ФОТОБИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ ВОДОРОДА, СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ФОТОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРОДА Российский патент 2008 года по МПК C12N9/00 C12N11/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к фотобиокатализатору на основе фермента гидрогеназы, иммобилизованной на наноструктурированной мезопористой пленке диоксида титана (TiO₂) - фотоактивного полупроводника, и может быть использовано в энзиматических процессах получения водорода под действием света.

Водород является экологически чистым источником энергии. Разработка новых технологий получения водорода из воды имеет важнейшее значение.

Гидрогеназа - фермент, катализирующий реакцию:

2Н⁺+2е^-↔Н₂.

Сложной проблемой является нестабильность изолированного фермента и ингибирование его активности кислородом. Повышение стабильности гидрогеназы, как и других ферментов, достигается иммобилизацией ферментов на различных носителях, при этом значительно повышается также технологичность их применения.

Известно большое количество иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов, включенных в полимерную матрицу различных гелей (RU 2233327, C12N 11/04, C12N 11/18, 27.07.2004; RU 2261911, C12N 11/02, C12S 9/00, C12S 13/00, 10.10.2005; RU 2210596, C12P 35/00, C12P 35/04, C07D 501/06, 20.08.2003) или адсорбированных на поверхности твердых пористых неорганических носителей: углеродных (RU 2279475, C12N 11/14, C12N 9/26, C12P 19/02, 10.07.2006; RU 2224020, C12N 11/14, C12N 9/26, C12P 19/02, 20.02.2004; RU 2167197, C12N 11/14, C12P 19/02, 20.05.2001) или минеральных (RU 2007456, C12N 11/14, A23K 1/165, 15.02.1994; RU 1473358, C12N 11/00, C12N 11/14, 20.02.2000).

Известные иммобилизованные биокатализаторы решают проблему повышения стабильности и технологичности применения использованных в них ферментов, но они не позволяют осуществлять фотохимические процессы.

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются биокатализатор на основе фермента глюкоамилазы, иммобилизованной на твердом гранулированном углеродном носителе, приготовленном из технической сажи и имеющем мезопористую структуру со средним диаметром пор 300-400 Å (30-40 нм) и объемом пор 0,7-0,9 см³/г, и способ его приготовления путем адсорбции глюкоамилазы на поверхности указанного мезопористого углеродного носителя при температуре 20°С в течение 18 часов в среде 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,6) и последующей промывки буферным раствором (RU 2281328, C12N 11/14, C12N 9/26, С12Р 19/02, 10.08.2006 - прототип). Величина адсорбции глюкоамилазы составляет 8-13 мг белка на 1 г адсорбента.

Биокатализатор-прототип отличается более высокой активностью и стабильностью по сравнению с другими биокатализаторами на основе иммобилизованной глюкоамилазы, но не позволяет осуществлять фотохимические процессы. Способ приготовления биокатализатора, выбранный за прототип, не позволяет получать фотобиокатализаторы.

Задачей изобретения является создание фотобиокатализатора, способного с высокой скоростью продуцировать водород под действием света, на основе гидрогеназы, иммобилизованной на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂, а также разработка способа его приготовления, позволяющего получать высокоактивный и стабильный фотобиокатализатор. Задачей изобретения является также разработка эффективного фотохимического способа получения водорода с помощью предлагаемого фотобиокатализатора.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым фотобиокатализатором для образования водорода, включающим иммобилизованный фермент и твердый носитель, который в качестве иммобилизованного фермента содержит гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль (0,068-0,156 мг) на 1 см² поверхности носителя, а носителем является нано-структуриванная мезопористая пленка TiO₂, приготовленная из нанокристаллов TiO₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.

Решение поставленной задачи достигается также предлагаемым способом получения фотобиокатализатора для образования водорода путем иммобилизации фермента на твердом носителе, которую осуществляют адсорбцией фермента на поверхности носителя в среде буферного раствора. Для иммобилизации используют фермент гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль (0,068-0,156 мг) на 1 см² поверхности носителя, которую адсорбируют на поверхности наноструктурированной мезопористой пленки TiO₂, приготовленной из нанокристаллов TiO₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.

Решение поставленной задачи достигается также предлагаемым фотохимическим способом получения водорода, характеризующимся тем, что реакцию фотообразования водорода осуществляют в анаэробных условиях в присутствии описанного выше заявляемого фотобиокатализатора и органического донора электронов при освещении УФ-светом с λ=365 нм.

Известно, что неорганические полупроводники, например TiO₂ являются катализаторами фотохимических реакций (RU 2275238, B01J 21/06, C01G 23/053, 27.04.2006; 10.09.2005; US 6939611, B32B 9/00, B01J 23/00, 06.09.2005; US 6387844, B01J 23/00, B01J 21/08, B01J 21/12, B32B 17/06, B32B 19/00,14.05.2002).

Широкое исследование окислительно-восстановительных реакций, фотосенсибилизированных неорганическими полупроводниками в биохимических системах, привело к развитию нового направления в катализе - фотобиокатализа, изучающего сопряженное действие неорганических полупроводников и ферментов (В.В.Никандров "Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность". Успехи биологической химии, 2000, т.40, с.357-396). Первая работа, в которой была реализована окислительно-восстановительная фотореакция при сопряженном действии неорганических полупроводников и ферментов, опубликована в 1976 г. (Красновский А.А., Брин Г.П., Никандров В.В. // Докл. АН СССР, 1976, т.229, с.990-993), в которой было осуществлено фотовыделение водорода из водных суспензий микрочастиц полупроводников (TiO₂, ZnO), содержащих гидрогеназу, освещаемых ближним УФ-светом (λ=365 нм). Дальнейшие исследования показали, что в случае применения в качестве полупроводника-фотосенсибилизатора сульфида кадмия (CdS), фотообразование водорода протекает на видимом свету (Красновский А.А. и др., // Докл. АН СССР, 1979, т.249, с.896-899; Cuender P. et al. // Photobiochem. Photobiophys. 1984, v.7, p.331-340; Никандров В.В. и др. // Докл. АН СССР, 1994, т.335, с.802-805).

В настоящее время, в связи с развитием нанобиотехнологии, основное внимание исследователей обращено к наноструктурированным полупроводниковым носителям для иммобилизации ферментов. Известно использование комплексов полупроводниковых наночастиц CdS с ферментом ацетилхолинэстеразой в качестве фотокаталитического элемента биосенсора нервнопаралитических газов (Hoffmann M.R. et al., Chem. Rev., 1995, v.95, №1, p.69-96).

Предлагаемые фотобиокатализатор, способ его приготовления и фотохимический способ получения водорода были разработаны в результате проведенных авторами исследований влияния на процесс адсорбции белков структуры мезопористых нано-структурированных пленок TiO₂ и условий иммобилизации на них гидрогеназы и изучения механизма сопряженного действия полупроводника и фермента в фотобиокатализаторе.

Способ получения мезопористых наноструктурированных пленок Ti02 и иммобилизация на них различных ферментов являются предметом отдельной заявки, поданной одновременно с данной.

При исследовании адсорбционных свойств пленок TiO₂ наряду с гидрогеназой использовали бычий сывороточный альбумин (БСА), не обладающий ферментативной активностью, но имеющий молекулярный вес, размер и изоэлектрическую точку (ИЭТ), близкие аналогичным характеристикам фермента гидрогеназы (см. таблицу 1). Используемая в настоящей работе гидрогеназа была выделена из фототрофной бактерии Thiocapsa roseopersicina, штамм BBS.

Таблица 1.Свойства белков, используемых для оценки сорбционной способности мезопористых наноструктурированных пленок TiO₂.БелокМолекулярная масса, ДаИЭТБСА663384,8Гидрогеназа680004,2

Сорбция белков на пленках осуществлялась выдерживанием пленок (плошадь пленки 1-4 см², толщина 5-10 мкм) в 3 мл водного буферного раствора белка при температуре 4°С в течение 1-12 суток. Стандартные условия: 0,05 М ТРИС буфер, рН 7,2; концентрация белка 0,1-5·10^-5 М белка. Была исследована зависимость сорбции от удельной поверхности и размера наночастиц TiO₂, использованных для получения пленок.

Оценка сорбционной способности пленок TiO₂ осуществлялась спектрофотометрически по убыли оптической плотности (D) раствора белка, инкубированного с пленкой. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000.

Полученные результаты позволили установить, что наилучшими сорбционными свойствами обладают пленки толщиной 10 мкм, полученные из нанокристаллов TiO₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г.

При выборе оптимальных условий приготовления заявляемого фотобиокатализатора исследовалась кинетика сорбции (на примере БСА) в зависимости от концентрации белка в растворе, от состава и рН среды. Полученные результаты представлены в таблицах 2, 3 и на фиг.1.

Как видно из приведенных данных, оптимальной концентрацией белка при его иммобилизации на пленках TiO₂ является 0,5-5·10^-5 М при значении рН буферного раствора 5,5-8,0. В присутствии хлорида кальция сорбция идет быстрее.

Сорбция гидрогеназы проводилась в тех же условиях, что и сорбция альбумина. Измерения проводили в течение 8 дней. Как и в случае с альбумином, в данных экспериментах сорбция достигла определенного значения за первые 2 суток, а потом увеличивалась лишь на несколько процентов за 6 дней. Удельная сорбция пленок для гидрогеназы варьировалась от 0,1 нмоль/см² до 2,3 нмоль/см² в зависимости от типа пленки и условий сорбции (см. примеры ниже).

Таблица 2.Влияние концентрации БСА в растворе на эффективность сорбции белка*.Концентрация БСА, МСорбция БСА, нмоль/см²5·10^-53,182·10^-52,5310^-51,005·10^-61,152·10^-60,93*Пленки выдерживались в 3 мл раствора БСА в трис-буфере (0,05М, рН 7,2)

Таблица 3.Влияние рН буферного раствора на сорбцию БСА.рНбуферсорбция, нмоль/см²5,5MES + трис2,356,02MES + трис1,478,05трис1,039,1трис0,25

Активность гидрогеназы, иммобилизованной на пленках TiO₂, определяли газохроматографически в 0,05 М трис-буфере при рН 7,2 по скорости образования водорода в присутствии 2,5 ммоль восстановленного метилвиологена (MV) в реакции:

В качестве восстановителя для метилвиологена использовали дитионит натрия (10 мг/мл). Реакцию проводили в анаэробных условиях в стеклянном флаконе объемом 11 мл в 5 мл раствора при 23°С при перемешивании.

Скорость образования водорода, катализируемого гидрогеназой, иммобилизованной на пленке TiO₂, в темновой реакции при окислении восстановленного метилвиологена пропорциональна количеству фермента (см. фиг.2). Активность фермента при иммобилизации на пленке падает в 2,5-3 раза.

Фотообразование водорода пленками TiO₂, содержащими гидрогеназу, исследовали, используя в качестве доноров электронов дитиотреитол и трис-(оксиэтил)-аминометан - органические соединения, которые не способны выступать в качестве субстратов для гидрогеназы и не способны приводить к фотообразованию водорода на пленках TiO₂ в отсутствие фермента. Пример фотообразования водорода, катализируемого нано-структурированными мезопористыми пленками TiO₂, содержащими гидрогеназу, в присутствии 0,1 М дитиотреитола представлен на фиг.3. Было проведено сопоставление скоростей реакции и активности гидрогеназы при образовании водорода на пленках TiO₂, содержащих гидрогеназу, в темновой реакции при окислении восстановленного метилвиологена и в световой реакции при фотоокислении дитиотреитола. Результаты анализа представлены в таблице 4.

Таблица 4.Сравнение образования водорода пленками TiO₂, содержащими гидрогеназу, в темновой реакции при окислении восстановленного метилвиологена и в световой реакции при фотоокислении дитиотреитола. Образование водорода в темновой реакции при окислении восстановленного метилвиологена (подложка для пленки - обычное стекло)Фотообразование водорода (подложка для пленки - обычное стекло)Фотообразование водорода (подложка для пленки - стекло с токопроводящим покрытием)Площадь пленки, см²2,22,071Общее количество фермента на пленке, нмоль52,11,08Плотность фермента на пленке, мг/см²0,1550,0690,073Общая скорость образования водорода в пробе, мкл/мин5,631,130,78Удельная ферментативная активность образования водорода, мкл/мг·мин16,67,910,7Скорость образования водорода с 1 см² пленки с нормировкой на количество фермента мкл/мг·мин·см²7,543,8110,7

Анализ результатов показывает:

1) Эффективность световой реакции сопоставима с эффективностью темновой, где в качестве донора электрона выступает восстановленный метилвиологен. Таким образом, электрон, фотогенерированный наночастицами полупроводника в пленке, используется ферментом в качестве субстрата для восстановления протона не менее эффективно, чем восстановленный метилвиологен, обладающий окислительно-восстановительным потенциалом, близким потенциалу водородного электрода.

2) Величины удельной активности гидрогеназы во всех исследуемых системах близки. Этот факт указывает на насыщение фермента по субстрату - восстановленному метивиологену или фотогенерированному электрону. Для получения больших скоростей фотообразования водорода необходимо увеличить сорбционную емкость пленки или увеличить ее площадь.

В целом процесс фотообразования водорода на предлагаемом фотобиокатализаторе можно представить следующим образом (см. фиг.4): в результате связывания фермента гидрогеназы с поверхностью пленки TiO₂ происходит формирование наноразмерного фотобиокатализатора, представляющего собой комплекс фермента с несколькими нанокристаллами неорганического полупроводника. При световом возбуждении в наночастицах полупроводника происходит разделение зарядов с последующим восстановлением реакционного центра фермента фотогенерированными электронами. Фермент использует электроны для образования молекулярного водорода. Фотогенерированная в полупроводнике дырка мигрирует от наночастиц в составе комплекса к поверхности наноструктурированной пленки, где происходит окисление донора электронов.

Приводим примеры осуществления изобретения.

А. Получение фотобиокатализатора образования водорода.

Пример 1.

Наноструктуриванную мезопористую пленку TiO₂ получали из промышленного порошка нанокристаллов со средним размером 15 нм с удельной поверхностью 100 м²/г (ТКР 102, фирма Tayka, Япония): 2 г порошка смешивают с 0,3 мл 0,1 М раствора азотной кислоты и подвергают дезагрегированию в ультразвуковом диспергаторе мощностью 300 Вт в течение 15 мин. Полученная однородная масса разбавляется 2 мл 0,1% раствора Тритон Х100. Добавляется 0,2 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 и осуществляется гомогенизация ультразвуком (600 Вт) в течение 15 минут. Полученная паста равномерно наносится на подложку с использованием прокладки для получения пленки заданной толщины (10 мкм) и высушивается при комнатной температуре. Затем органические вещества выжигаются в течение 30 мин при 450°С в токе воздуха.

Иммобилизацию гидрогеназы на полученной пленке TiO₂ (подложка из обычного стекла, толщина пленки 10 мкм, площадь пленки 1,6 см²) осуществляли адсорбцией в среде буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН=7,2) при концентрации гидрогеназы 5,5·10^-6 М при температуре 4°С в течение 8 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 0,156 нмоль/см² пленки (0,011 мг/см²).

Пример 2.

Иммобилизацию гидрогеназы осуществляли на пленке TiO₂, полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов, со средним размером 15 нм с удельной поверхностью 100 м²/г (ТКР 102) с использованием 0,05 М уксусной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 2,07 см² (подложка из обычного стекла, толщина пленки 10 мкм) при концентрации гидрогеназы 5,5·10^-6 М в среде буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН=7,2) при температуре 4°С в течение 2 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 0,135 нмоль/см² пленки (0,008 мг/см²).

Пример 3.

Иммобилизацию гидрогеназы осуществляли на пленке TiO₂, полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов со средним размером 25 нм с удельной поверхностью 50 м²/г (Aeroxide P25) с использованием 0,1 М азотной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 2,2 см² (подложка из обычного стекла) при концентрации гидрогеназы 5,5·10^-6 М в среде буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН 8,0) при температуре 4°С в течение 5 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 1,05 нмоль/см² пленки (0,071 мг/см²).

Пример 4.

Иммобилизацию гидрогеназы осуществляли на пленке TiO₂, полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов со средним размером 25 нм с удельной поверхностью 50 м²/г (Aeroxide P25) с использованием 0,1 М азотной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 2,2 см² (подложка из стекла с токопроводящим покрытием) при концентрации гидрогеназы 5,5·10^-5 М в среде буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН 8,0) при температуре 4°С в течение 5 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 1,08 нмоль/см² пленки (0,073 мг/см²).

Пример 5.

Иммобилизацию гидрогеназы осуществляли на пленке TiO₂, полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов со средним размером 25 нм с удельной поверхностью 50 м²/г (Aeroxide P25) с использованием 0,75 М азотной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 2,2 см² (подложка из обычного стекла) при концентрации гидрогеназы 0,55·10^-5 М в среде буферного раствора (ТРИС буфер 0,05 М, рН 8,0) при температуре 4°С в течение 5 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 2,3 нмоль/см² пленки (0,156 мг/см²).

Б. Реакция фотообразования водорода.

Фотохимические эксперименты проводили в стеклянных флаконах (объем 11 мл), закрытых резиновыми крышками и затянутых металлическими фиксаторами.

Во флакон помещалось стекло с нанесенной на него пленкой. Перед опытами флаконы с образцами продували инертным газом для удаления кислорода. Добавление растворов донора электронов: дитиотреитола (0,1 М) или трис-(оксиэтил)-аминометана (0,2 М), также освобожденных от кислорода, в ячейку осуществляли введением шприцем через резиновую пробку. Освещение образцов проводилось лампой ДРШ-250 (мощность 250 Вт, интенсивность света 4·10⁵ эрг/см²·сек, фильтрами УФС-6 и СЗС-22 выделялась полоса 365 нм) при постоянном перемешивании.

При определении состава газовой фазы пробу отбирали шприцем и вносили на колонку газового хроматографа Chrom-4 (Чехословакия). В качестве газа-носителя использовали аргон, в качестве наполнителя колонок - молекулярные сита.

Примеры получения водорода на предлагаемом фотобиокатализаторе при освещении ближним УФ-светом водных буферных растворов, содержащих 0,1 М дитиотреитол, приведены в таблице 4 и на фиг.3 (использовались фотобиокатализаторы, полученные по примерам 4 и 5).

При получении водорода на фотобиокатализаторе, полученном по примеру 3, в присутствии в качестве донора электронов 0,2 М раствора трис-(оксиэтил)-аминометана наблюдаемая удельная фотокаталитическая активность 1 см² пленки составила 1,57 мкл H₂/мин·мг гидрогеназы.

Таким образом, предложен фотобиокатализатор на основе гидрогеназы, иммобилизованной на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂, позволяющий с достаточно высокой скоростью получать водород под действием света, разработаны способ приготовления катализатора и энзиматический способ получения водорода под действием света, отвечающий самым высоким требованиям экологической безопасности. Предложенный катализатор может использоваться в различных устройствах для получения водорода из воды, а также в топливных элементах.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой фотобиокатализатор, включающий иммобилизованный фермент и твердый носитель, при этом иммобилизованным ферментом является гидрогеназа, содержащаяся в количестве 0,1-2,3 нмоль на 1 см поверхности носителя, а носителем является наноструктуриванная мезопористая пленка диоксида титана, приготовленная из нанокристаллов диоксида титана размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием. Изобретение также представляет собой способ получения фотобиокатализатора путем иммобилизации фермента на твердом носителе, которую осуществляют адсорбцией фермента на поверхности носителя в среде буферного раствора. Изобретение также представляет собой способ получения водорода в анаэробных условиях в присутствии описанного фотобиокатализатора и органического донора электрона при освещении УФ-светом с λ=365 нм. Изобретение позволяет создать фотобиокатализатор, позволяющий получать водород под действием света с высокой скоростью. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл.

1. Фотобиокатализатор для образования водорода, включающий иммобилизованный фермент и твердый носитель, отличающийся тем, что в качестве иммобилизованного фермента он содержит гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль на 1 см² поверхности носителя, а носителем является наноструктуриванная мезопористая пленка диоксида титана, приготовленная из нанокристаллов диоксида титана размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.2. Способ получения фотобиокатализатора по п.1 путем иммобилизации фермента на твердом носителе, которую осуществляют адсорбцией фермента на поверхности носителя в среде буферного раствора, отличающийся тем, что для иммобилизации используют фермент гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль на 1 см² поверхности носителя, которую адсорбируют на поверхности наноструктуриванной мезопористой пленки диоксида титана, приготовленной из нанокристаллов диоксида титана размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.3. Фотохимический способ получения водорода, характеризующийся тем, что реакцию фотообразования водорода осуществляют в анаэробных условиях в присутствии фотобиокатализатора по п.1 и органического донора электрона при освещении УФ-светом с λ=365 нм.