СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ЦИАНОБАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК A23J3/20 A23J3/32 C12N1/12 C09B61/00 

Изобретение относится к пищевой, микробиологической промышленности, а именно к способам извлечения биологических препаратов из цианобактерий, и может быть использовано для обогащения пищевых продуктов и получения биологически активных веществ.

В настоящее время известны способы получения белковых препаратов, в том числе способ выделения фикоцианина из биомассы водорослей.

Известен способ, в котором выделение белковой фракции проводят, осаждая фикоцианин из водного экстракта биомассы под действием риванола. Данный способ не применим в пищевой промышленности, поскольку риванол не относится к числу веществ (пищевых добавок), которые можно использовать в составе пищевой продукции. (Minkova K.М., Tchernov A.A., Tchorbadjieva M.I., et al., Purification of C-phycocyanin from Spirulina (Arthrospira) fusiformis. // J. Biotechnol. - 2003. - V.102, N 1. - P.55-59.)

Известен способ, включающий выделение фикоцианина из сине-зеленой водоросли с использованием стадий хроматографии на гидроксиапатите и сефакриле HR-200. (Li В., Zhang X., Gao M., Chu X. Effects of CD59 on antitumoral activities of phycocyanin from Spirulina platensis // Biomed Pharmacother. - 2005. - V.59, N 10. - P.551-560.)

Указанный способ также трудно использовать при получении фикоцианина в крупных масштабах ввиду его низкой производительности.

Наиболее близким аналогом к заявленному способу является способ получения белкового препарата из цианобактерий, включающий одностадийную обработку цельного экстракта [микроводоросли] путем экстракции, преципитации сернокислым аммонием, за чем следует ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-сефарозой Cl-6В. Чистый фикоцианин был получен из Spirulina, Phormidium и Lyngbya с отношением D620/D280, характеризующим чистоту препарата; равным соответственно 4.42, 4.43 и 4.59 (Patel A, Mishra S, Pawar R, Ghosh PK. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. // Protein Expr. Purif. - 2005. - V.40, N 2. - P.248-255).

Способ охарактеризован авторами как «одностадийный», тогда как на самом деле имеется не менее 3 стадий (экстракция, преципитация сернокислым аммонием и хроматография на ДЭАЭ-сефарозе). Кроме того, в неявном виде проводятся еще не менее двух стадий диализа для удаления сернокислого аммония и других солей, применяемых при выделении. Поэтому «одностадийность» не может рассматриваться как преимущество метода.

Применяется метод колоночной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе, который позволяет получить препарат очень высокой чистоты (которая не требуется для целей пищевого использования фикоцианина). При этом данная стадия малопроизводительна, требует сложного специального оборудования (промышленные колонки, насосы, детекторы, градиентные смесители), что в итоге приводит к сильному удорожанию продукта.

Технической задачей заявленного изобретения является упрощение способа, снижение себестоимости готового продукта и получение белкового препарата с высокой степенью очистки, содержащего при этом фикоцианин и эссенциальные микроэлементы, и, кроме того, получение продукта как источника этих микроэлементов и (или) пищевого красителя, допускающее применение в промышленных масштабах и приводящее к получению очищенного препарата фикоцианина с содержанием основного вещества не менее 40% и величиной D620/D280 не менее 2,0.

Поставленная задача решается в способе получения белкового препарата из цианобактерий, включающем водную экстракцию, постадийную преципитацию сернокислым аммонием и обработку на диэтиламиноэтиловом активированном носителе, при этом в качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную эссенциальными микроэлементами, проводят постадийную преципитацию сернокислым аммонием в количестве от 20 до 70% от насыщения, по завершению каждой стадии проводят центрифугирование с отделением белкового осадка, обработку которого далее осуществляют на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии, с последующей обработкой на мембранной установке до содержания солей не более 5% и сушкой готового продукта до влажности не более 3%.

В качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную селеном, хромом и другими эссенциальными микроэлементами.

Кроме того, проводят не менее 4 стадий преципитаций и дополнительно перед обработкой на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии белковую фракцию обрабатывают буферным раствором до получения рН 4,0-4,2.

В настоящее время широкое распространение получает использование в питании человека различных продуктов, получаемых биотехнологическим путем. В их числе продукты на основе биомассы микроводорослей, таких как спирулина (Arthrospira spp.). Спирулина характеризуется высоким (более 60%) содержанием биологически полноценного белка, эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот (гамма-линоленовая кислота), микроэлементов (железо), витаминов. В результате выращивания спирулины в присутствии минеральных солей селена, йода, цинка, меди, марганца, хрома можно получить биомассы, дополнительно обогащенные этими микроэлементами в органически связанной, легко усваиваемой в организме и малотоксичной форме.

Использование спирулины в питании имеет определенные ограничения, связанные с ее органолептическими свойствами: специфическим вкусом и запахом продукта, наличием у некоторых людей его индивидуальной непереносимости. Предлагаемый способ позволяет получать белковые препараты, обладающие повышенной пищевой ценностью и улучшенными органолептическими и функциональными свойствами.

Белковый препарат, полученный заявленным способом, содержит достаточное количество такого компонента, как фикоцианин. Фикоцианин - белок, входящий в состав фотосинтезирующих пигментных комплексов спирулины - фикобилисом. В составе биомассы спирулины он представлен несколькими изоформами, включая аллофикоцианин и С-фикоцианин. Последний является преобладающим в количественном отношении. Его содержание может составлять по разным данным от 4 до 9% по массе сухих веществ спирулины. С-фикоцианин состоит из 2 типов субъединиц молекулярной массой 17-21 кД, организованных в нативном белке в гексамерный комплекс. Каждая субъединица содержит ковалентно связанный хромофор фикоцнанобилин, определяющий его биологическую активность. Структура фикоцианобилина приведена на фиг.1. Как видно из этой структуры, фикоцианобилин является веществом, родственным билирубину сыворотки крови, и, подобно ему, обладает свойствами гасителя свободных радикалов. Благодаря этому фикоцианин является активным пищевым антиоксидантом и демонстрирует комплекс физиологических эффектов, к числу которых относятся:

- индукция апоптоза опухолевых клеток и подавление их пролиферации;

- селективное ингибирование циклооксигеназы-2;

- подавление апоптоза, вызванного вирусной инфекцией;

- снижение концентрации фактора некроза опухоли в тканях,

- снижение содержания в воспаленных тканях медиаторов воспаления: гистамина, простагландинов, лейкотриенов;

- ингибирование окислительного стресса клетки за счет способности реагировать с разнообразными свободными радикалами, а также пероксинитритом;

- предотвращение перекисного окисления липидов, повреждения ДНК, разрушения клеточных мембран и гибели клетки.

Фикоцианин известен как пищевой краситель. Он обладает интенсивным максимумом поглощения в видимой области спектра при длине волны 620 нм, вследствие чего растворы фикоцианина достаточно высокой степени очистки имеют интенсивно синий («васильковый») цвет. Такой белковый препарат можно использовать, например, в напитках для цвета. Другие окрашенные компоненты спирулины, в том числе хлорофиллы, каротиноиды, ухудшают чистоту этого цвета, сдвигая его в сторону зеленого или желто-зеленого. Кроме того, использование препаратов фикоцианина с большим количеством балластных белков в качестве компонента жидких продуктов затруднено наличием значительного пенообразования. Вследствие этого для использования в качестве натурального пищевого красителя фикоцианин должен быть достаточно глубоко очищен. Показателем степени очистки является величина отношения оптических плотностей раствора при двух длинах волн D620/D280. В цельном водном экстракте биомассы этот показатель составляет величину порядка 0,3-0,4, что соответствует содержанию фикоцианина 6-8% от общего белка. В фикоцианине 100%-ной чистоты этот показатель составляет 4,98. Однако для использования в пищевой промышленности препарата фикоцианина его отношение D620/D280 должно быть не меньше 2 (что соответствует содержанию основного вещества 40%).

Способ осуществляют следующим образом.

Сухую биомассу спирулины, обогащенную эссенциальными микроэлементами, взвешивают и добавляют от 9 до 11 частей очищенной (дистиллированной или деионизованной) воды на 1 часть массы спирулины. Смесь перемешивают мешалкой в течение не менее 16 часов, после чего осаждают нерастворимый в воде остаток центрифугированием при ускорении не менее 3500 g. К надосадочной жидкости добавляют сернокислый аммоний в количестве от 20 до 30% от насыщения (от 140 до 210 г на 1 литр белкового раствора). Смесь выдерживают не менее 30 минут, после чего центрифугируют при ускорении не менее 3500 g до полного осаждения нерастворимой фракции. К надосадочной жидкости добавляют сернокислый аммоний до количества от 45 до 55% от насыщения (от 140 до 210 г на 1 литр надосадочной жидкости), после чего центрифугируют как указано выше. Осадок белков растворяют в минимально возможном количестве воды и переосаждают не менее 2 раз сернокислым аммонием в количестве от 45 до 70% от насыщения. Окончательный белковый осадок растворяют в минимальном количестве воды и удаляют соль путем обработки на мембранной установке (методом диализа или диафильтрации), обеспечивающей удаление не менее 98% солей. В растворе белков устанавливают величину рН от 4,0 до 4,2 путем добавления соответствующего буферного раствора. Смесь центрифугируют как указано выше, осадок белков растворяют в ацетатном буфере с рН 5,2 концентрацией не ниже 0,01 и не выше 0,06 М, содержащем не менее 0,01 и не более 0,05 М хлористого натрия, и добавляют ДЭАЭ-активированный носитель (целлюлоза или сефароза или сефадекс или их аналог) в количестве не менее 100 см³ на 1 г сухих веществ препарата). Жидкую фракцию удаляют на фильтре, носитель с адсорбированным фикоцианином промывают не менее 3 раз ацетатным буфером вышеуказанного состава, жидкость полностью удаляют на фильтре и добавляют равное (по объему носителя) количество ацетатного буфера рН 5,2, содержащего не менее 0,4 и не более 0,6 М хлористого натрия.

Жидкую фракцию отделяют на фильтре, промывают носитель не менее двух раз указанным буфером, фильтраты объединяют и добавляют к ним сернокислый аммоний в количестве от 45 до 70% от насыщения. Белки осаждают центрифугированием.

Осадок белков диспергируют в минимальном количестве воды и освобождают от солей путем обработки на мембранной установке, до содержания солей не более 5%. Окончательный раствор высушивают методом лиофильной сушки до содержания влаги в продукте не более 3% по массе. Сухой продукт представляет собой белковый продукт с содержанием фикоцианина 50-60%. Продукт готов для введения в любые пищевые продукты, как жидкие, так и любой другой консистенции.

Пример 1. Навеску 50 г сухой биомассы хромсодержащей спирулины помещают в стеклянный стакан объемом 1000 см³ и добавляют 500 см³ дистиллированной воды. Смесь помещают на магнитную мешалку и подвергают интенсивному перемешиванию в течение 16 часов. Смесь центрифугируют при ускорении 3900 g в течение 1 часа в центрифуге с охлаждением до +4°С. Осадок удаляют, а супернатант объемом 370 см³ охлаждают до 0°С в бане со льдом и к нему добавляют 123 см³ насыщенного при 0°С раствора сернокислого аммония (НСА), что составляет 25% доли насыщенного раствора сернокислого аммония. Далее смесь центрифугируют при ускорении 3900 g и температуре +4°С. Осадок (темно-зеленого цвета) удаляют. К супернатанту (сине-зеленого цвета) объемом 465 см³ добавляют 247 см³ НСА. Смесь центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант объемом 510 см³ - мутный, желто-зеленого цвета удаляют, а осадок интенсивно синего цвета диспергируют в минимально возможном количестве дистиллированной воды. После диспергирования осадка объем смеси составил 350 см³, его переносят в стакан объемом 1000 см³ и смешивают с равным объемом - 350 см³ НСА, что соответствует 50% доли насыщенного раствора сернокислого аммония.

Смесь центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант объемом 500 см³ лимонно-желтого цвета удаляют. С осадком (интенсивно синего цвета) процедура растворения в воде, осаждения НСА и центрифугирования повторяют еще 2 раза как описано выше. Последовательные супернатанты были соответственно бледно-желтым и бесцветным. Они были удалены. Окончательный осадок (после третьего переосаждения) диспергируют в воде с добавлением ЭДТА, его объем составил 330 см³. Этот раствор помещают в мешочки из целлофановой мембраны и подвергают диализу против дистиллированной воды в стеклянной банке (диализаторе) объемом 3000 см³ на магнитной мешалке в холодильнике при температуре +4°С. Диализат (бесцветный) удаляют, а ретентат (интенсивно синего цвета) центрифугируют 1 час при 3900 g и температуре +4°С. Незначительный осадок (черного цвета с зеленоватым оттенком) удаляют, супернатант, имеющий объем 385 см³, разливают порциями по 80-100 см³ в стеклянные банки объемом 500 см³, замораживают в морозильной камере при температуре -18°С и подвергают сублимационной вакуумной сушке при комнатной температуре. Масса продукта после высушивания 7,8 г.

150 см³ ДЭАЭ-сефарозы переносят на стеклянный фильтр диаметром 10 см и 5-кратно отмывают объемом 100 см³ ацетатного буфера 0,05 М рН 5,2, с 0,05 М хлористого натрия на колбе Бюхнера над вакуумом. Отмытую смолу переносят в стеклянный флакон на 500 см³. Навеску 1 г лиофильно высушенной белковой фракции биомассы спирулины, содержащей фикоцианин, растворяют в 100 см³ вышеуказанного буфера. Раствор вносят во флакон с ДЭАЭ-сефарозой и помещают на встряхиватель. Содержимое флакона далее переносят на стеклянный фильтр, и смолу дробно отмывают порциями по 150 см³ вышеуказанного буфера. Фильтрат - пенящаяся мутная жидкость желто-зеленого цвета - удаляется. На фильтре остается окрашенная фикоцианином смола интенсивно-синего цвета. Смолу, собранную с фильтра, переносят в стеклянный флакон на 500 см³ и добавляют 200 см³ ацетатного буфера 0,05 М рН 5,2 с 0,4 М хлористым натрием. Содержимое флакона далее переносят на стеклянный фильтр. Смола далее однократно промыта 200 см³ того же буфера и фильтраты объединены. Объем объединенного фильтрата - 380 см³. К полученному фильтрату добавляют 134,1 г безводного сернокислого аммония. Смесь осторожно перемешивают до полного растворения соли, после чего центрифугируют при ускорении 3900 g и температуре +4°С. Супернатант удаляют, а осадок диспергируют в минимальном объеме дистиллированной воды. Этот раствор помещают в мешочек из целлофановой мембраны и подвергают диализу в течение 24 часов против дистиллированной воды. Диализат (бесцветный) удаляют, ретентат (интенсивно синего цвета) подвергают сублимационной вакуумной сушке при комнатной температуре в темноте. Масса продукта после высушивания 0,160 г.

В результате осуществления способа получили белковый препарат с содержанием фикоцианина и хрома, пригодным для обогащения питьевого напитка.

Пищевая ценность, функциональные и органолептические показатели полученного препарата: характеризуется величиной D620/D280=2,18, что достаточно для его использования в качестве пищевого красителя, содержание фикоцианина 43% по массе продукта, содержание общего белка в препарате 90%, содержание золы 7% и влажность 3%, препарат представляет собой аморфный порошок темно-синего цвета, без вкуса и лишенный свойственного спирулине запаха, легко растворимый в воде с образованием раствора интенсивно синего цвета.

Достигнута очистка фикоцианина в 4,8 раза с выходом по пигменту (фикоцианобилину), равным 45% по отношению к цельному экстракту биомассы.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную селеном.

В результате осуществления способа получили белковый препарат с содержанием фикоцианина и селена, пригодного для обогащения пищевых продуктов, в том числе напитков.

Пищевая ценность, функциональные и органолептические свойства полученного препарата характеризуются величиной D620/D280=2,9, что достаточно для его использования в качестве пищевого красителя, содержание фикоцианина 58% по массе продукта, содержание общего белка в препарате 90%, содержание золы 7% и влажность 3%, препарат представляет собой аморфный порошок темно-синего цвета, без вкуса и лишенный свойственного спирулине запаха, легко растворим в воде с образованием раствора интенсивно синего цвета. Содержание селена в сухом продукте по данным определения микрофлуориметрическим методом составило 94±4 мкг/г.

Таким образом, суточная потребность взрослого человека в селене удовлетворяется 0,7 г сухого продукта.

Достигнута очистка фикоционина в 4,8 раза с выходом по пигменту (фикоцианобилину), равным 45% по отношению к цельному экстракту биомассы.

Пример 3. Навеску 50 г сухой биомассы хромсодержащей спирулины помещают в стеклянный стакан объемом 1000 см³ и добавляют 500 см³ дистиллированной воды. Смесь подвергают интенсивному перемешиванию в течение 16 часов при температуре +4°С в холодильнике. Смесь центрифугируют при ускорении 3900 g в течение 1 часа в центрифуге с охлаждением до +4°С. Осадок удаляют, супернатант объемом 370 см охлаждают до 0°С в бане со льдом и к нему добавляют 123 см³ насыщенного при 0°С раствора сернокислого аммония (НСА), что соответствует 25% доли насыщенного раствора сернокислого аммония. Далее смесь центрифугируют при ускорении 3900 g и температуре +4°С. Осадок (темно-зеленого цвета) удаляют. К супернатанту (сине-зеленого цвета) объемом 465 см³ добавляют 247 см³ НСА. Смесь центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант объемом 510 см³ - мутный, желто-зеленого цвета - удаляют, осадок интенсивно синего цвета диспергируют в минимально возможном количестве дистиллированной воды. После диспергирования осадка объем смеси составил 350 см³. Он перенесен в стакан объемом 1000 см³ и смешан с равным объемом - 350 см³ НСА, что составляет 50% доли насыщенного раствора сернокислого аммония. Смесь центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант объемом 500 см³ лимонно-желтого цвета удаляют. С осадком (интенсивно синего цвета) процедура растворения в воде, осаждения НСА и центрифугирования повторена еще 2 раза, как описано выше. Последовательные супернатанты были соответственно бледно-желтым и бесцветным. Они были удалены. Окончательный осадок (после третьего переосаждения) диспергирован в воде с добавлением ЭДТА, его объем составил 330 см³. Этот раствор помещен в мешочки из целлофановой мембраны и подвергнут диализу против дистиллированной воды в стеклянной банке (диализаторе) объемом 3000 см³ на магнитной мешалке в холодильнике при температуре +4°С. Диализат (бесцветный) удаляют, ретентат (интенсивно синего цвета) центрифугируют 1 час при 3900 g и температуре +4°С. Незначительный осадок (черного цвета с зеленоватым оттенком) удаляют, супернатант, имеющий объем 385 см, разливают порциями по 80-100 см³ в стеклянные банки объемом 500 см³, заморожен в морозильной камере при температуре -18°С и подвергнут сублимационной вакуумной сушке при комнатной температуре. Масса продукта после высушивания 7,8 г.

Навеску 1 г лиофильно высушенной белковой фракции биомассы спирулины, содержащей фикоцианин, растворяют в 90 см воды и добавляют при охлаждении в бане со льдом 10 см³ 1 М ацетатного буфера рН 4,0. Смесь выдерживают 30 минут, после чего центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант отбрасывают, осадок растворяют в 200 см³ 0,05 M ацетатного буфера рН 5,2 с 0,05 М хлористым натрием. В раствор добавляют (при комнатной температуре) 100 см³ ДЭАЭ-сефарозы (производства Pharmacia, Швеция), предварительно 5-кратно отмытой объемами по 100 см³ ацетатного буфера 0,05 М рН 5,2 с 0,05 М хлористого натрия. Смесь переносят во флакон на 500 см³ и помещают на встряхиватель. Содержимое флакона далее переносят на стеклянный фильтр, и смолу дробно отмывают порциями по 150 см³ вышеуказанного буфера. Фильтрат - жидкость бледно-зеленого цвета отброшен. На фильтре остается окрашенная фикоцианином смола интенсивно-синего цвета. Смолу собирают с фильтра, переносят в стеклянный флакон на 500 см³ и добавляют 200 см³ ацетатного буфера 0,05 М рН 5,2 с 0,4 М хлористым натрием. Содержимое флакона далее перенесено на стеклянный фильтр и фильтрат отделен на воронке Бюхнера над вакуумом. Смола далее двукратно промыта 100 см³ того же буфера и фильтраты объединены. Объем объединенного фильтрата - 400 см³. К полученному фильтрату добавлено при охлаждении в бане со льдом 141 г безводного сернокислого аммония. Смесь осторожно перемешивают до полного растворения соли и далее центрифугируют при ускорении 3900 g и температуре +4°С. Супернатант удаляют, осадок диспергируют в минимальном объеме дистиллированной воды. Этот раствор помещают в мешочек из целлофановой мембраны и подвергают диализу в течение 24 часов против дистиллированной воды. Диализат (бесцветный) отброшен, ретентат (интенсивно синего цвета) подвергнут сублимационной вакуумной сушке при комнатной температуре в темноте.

Полученный препарат фикоцианина из хромсодержащей спирулины пригоден для непосредственного использования в качестве пищевого красителя.

Пищевая ценность и функциональные свойства полученного препарата: характеризуется величиной D620/D280=2,9, что достаточно для его использования в качестве пищевого красителя, содержание фикоцианина 59% по массе продукта, содержание общего белка в препарате 90%, содержание золы 7% и влажность 3%, препарат представляет собой аморфный порошок темно-синего цвета, без вкуса и лишенный свойственного спирулине запаха, легко растворимый в воде с образованием раствора интенсивно синего цвета.

Достигнута очистка фикоцианина в 7,2 раза с выходом по пигменту (фикоцианобилину), равным 58% по отношению к цельному экстракту биомассы. Масса продукта после высушивания 0,150 г.

В результате очистки с использованием стадии сдвига рН удается повысить чистоту препарата фикоцианина с 43 до 59% и увеличить выход целевого продукта с 45 до 58%.

Таблица 1Стадии фракционирования белка из хромсодержащей спирулины№№ п/пСтадияОбъем см³Число оптических единиц на весь образецОтношение D₆₂₀/D₂₈₀Выход по D₂₈₀ %Выход по D₆₂₀ %Содержание фикоцианина г на весь образец ИФАВыход фикоцианина по данным ИФА в %Кратность очистки по отношению D₆₂₀/D₂₈₀D₂₈₀D₆₂₀1Экстракт биомассы, осветленный центрифугированием37041400170000,411001003,710012Супернатант после 1-го осаждения НСА46540900174000,43991024,571231,053Осадок после 2-го осаждения НСА35029700164000,5571963,68981,34Осадок после 1-го переосаждения НСА31027200163000,6065963,10841,465Осадок после 2-го переосаждения НСА26024500161000,6659942,9781,66Осадок после 3-го переосаждения НСА33021800155100,7253912,7731,767Ретентат после диализа38524700152000,6260892,23601,51

Таблица 2Результаты фракционирования содержащей фикоцианин белковой фракции из биомассы хромсодержащей спирулины методом объемной ("batch") хроматографии на анионообменной смоле ДЭАЭ-сефарозе.№№ п/пСтадияОбъем см³Число оптических единиц на весь образецОтношение D₆₂₀/D₂₈₀Выход по D₂₈₀ %Выход по D₆₂₀ %Кратность очистки по отношению D₆₂₀/D₂₈₀Содержание фикоцианина в образце %¹D₂₈₀D₆₂₀1Белковая фракция, полученная методом сульфатаммонийного фракционирования по примеру №1, лиофилизованная100209014400,69100100113,82Препарат, очищенный на ДЭАЭ-сефарозе253377372,1816513,1543,7¹ Рассчитано по данным работы Bhaskar S.U., в которой для очищенного фикоцианина получено отношение D₆₂₀/D₂₈₀, равное 4,98

Таблица 3Результаты фракционирования содержащей фикоцианин белковой фракции из биомассы хромсодержащей спирулины методом сдвига рН (в аналитических масштабах)№№ п/пСтадияОбъем см³Число оптических единиц на весь образецОтношение D₆₂₀/D₂₈₀Выход по D₂₈₀ %Выход по D₆₂₀ %Содержание фикоцианина в образце %¹Кратность очистки по отношению D₆₂₀/D₂₈₀D₂₈₀D₆₂₀1Белковая фракция, полученная методом сульфатаммонийного фракционирования по примеру №1, лиофилизованная2,13,252,00,6110010012,212Препарат, очищенный методом сдвига рН3,02,281,90,83709516,71,36¹ Рассчитано по данным работы Bhaskar S.U., в которой для очищенного фикоцианина получено отношение D₆₂₀/D₂₈₀, равное 4,98

Таблица 4Стадии фракционирования белка из селенсодержащей спирулины№№ п/пСтадияОбъем см³Число оптических единиц на весь образецОтношение D₆₂₀/D₂₈₀Выход по D₂₈₀ %Выход по D₆₂₀ %Содержание фикоцианина г на весь образец ИФАВыход фикоцианина по данным ИФА в %¹Кратность очистки по отношению D₆₂₀/D₂₈₀D₂₈₀D₆₂₀1Экстракт биомассы, осветленный центрифугированием39049400203000,411001001,8310012Супернатант после 1-го осаждения НСА50045000188000,4291921,861021,023Осадок после 2-го осаждения НСА33031300178000,5763881,54841,354Осадок после 1-го переосаждения НСА38028500179000,6357881,71931,535Осадок после 2-го переосаждения НСА36025600169000,6651831,51821,616Осадок после 3-го переосаждения НСА30031500201000,6463991,57851,567Ретентат после диализа33023400168000,724783--1,76

Таблица 5Результаты фракционирования содержащей фикоцианин белковой фракции из биомассы селенсодержащей спирулины методом объемной ("batch") хроматографии на анионообменной смоле ДЭАЭ-сефарозе№№ п/пСтадияОбъем см³Число оптических единиц на весь образецОтношение D₆₂₀/D₂₈₀Выход по D₂₈₀ %Выход по D₆₂₀ %Содержание фикоцианина в образце %¹Кратность очистки по отношению D₆₂₀/D₂₈₀D₂₈₀D₆₂₀1Белковая фракция, полученная методом сульфатаммонийного фракционирования по примеру №1, лиофилизованная80568040800,7210010014,412Препарат, очищенный на ДЭАЭ-сефарозе20049014402,938,63558,84,1¹ Рассчитано по данным работы Bhaskar S.U., в которой для очищенного фикоцианина получено отношение D₆₂₀/D₂₈₀, равное 4,98

Таблица 6Результаты повторного фракционирования содержащей фикоцианин белковой фракции из биомассы селенсодержащей спирулины методом объемной ("batch") хроматографии на анионообменной смоле ДЭАЭ-сефарозе№№ п/пСтадияОбъем см³Число оптических единиц на весь образецОтношение D₆₂₀/D₂₈₀Выход по D₂₈₀ %Выход по D₆₂₀ %Содержание фикоцианина в образце, %¹Кратность очистки по отношению D₆₂₀/D₂₈₀D₂₈₀D₆₂₀1Белковая фракция, полученная методом сульфатаммонийного фракционирования по примеру №1, лиофилизованная60426030600,7210010014,412Препарат, очищенный на ДЭАЭ-сефарозе23048313802,8611,34557,44,0¹ Рассчитано по данным работы Bhaskar S.U., в которой для очищенного фикоцианина получено отношение D₆₂₀/D₂₈₀, равное 4,98

Изобретение относится к пищевой, микробиологической промышленности, а именно к способам извлечения биологических препаратов из цианобактерий, и может быть использовано для обогащения пищевых продуктов и получения биологически активных веществ. Способ включает водную экстракцию, фракционную преципитацию сернокислым аммонием концентрацией от 20 до 70% от насыщения, по завершению каждой стадии проводят центрифугирование с отделением белкового осадка, обработку которого далее осуществляют на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии, с последующей обработкой на мембранной установке до содержания солей не более 5% и сушкой готового продукта до влажности не более 3%. В качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную селеном, хромом и другими эссенциальными микроэлементами. Изобретение позволяет упростить и снизить себестоимость готового продукта и получить белковый препарат с высокой степенью очистки, содержащий при этом фикоцианин и эссенциальные микроэлементы, получить продукт как источник этих микроэлементов и (или) пищевого красителя, допускающее применение в промышленных масштабах и приводящее к получению высокоочищенного препарата фикоцианина. 4 з.п. ф-лы, 6 табл., 2 ил.

1. Способ получения белкового препарата из цианобактерий, включающий водную экстракцию, преципитацию сернокислым аммонием и обработку на диэтиламиноэтиловом активированном носителе, отличающийся тем, что в качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную эссенциальными микроэлементами, проводят постадийную преципитацию сернокислым аммонием в количестве от 20 до 70% от насыщения, по завершению каждой стадии проводят центрифугирование с отделением белкового осадка, обработку которого осуществляют на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии, с последующей обработкой на мембранной установке до содержания солей не более 5% и сушкой готового продукта до влажности не более 3%.2. Способ получения белкового препарата из цианобактерий по п.1, отличающийся тем, что в качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную селеном.3. Способ получения белкового препарата из цианобактерий по п.1, отличающийся тем, что в качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную хромом.4. Способ получения белкового препарата из цианобактерий по п.1, отличающийся тем, что проводят не менее 4-х стадий преципитации.5. Способ получения белкового препарата из цианобактерий по п.1, отличающийся тем, что дополнительно перед обработкой на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии белковую фракцию обрабатывают буферным раствором до получения рН 4,0-4,2.