I12A2823
Изобретение относится к медицине , может быть использовано при диагостике заболеваний желудочно-кишечого T.pakTa.
Цель изобретения - повьппение точости за счет использования в качестсоге
43 с уч са яс 19 ин но дя ЖИ си ал ни ей но ки ор вы ци ло ло че че не ли лу тр на ам жи тр ам
ве маркера и субстрата белка, меченного
ISI
J.
Способ осуществляется следующим образом,
Больному натощак дают выпить 10 мл 0,01%-ного водного раствора человеческого сывороточного альбумина, меченного изотопом J общей радиоактивностью 1,510 срм (имп, в.минуту). С помощью зонда отбирают пробы дуоденального содержшчого через 30, 60, 90 и 120 мин после введения белка. Определяют их радиоак- тивност. После этого центрифугируют. Полученный супернатант подвергают колоночной хроматографии на сефарозе, конъю-гированной с моноспецифическими антителами против введенного белка. Затем колонку от- мьюают 0,1 N фосфатным буфером рН 7,4-7,5, элюирутот связавшиеся с антителами меченые антигены 0,1 М глицин-НСЕ буфером рН 2,8-3,,О, подсчитывают их радиоакткЕ.ность, соотносят ее с радиоактивностью материала, нанесенного на колонку, и выражают количество нерасщепленного белка, сохранившего антигенную, специфичность, в процентах
Для получения моноспецифических антител к данному антигену человеческого сывороточного альбумина (Reanal, ВНР) готовят антисыворотку путем подкожной иммунизации кроликов с неполным адьювантом Фрейнда (Dif- со, США). Моноспецифические антитела к человеческому сывороточному альбумину вьщеляют на соответствующе иммуносорбенте (ЧСА, иммобилизован- ньш на BrCN - активированной сефарозе 4В, Pharmacia, Швеция). Затем антитела адсорбируют на протеин-А се- фароэе (Pharmacia, Швеция) следующим образом; на колонку с протеин-А се- фарозой (объ ем геля- 1,0 мл) наносят 0,7 мл 1%-ного раствора антител в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4, после чего пров одят элюцию 10 мл этого же буфера до полного удаления антител, не связавшихся с протеин-А сефарозой Удельная емкость полученного иммуно
)
5
0
5
0
.
5
40
50
55
сорбента составляет 5 мг ЧСА на 1 мл геля.
Пример 1. Больная Л-а Л.Е. 43 года, госпитализирована в связи с приступообразными болями в разных участках живота, склонностью к поносам, общей слабостью. Из анамнеза выяснено, что считает себя больной с 1969 г, после перенесенной пищевой интоксикации. Периодически отмечает ноющие боли по всему животу, перехо- . дящие по временам в сваткообразные, ЖИДКИ стул 3-5 раз в день, прогрес- сируюпдую потерю в весе. Дифференциальный диагноз проводился между хроническим энтороколитом и дискинези- ей тонкого кишечника по гипермоторному .типу. При пассаже по тонкой кишке рентгенологических признаков органического поражения кишечника не выявлено,, При холецистографии - функционирующий желчный пузырь. Копро- логическое исследование: мьш1ечные волокна, переваренные в умеренном количестве , крахмал - значительное количество , жирные кислоты - немного, нейтрешьный жир - незначительное ко- личество,. Активность ферментов .поджелудочной железы в сыворотке крови: трипсина 4,6 Кед, ингибитора трипси- на 466 Ме,д-липазы 27,7 ммоль/мл, амилазы 315 ед. В дуоденальном содержимом: .трипсина 346 Мед, ингибитора трипсина 56 Мед, липазы 473 ммоль/мл, амилазы 782 ед.
Таким образом, применяемые в кли- н:ических условиях диагностические методы, характеризующие функциональное состо Яние кишечника, не давали указаний на органическое поражение тонкой кишки. Для уточнения диагнос-, тики с помощью выявления нарушг.ний протеолитической активности желудочно-кишечного тракта применен предлагаемый способ.
Для получе.ния химуса из проксимальных отделов тощей кишки используют 4-канальный зонд с латексным баллоном, расположенным дистальнее эспирационного отверстия. Зонд вводится больному натощак под рентгенологическим контролем с таким расче- том, чтобы окклюзия кишки путем наполнения баллона.воздухом производилась на уровне 20-25 см ниже трейце- вой связки. Как правило, для полного перекрытия кишки достаточно 20 мл воздуха, вводимогб в баллон с
помощью шприца. Надежность окклюзии контролируется путем аспирации содер жнмого кишки ниже баллона. После установления зонда на нужном уровне и раздувания баллонй больному натощак перорально вводят человеческий .сывороточньй альбумин, меченный , в количестве 10 мд О,01%-ного водного раствора. Пробы кишечного содержимого получают через 30, 60, 90 и 120 мин после введения препарата.
Для определения человеческого сывороточного альбумина, сохранив- шего специфичность в дуоденальном содержимом, применяют метод иммуно- сорбции на колонках. В качестве им- муносорбента используют протеин-А-4В сефарозу с иммобилизованными на ней антителами против человеческого сывороточного альбумина (см. методику получения иммуносорбентов). Перед нанесением образцов кишечного химуса на иммуносорбент в пробах, получен - ных через 30, 60, 90 и 120 мин, опре деляют радиоактивность на к лодезНОМ гамма-счетчике NZ-138 .GAMMA (Венгрия). Затем пробы объединяют, отбирают 10-15 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин.« После этого 1,0 мл супернатанта наносят на колонку с иммуносорбентом (объем геля - 0,5 мл, удельная емкость 5 мг ЧСА на Т мл геля). Колонку отмьгоают 20 мл 0,1 N фосфатного буфера рН 7,4-7,5, а затем элюиру- ют: связавшиеся с антителами меченые антигены 5 мл 0,1М глицин- НС буфером рН 3,0. Радиоактивность элюантов определяют аналогично описанному.
В химусе, полученном из проксимальных отделов тонкой кишки больной Л-ой Л.Е., обнаружено до 82% человеческого сывороточного альбумина с антигенной активностью исходного белка. При этом рН желудочного содержимого 7,8, протеолитическая активность желудочного сока 7,2 ед. Отсутствие у больной изменений ферментативной активности поджелудочной железы позволяет считать, что нарушение протеолиза обусловлено органическим поражением тонкой кишки и служит подтверждением диагноза хронического энтерита.
Пример 2. Больная А-А Л.П. 41 год, поступила в клинику в связи с пищевой аллергией, проявляющейся
28234
рецидивирующей крапивницей, отеками Квинке.
Учитывая полиморфизм этиопатогене- тических механизмов пищевой аллергии, требовалось уточнить их характер. В первую очередь было необходимо оценить ферментативную активность желудочно-кишечного тракта. Наличие у больной ожирения П степени как
будто бы исключало возможность ферментативной недостаточности. Действительно, при исследовании функции поджелудочной железы не выявлялось патологических сдвигов. Активность фер- .
ментов поджелудочной железы в сыворотке крови бьша представлена следую-: щими показателями: трипсина 3,8 Мед, ингибитора трипсина 484 Мед, липазы 15 ммоль/мл, амилазы 280 ед в дуоденальном содержимом: трипсина -1
392 Мед, ингибитора трипсина 484 Мед, липазы 15 ммоль/млр амилазы 902 ед..
По методике 1 проведено количественное определение степени
гидролиза белка,
В полученных образцах дуоденального содержимого больной А-вЬй Л,П. было выявлено до 35% белка с исходной антигенной активностью. Обнаружение столь значительного количества антигенного материала в просвете тонкой кишки рассматривается как одна из причин развития пищевой аллергии и позволяет провести целенаправленную коррекцию выявленных нарушений
пищеварения с помощью медикаментозных средств -(ферментных препаратов)Пример 3. Больной 3-р Ф.М., 36 лет, поступил с жалобами на приступообразные интенсивные опоясывающие боли в верхней половине живота, сопровождающиеся рвотой, расстройством стула (плохо оформленный стул 1-2 раза в день). Из анамнеза выяснено, что с 1980 г. у больного наблюдаются приступы абдоминальных болей описанного характера. При обследовании обнаружено резкое повышение секреторной функции желудка, при рентгеноскопии желудка - выраженная де- ,формация луковицы 12-перстной кишки (что позволило констатировать наличие язвенной болезни), при холецистогра- фии - камни желчного пузыря. При неоднократном исследовании панкреатических ферментов определялось повышение их концентрации в крови и моче. Сканирование Se-75 селенметионином
показало неравномерное снижение фиксации изотопа в поджелудочной железе
Несмотря на констатируемую у больного нормальную активность ферментов поджелудочной железы в сыворотке крови, их нормальную концентрацию в дуоденальных образцах и наличие избыточной массы тела удалось выявить патологическое отклонение -в гидролизе белка пищеварительного тракта (количество нерасщепленного ЧСА в дуоденальном содержимом 17%). Приведенные результаты обследования позволили установить диагноз калькулезного холецистита с реактивным панкреатитом, язвенной болезни 12-перстной кишки в фазе ремиссии. Из сопутствующих заболеваний у боль- ного имелось ожирение II-III степени обменно-элиментарной фдрмы.
Как следует из приведенных примеров, исследования показателей протео литической активности желудочно-кишечного тракта (активность пепсина, трипс ина, ингибитора трипсина, рН желудочного сока и др.) дают представление о нарушениях лишь в отдельных звеньях цепи переваривания белка Предлагаемый способ является принци- пиально новым, поскольку дае,т интегральную оценку зффективности протеи наз в желудке и тонком кишечнике, основанную на анализе продуктов пере
варивания белка.
Результаты исследования с помощью предлагаемого метода больных с различной патологией желудочно-кишечного трактэд пищевой аллергией и здо- ровьпс лиц представлены в таблице,
Количество нерасщепленного J-ЧСА, сохранившего антигенную специфичность, %
Здоровые лица
Пищевая аллергия без поражения желудочно-кишечноготракта
ГТродолжение таблицы.
Пищевая аллергия с сопутствующими заболеваниями желудочно-кишечноготракта
Хронический гастрит с секреторной недостаточностью
Хронический панкреатит
Хронический энтерит
25-35
4-7
17 82
Проведенные исследования в клинических условиях продемонстрировали простоту предлагаемого метода, его доступность и относительную безопас ность, поскольку общая радиоактивность вводимого белка не превьш1ает количеств, допустимых санитарными нормами для клинических условий.
Наиболее .сложным в предлагаемом методе является иммунологический анализ полученного материала. Однако достаточно высокая оснащенность современных клиник и диагностических ла-- бораторий делает его, тем не менее, вполне доступным для практического здравоохранения.
40 Формулаизобрр. тения
Способ дифференциальной диагностики первичной пищевой аллергии от вторичной путем клинического исследования больного, о тлич.ающий- с я тем, что, с целью повышения точности способа, больному вводят человеческий сывороточный альбумин, ме- ченньй , через 110-120 мин после введения альбумина производят забор содержимого из проксимального отдела тонкого кишечника и определяют в нем содержание экзогенного альбумина, сохранившего антигенные детерминанты, и при значении полученного показателя 1-2% от количества введенного белка диагностируют первичную пищевую аллергию.
Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повьшение точности способа за счет и спользо- вания в качестве маркера субстрата белка меченного J. Больному дают 10 мл 0,01%-ного водного раствора сывороточного альбумина, меченного изотопом . Через 110-120 Мин берут пробы дуоденального содержимого. Пробы центрифугируют. Полученный су- пернатант подвергают колоночной хроматографии на сефарозе, конъюгиро- банной с моноспецифическими антителами против введенного белка. Затем колонку отмывают фосфатным буфером. Элюируют связавшиеся с антителами меченые антигены 0,1 М глицин-HCl буфером. Подсчитывают их радиоактивность, соотносят ее с радиоактивностью материала, нанесенного на колонку. Выражают в процентик количество нерасщепленного белка, сохранившего антигенную специфичность. При значении полученного показателя 1-2% от количества введенного белка диагностируют первичную пищевую аллергию, 1 табл. (Л ISD 4аь Nd 00 to 00
