекомендовала себя как быстрый, чувствительный и специфичный метод выявления вирусов и плохо культивируемых микроорганизмов (анаэробных микробов, грибков и др.).

ДНК-диагностика микозов стоп пока ограничивается главным образом кандидозами.

Геном грибков рода Trichophyton пока еще изучен недостаточно. Описанные в мировой литературе способы ДНК-диагностики и дифференциации этих микроорганизмов неприменимы в клинике, поскольку требуют трудоемкой процедуры выделения ДНК из кожи и ногтей, а также многоступенчатых процедур анализа нуклеотидных последовательностей ДНК [Faggi E., Pini G., Campisi E., Bertellini С., Difonzo E., Mancianti F. Application of PCR to distinguish common species of dermatophytes. J. Clin. Microbiol., 2001, v.39, N9, pp.3382-3385].

Кроме того, во многих случаях необходимо предварительно культивировать клинические пробы и изучать ДНК грибков в клинических изолятах из этих культур, что удлиняет и осложняет процесс диагностики.

В литературе описан способ диагностики онихомикоза кистей и стоп методом ПЦР, в котором использованы ДНК-зонды, последовательность которых была выбрана из множества случайных фрагментов геномной ДНК разных видов дерматофитов и была, по данным авторов, специфичной для Trichophyton rubrum. [Liu D., Pearce L., Lilley G., Coloe S., Baird R, Pedersen J. PCR identification of dermatophyte fungi Trichophyton rubrum, T. soudanense and T. gourvilii. J. Med. Microbiol., 2002, v.51, pp.117-122]. Предложенная последовательность ДНК-зондов была следующей:

Смысловой праймер: 5' GAA CAC AGC AGT GCA ТТС GA 3'

Антисмысловой праймер: 5' TAT GCA TCT GCA GCG GAA AG 3'

Однако при повторении данного способа в описанном режиме (Liu et al., 2002) он оказался неспецифичным, так как кроме Trichophyton rubrum также четко выявлял другие распространенные онихомикозы.

В связи с этим задачей предлагаемого изобретения является создание способа диагностики онихомикоза кистей и стоп, обладающего высокой специфичностью благодаря применению геноспецифических ДНК-зондов и пригодного для использования в клинической практике.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе диагностики онихомикоза кистей и стоп, вызванного грибком Trichophyton rubrum, путем идентификации грибка Trichophyton rubrum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК, выделенной из образца кожи или ногтевых пластинок, согласно изобретению для выделения ДНК образец инкубируют в 2-4 М растворе щелочи не менее 1 часа при температуре 50-65°С, нейтрализуют раствор 30%-ной соляной кислотой, переосаждают образец в 50%-ном растворе этанола при температуре минус 10 - минус 20°С и высушивают - при температуре 50-65°С; проводят ПЦР ДНК с применением высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum синтетических ДНК-зондов, имеющих последовательность:

TR-1-F (смысловой): 5' atcgaatctttgaacgcaca 3';

TR-1-R (антисмысловой): 5' tataaagattggggccaggg 3'

и при положительном результате диагностируют онихомикоз, вызванный грибком Trichophyton rubrum.

Учитывая вышесказанное, для целей клинической практики авторами разработан быстрый и практичный способ ПЦР-диагностики грибков рода Trichophyton rubrum. При этом предложена новая методика выделения ДНК из ногтевых пластинок и соскобов. Исследования показали, что ПЦР ДНК из чистых культур грибков с заявленными ДНК-зондами обеспечивает четкую специфическую амплификацию гена Trichophyton rubrum (длина продукта 230 п.о., треки 1-2), но не других наиболее распространенных грибков, вызывающих онихомикоз (трихофитию), в частности Tr.Mentagrophytes (треки 4-6) и Tr.Floccosum (треки 8-10), что отражено на фиг.2.

Таким образом, проведение ПЦР ДНК с применением ДНК-зондов, высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum, обеспечивает высокую специфичность предлагаемого способа, подтвержденную высокими уровнями корреляции с данными микроскопии на основании исследования 60 образцов, взятых у больных. Сопоставление результатов культуральной диагностики с предлагаемым способом показывает 100%-ную специфичность диагностики Trichophyton rubrum, т.е. все положительные по культуре образцы являются и ПЦР-позитивными (табл.).

ТаблицаСпособ диагностикиЧисло исследованийПоложительный результатОтрицательный результатКоэффициент корреляции двух методовКультуральный метод4525201,000Метод ПЦР ДНК по ИЗО452520

При этом длительность исследования составляет 1,5-2 дня по сравнению с 7-30 сутками при культивировании. Все вышесказанное позволяет рекомендовать предложенный способ диагностики онихомикоза кистей и стоп для внедрения в практику дерматологии и микологии.

Сущность способа иллюстрируется на фиг.1, 2, где:

На фиг.1 представлено выявление ДНК наиболее частых грибков, вызывающих онихомикоз с помощью ПЦР ДНК, выделенной из чистых культур по способу прототипа (Liu et al., 2001). Результаты электрофореза в 1,5%-ной агарозе по лункам: ДНК Trichophyton rubrum (треки 1-2); отрицательный контроль (трек 3), ДНК Trichophyton. mentagrophytes (треки 4-6), маркер молекулярной массы (трек 7), и ДНК Epidermophyton floccosum (треки 8-10).

На фиг.2 представлен пример видоспецифичной диагностики Trichophyton rubrum с помощью ПЦР ДНК, выделенной из чистых культур по заявленному способу. Результаты электрофореза в 1,5%-ной агарозе по лункам: ДНК Trichophyton rubrum (треки 1-2); отрицательный контроль (трек 3), ДНК Trichophyton.mentagrophytes (треки 4-6), маркер молекулярной массы (трек 7), и ДНК Epidermophyton floccosum (треки 8-10).

Способ осуществляют следующим образом.

Образец кожи или ногтевых пластинок инкубируют в 2-4 М растворе щелочи не менее 1 часа при температуре 50-65°С, нейтрализуют раствор 30%-ной соляной кислотой, переосаждают образец в 50%-ном растворе этанола при температуре -10-20°С и высушивают - при температуре 50-65°С; проводят ПЦР ДНК с применением синтетических ДНК-зондов, высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum.

Реакционная смесь для ПЦР включает в себя:

- 5-кратный буфер для ПЦР с альциановым синим и 5% глицерина 4 мкл

- смесь дезоксинуклеотидфосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ - по 25 ммоль каждого) - 3,2 мкл

- специфические ДНК-зонды (праймеры) -15 пмоль - 1 мкл на реакцию

- ДНК-Taq-полимераза - 1-2 ЕД на реакцию

- деиониэированная вода - до 20 мкл

Синтетические ДНК-зонды, используемые в реакции ПЦР, имеют следующую последовательность:

TR-1-F (смысловой): 5' atcgaatctttgaacgcaca 3';

TR-1-R (антисмысловой): 5' tataaagattggggccaggg 3'

Полимеразную цепную реакцию проводят в амплификационном блоке стандартной конструкции по следующей программе: 94°С, 5 мин; 40 циклов ПЦР, включающих: денатурацию: 94°С, 30 с; отжиг: 61°С, 30 с; элонгацию: 72°С, 30 с; дополнительная элонгация - 72°С, 7 мин.

Специфический продукт ПЦР определяют с помощью электрофореза в 1,5-2,5%-ном агарозном геле.

Сущность способа подтверждается клиническими примерами.

Пример 1. Больная М., 33 лет, обратилась на амбулаторное отделение клиники дерматовенерологии с жалобами на изменение ногтевых пластинок стоп. Больна 7 лет. Не обследовалась. В течение 2 лет самостоятельно применяла различные противогрибковые средства для наружного лечения без клинического эффекта. При осмотре ногтевые пластинки 1-х и 5-х пальцев стоп изменены по типу подногтевого гиперкератоза. Эритемато-сквамозные очаги кожи стоп. Клинический диагноз: Онихомикоз стоп, дистально-латеральная форма. Микоз стоп сквамозно-гиперкератотическая форма.

При микроскопии кожных чешуек стоп обнаружен мицелий гриба, при исследовании ногтевых пластинок - гриб не обнаружен. При посеве патологического материала рост гриба не выявлен.

Затем была проведена диагностика по предлагаемому способу. Для выделения ДНК образец инкубировали в 2 М растворе щелочи в течение 1 часа при температуре 50°С, нейтрализовали раствор 30%-ной соляной кислотой с дальнейшим переосаждением образца в 50%-ном растворе этанола при температуре -10°С и высушиванием при температуре 50°С; провели ПЦР ДНК с применением синтетических ДНК-зондов, высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum и при положительном результате диагностировали онихомикоз.

Больной была назначена терапия орунгалом по схеме пульс-терапии с положительным клиническим и микробиологическим результатом.

Контрольное микологическое исследование с использованием микроскопии, посева и ПЦР-диагностики не выявили возбудителя.

Пример 2. Больной Н., 62 лет, обратился в клинику с жалобами на изменение ногтевых пластинок кистей и стоп в течение 10 лет. Обращался в КВД по месту жительства. Рекомендована наружная терапий противогрибковым лаком и раствором. Лечился в течение 1 года без существенного клинического результата. На амбулаторном отделении клиники дерматовенерологии на основании клинико-лабораторных данных поставлен диагноз: Онихомикоз стоп, тотальная форма. При микроскопическом исследовании обнаружен мицелий гриба, при посеве и ПЦР-диагностике патологического материала верифицирован Trichophyton rubrum. Для выделения ДНК образец инкубировали в 3 М растворе щелочи в течение 1,5 часа при температуре 60°С, нейтрализовали раствор 30%-ной соляной кислотой с дальнейшим переосаждением образца в 50%-ном растворе этанола при температуре -15°С и высушиванием при температуре 60°С.

Проведена терапия итраконазолом на протяжении 3 месяцев. Получен хороший клинический результат. При контрольном микологическом исследовании гриб не обнаружен.

Пример 3. Больная Ш., 24 лет, обратилась на амбулаторное отделение клиники с жалобами на изменение цвета и формы ногтевой пластинки 1 пальца правой стопы. Заболевание началось 2 месяца назад на фоне травмы.

При осмотре ногтевая пластинка изменена по типу онихолизиса. При микроскопии обнаружены единичные короткие нити мицелия, при посеве, ПЦР-диагностике в патологическом материале определился Trichophyton rubrum. Для выделения ДНК образец инкубировали в 4 М растворе щелочи в течение 1 часа при температуре 65°С, нейтрализовали раствор 30%-ной соляной кислотой с дальнейшим переосаждением образца в 50%-ном растворе этанола при температуре -20°С и высушиванием при температуре 65°С.

Пациентка получила два курса терапии орунгалом с положительным клиническим результатом. При контрольном микологическом исследовании гриб не обнаружен.

Пример 4. Больной А., 35 лет, девять месяцев назад получал терапию по диагнозу онихомикоз стоп. Несмотря на проведенное лечение на ногтевых пластинках 1-х и 5-х пальцев стоп сохранялась деформация и участки подногтевого гиперкератоза. При контольном микологическом исследовании с использованием микроскопии и посева гриб не был обнаружен. При проведении ПЦР-диагностики верифицирован Trichophyton rubrum. Повторное антимикотическое лечение привело к положительному клиническому и микробиологическому результату.

Предлагаемый способ диагностики обладает высокой специфичностью по отношению к грибкам рода Trichophyton rubrum и имеет клиническое применение.

Изобретение относится к медицине, в частности к дерматологии. Сущность способа заключается в том, что грибок Trichophyton rubrum идентифицируют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК, выделенной из образца кожи или ногтевых пластинок, при этом для выделения ДНК образец инкубируют в 2-4 М растворе щелочи не менее 1 часа при температуре 50-65°С, нейтрализуют раствор 30%-ной соляной кислотой, переосаждают образец в 50%-ном растворе этанола при температуре минус 10 - минус 20°С и высушивают при температуре 50-65°С; проводят ПЦР ДНК с применением высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum синтетических ДНК-зондов имеющих последовательность:

TR-1-F (смысловой): 5' atcgaatctttgaacgcaca 3';

TR-1-R (антисмысловой): 5' tataaagattggggccaggg 3'

и при положительном результате диагностируют онихомикоз, вызванный грибком Trichophyton rubrum. Способ диагностики онихомикоза кистей и стоп обладает высокой специфичностью и пригоден для использования в клинической практике. 1 табл., 2 ил.

Способ диагностики онихомикоза кистей и стоп, вызванного грибком Trichophyton rubrum, путем идентификации грибка Trichophyton rubrum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК, выделенной из образца кожи или ногтевых пластинок, отличающийся тем, что для выделения ДНК образец инкубируют в 2-4 М растворе щелочи не менее 1 ч при температуре 50-65°С, нейтрализуют раствор 30%-ной соляной кислотой, переосаждают образец в 50%-ном растворе этанола при температуре минус 10 - минус 20°С и высушивают при температуре 50-65°С; проводят ПЦР ДНК с применением высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum синтетических ДНК-зондов, имеющих последовательность:

TR-1-F (смысловой): 5' atcgaatctttgaacgcaca 3';

TR-1-R (антисмысловой): 5' tataaagattggggccaggg 3'

и при положительном результате диагностируют онихомикоз, вызванный грибком Trichophyton rubrum.