Способ получения CU,ZN-супероксиддисмутазы из животного сырья Советский патент 1988 года по МПК C12N9/02 

25

Изобретение относится к биотехнологии и касается выделения Cu,Zn-cy- пероксиддисмутазы (СОД) из печени, почек, легких, сердца и мозга круп- ,. ного рогатого скота.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта, упрощение и расширение функциональных возможностей Способа,10

Способ предусматривает проведение осаждения (удаления) нерастворимых частей гомогената при рН 5,7, так как при этих условиях наблюдает- ся оптимальное осаждение мутности 15 (прозрачность супернатанта J00%), По- вьццение предела рН приводит к частич- ному осаждению СОД (изоэлектрнческая точка которой равна ), и неполно- му осаждению мутности (50%), а при 20 понижении этого предела повышается риск денатурирования СОД, больше расходуется кислоты. Удаление мутности важно тем, чтобы уменьшить деградацию СОД этими веществами, которые представляют мембраны и др. (перекиси липидов мембран). При рН 5,5 или 6 вьтход СОД уменьшается примерно на 10-12%,

Количество добавляемого ацетона подобрано с таким расчетом, чтобы обеспечить полное и быстрое (в течение 20-30 мин) саморазделенне белко вой фракции от остальных частей раствора. Это количество ацетона оптималь-35 ное (в 20-кратно меньшем объеме).Добавление ацетона в больших количест- вах (в 10-кратно меньшем объеме) фактически не влияет на выход полученного препарата и приводит к излишне- 40 му расходу этого реактива. При уменьшении количества добавленного ацетона (например, в 30-кратно меньшем объеме) приводит к неполному и дли- , тельному разделению (в течение 3 ч) 45 белковой фракции,

Предложенным способом полученный препарат СОД электрофоретически гомогенный (элефтрофорез проводили на полиакриламидном геле, на ко- JQ тором была видна только одна полоса). Дополнительным подтверждением гомогенности препарата служит критерий чистоты (оптический индекс чистоты): отношение поглощения при 680 нм и 55 260 нм, 5. Полученный препарат СОД имеет оптические и ЭПР- спектры, мол.массу (32000 Да),иден- препаратам, полученным из дру5

.

0

5 0

5 0 5

Q 5

гих источников. Активность полученного препарата супероксиддисмутазы, определенная по нитротетраэолевому синему методу,составляет 3500-3800 ед/мг белка,

Полученнь1Й препарат имеет аналогичные формы спектров (свойства) имеющиеся у Си, Zn-СОД, полученный другими способами (имеет максимумы поглощения при 260, 680 нм на оптическом спектре и 140 Гс, 2,08 (фактор Ланде) по ЭПР-спект- рам. Таким образом, предложенным способом получается препарат Си, Zn-СОД с типичными физико-химическими свойствами и активностью.

Выделение СОД осуществляют следующим образом.

Ткань в количеств-е до 30 кг, гомо- ; генизируют в двухкратно большем объеме ацетона с помощью размельчителей ткани при 8000 об/мин в течение 2 мин, Собирают ацетоновый осадок центрифугированием при 3000 xg, 15 мин, его гомогенизируют в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4 (КФБ) и инкубируют по- смесь при 10°С в течение 2ч,, при интенсивном перемешивании.. Затем рН этого гомогената приводят к 5,7 (О,5 М моляной кислоты) и удаляют нерастворимые части центрифугированием в течение 20 мин при 6000 х X g. К полученному надосадочному раствору добавляют сульфат аммония до насыщения и затем ацетон (в 20- кратно меньшем объеме), смесь интенсивно перемешивают и оставляют в покое. Через 20-30 мин при происходит полное разделение белковой фракции от других компонентов смеси (белковая фракция в виде агрегата собирается на верхнем слое раствора и легко декантируется), При этом объем белковой фракции уменьшается в 10-12 раз (без потери белка), собирают белковый осадок центрифугиров- ванием 3000 xg, 20 мин, растворяют его в воде. Затем удаляют центрифугированием фракцию, осажденную при 50%-ном насьш1ении сульфатом аммония, и собирают СОД-содержащую фракцию при 90%-ном насыщении. После растворения этого осадка в воде ставят диализ против воды (на ночь). После диализа и удаления нераствори Ф1Х частей центрифугированием красно-зеленоватый супернатант пропускают через колонку с ДЭ-52 целлюлозой (размеры

3

20x6 см), уравновешенную 0,04 М КФБ рН 7,4. СОД элюирует 0,02 М КФБ и осаждают на колонке с ДЭАЭ А-50 се- фадексом (15х6см), уравновешенной этим же буфером. Далее эту колонку промывают 0,01 М буфером (1л) и СОД элюируют 0,2 М буфером. Затем плученный раствор СОД пропускают через сефадекс G-75 (120x4 см) и СОД (зеленого цвета) концентрируют на ДЭ-52 целлюлозе (10x3 см).

После такой обработки получают электрофоретически гомогенный пре

и сбор верхнего - белкового слоя,после центрифугирования при 3000 об/мин, 20 мин, осадок растворяют в воде.После центрифугирования (6000 об/мин, 30 мин) к полученному надосадочно- му раствору добавляют сульфат аммония до 90% насыщения и собирают осадок центрифугированием при 6000 об/мин и растворяют в воде и ставят диализ против воды.

5, После центрифугирования диализата при 6000 об/мин супернатант пропускают через колонку с ДЭ-52 целлю

Предлагается способ препаративного выделения из животных тканей (печень, почки, легкие, сердце,мозг) Си,гп-супероксвддисмутазы (СОД). Цель изобретения - повьшение выхода целевого продукта, универсальности способа. Изобретение заключается в том, что рН гомогената тканей, полученного смешиванием ацетонового порошка с 0,1 М калийфосфатным буфером, доводят до рН зтом нерастворимые части гомогената осаждают центрифугированием при, 6000 xg (20 мин) вместо до 20000 х g (40 мин). Затем проводят осаждение белка сульфатом аммония с добавлением ацетона (двадцатикратно меньшим объемом). В ре-, зультате этого происходит быстрое саморазделение белковой фракции с уменьшением объема в 10-12 pas. При этом белковый осадок собирают центрифугированием при 3000 X g (15.мин)вместо до 6000 X g (40 мин) в известном, Дапьг нейшая очистка белка включает обработку ион-обменной хроматографией и гель-фильтрацией. Способ дает возможность обрабатьшать в лабораторных условиях до 30 кг ткани с хорошим выходом (65-67%) получения фермента в сравнительно короткое время (в течение 3 дней) с использованием несложных оборудований и недорогостоящих - недифицитных реактивов. Причем использованные реактивы (ацетон, ион- обменники, сефадексы) регенерируют. (Л 4аь 9 СО 00

парат Си,гп-супероксиддисмутазы. Вре-15 лозой (20x6 см), уравновешенной фос- мя работ, затраченное на процедуру фатным буфером (рН 7-,4). выделения и очистки СОД составляет 6. СОД-фракцию (.зеленую) злюируют 3 дня.0,02 М буфером (рН 7,4). и пропускают

Способ позволяет обрабатывать тка- через ДЭАЭ А-50 сефадекс (15x6 см), ни фактически в неорганических коли- 20 СОД элюируют 0,2 М буфером, чествах (в лабораторных условиях до 30 кг ткани, при одном выделении) и получать высокоочищенный препарат СОД, удельная активность которой со25

ставляет 3800-4000 ед/мг белка за единицу активности принимается то количество белка в мг, которое способно ингибировать на 50% процесс образования формазана при восстановлении

нитросинего тетразоля супероксидными 303800, 3800, 3700,3500,

анионами,

ВьЕход чистого препарата СОД составляет в среднем 65-67% от исходного количества СОД в гомогенате. За одно вьщеление в расчете на J кг ткани предложенным способом можно получить из печени до 300 мг, почек - 200 мг, легких - 90 мг, сердца - 80 мг, мозга - 50 мг Си, Zn-СОД.

Пример. Схема выделения и очистки СОД из различных тканей жи- йотного происхождения.

рН 5,7 с добавлением 0,5 М НС1 и ценрифугирование при 6000 об/мин, 20 мин

через ДЭАЭ А-50 сефадекс (15x6 см), СОД элюируют 0,2 М буфером,

Формула изобретения

Способ получения Си, Zn-супероксид- дисмутазы из животного сырья, преду- сматривающий гомогенизацию сырья, в качестве которого используют печень, почки и мозг крупного рогатого скота, в ацетоне, получение надосадочного раствора из гомогената, диализ против воды белковой фракции с последующей очисткой ионообменной хроматографией на ДЭ-52, ДЭАЗ А-50 целлюлозе, гель-фильтрацией на сефадексах G-75, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, упрощения и расширения функциональных возможностей способа, в качестве исходного сырья дополнительно используют сердце и легкие крупного рогатого скота, величину рН гомогената доводят до 5,7 0,5 М соляной кислотой, нерастворимый осадок удаляют, осаждают белок из надосадочного раствора насыщением cyльфaтo аммония и добавлением ацетона в двад цатикратно меньшем объеме.