Способ получения ферментных электродов чувствительных к метаболитам Советский патент 1981 года по МПК C12N9/02 C25B11/12 

1

Изобретение относится к энзимологии, конкретно к получению ферментных электродон, и может быть использовано в целях анализа, синтеза электрохимическим способом органических соединений или в биотопливных элементах.

Известны способы получения биоэлектродов , в которых осуи1ествляется прямой обмен электронов между активным центром белков и электродами. Например, цитохром С, адсорбированнь1й на ртути, пластине или золоте, может восстанавливаться электрохимическим путем l.

Однако данные системы не содержат биокатализаторов и не могут быть использованы для получения ферментного электрода.

Известен способ получения лакказного электрода, восстанавливающего кислород, путем адсорбции фермента на углеродист{ х материалах fzl.

Недостатком данного способа является то, что онне применим для получения ферментных электродов на основе других ферментов, катализирующих превращение продуктов метаболизма живого организма.

Г1рактически важными являются ферментные электроды, чувствительные к метаболитам - глюкозе, лактату, перекиси водорода, мочевой кислоте,

10 аминокислотам, ксантину, холестерину и др. веществам. Используя такие электроды, создают безреагеитные методы анализа и полностью безреагентные электроды, пригодные для анализа

15 метаболитов In vivo, системы электросинтеза соединений, в частности аминокислот, а также биотопливные элементы, которые служат в качестве имплантируемых в организме датчиков

20 и источников тока.

Однако адсорбция ферментов, ката- лизирующих превращение перечисленных метаболитов на углеродисплх материаiЛих, не обеспечивает создание ферментных электродов, вследствие чего перенос электронов с активных центро флавин- и гем- и металлсодержащих (за исключением.Си-содержащих) ферментов на углеродные электроды не протекает. Известны способы получения фермен ных электродов, чувствительных к метаболитам, на основе глгакозооксидазы лактатдегидрогеназы, оксидазы L- и D-аминокислот, уреазы и др., сущност которых сводится к иммобилизации фермента в геле, нанесению геля на злектрод и снабжению его диализной пленкой для предотвращения диффузии фермента в раствор 31. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения ферментного электрода на основе глюкозооксида зы, закхпочающийся в том, что фермент -иммобилизованный в геле, наносят .на платиновый электрод и покрывают диализной (целлофановой) плешсой .4 и 5. Недостатком известных способов является сложность технологии получе ния ферментных электродов, а также то,что в аналитических реакцияхопределения метаболитов, полученные таким способом, ферментные электроды могут использоваться только при наличии особых веществ-медиаторов, служа|.щ-1х для переноса электронов с активного центра фермента -на проводник - Pt электрод. Таким образом, генерация тока в системе и работа электрода возможны лишь в присутствии медиаторов, в качестве таковых обычно используются бензохинон, феррицианид или кислород. Поскольку два первых являются ядовитыми веществами,- то работа с электродами данного типа требует использования опас ных для лшзни веществ и, кроме того, Невозможна в анаэробной среде. Цель изобретещш - упрощение процесса получения и улучшение свойств ферментных электродов. Указанная цель достигается способом получения ферментных электродов заключагацимся в том, что фермент адсорбируют на органическом электроде, представляющем собой комплекс орган1гческих катионов - метилированных производных феназина, акридина, хинолииа, пиридина, дипиридина и анион-радикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана, и процесс проводят в 4. 4 растворе при концентрации фермента 10-10 моль/л, температуре и рН 7,0-7,2 в течение 0,5-15 ч. В качестве ферментов используют гем-)флавин- и металлсодержащие ферменты: глюкозооксидазу, пероксидазу, лактатдегидрогеназу, оксидазу D- и L-ot-аминокислот, ксантиноксидазу, диафоразу, уриказу и холестериноксидазу. Электролиз приводится в интервале потенциалов от 0,6 до 0,05 В (относительно насыщенного серебряного электрода). Это обеспечивает возможность создания новьк ферментных электродов с использованием гем-, металл- и флавинсодержащих ферментов. Используемые органические комплексы обладают не полупроводниковой, а металлической электропроводностью. Предлагаемьш способ позволяет изготовить электроды, генерирующие ток в присутствии глюкозы, лактата, аминокислот, мочевой кислоты и др. метаболитов и обладающие селективкостью только к этим в.еществам. Па чертеже показана схема ферментного электрода. - . Схема содер;кит органический металл 1 с адсорбированным ферментом, тефлоновый корпус 2, медная (А) или платиновая (Б) проволока 3, эпоксид- . ный компаунд 4, эвтектический припой 5, платиновый, титановый или стеклоуглеродный токоотводящий электрод 6, диализная мембрана 7, резиновое кольцо 8, Способ осуществляют следующим образом. - 0,1 г соли метилированного производного одного из угсазанных ароматических соединений растворяют в 520 мл горячего абсолютного этилового спирта и к нему добавляют горячий раствор 0,1 г (0,05 М) литиевой соли анионрадикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана в 10 мл этилового спирта. Выпавший осадок промывают эфиром и высуцшвают в вакуум-эксикаторе. Полученные порошки черного цвета прессуют под давлением 10 т. К полученным таблеткам 02 мм, толщиной 0,5-1 мм припаивают токоотводящий электрод и монтируют их в тефлоновый корпус таким образом, чтобы с электролитом контактировал только органический проводник (чертеж. А). Подготовленный электрод погружают в раствор высокоочшценного фермента,- кон -в-1 П-Гк центрация которого 1 О -1 0 моль/л (0,004-1,5 мг/мл) в 0,1 М фосфатном буфере рН- 7.,2 и выдерживают в течение 0,5-15 ч при 15-20°С. После этого электроды промывают тем же буферным раствором (4-20 мл). При изготовлении других ферментных электродов 1,0-1,2 мг комплекса добавляют в 3-4 моль/л раствора фермента, содержащего 0,1 мг болка. Суспензия захватьшается на токоотводящем электроде, изготовленном из платины, стеклоуглерода или титана, при помощи диализной мембраны (чертеж, Б). Измерение тока электрода проводится в трехэлектродной схеме в анаэробных условиях в том же буфере. В основе механизма присоединения фермента к органическому комплексу лежит адсорбция белка на гетерогенных поверхностях, обусловленная ионньми и 1зандервальсовскими силами взаимодействия. Адсорбция фермента на органическом комплексе протекает практически необратимо. Пример 1. Электрод, изготов ленный из 24 мг комплекса N-метилфеназина (ММФ) и анион-радикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана (ТЦХМ), погружают в 2 мл раствора кристаллической глюкозооксидазы Реп.vitale в 0,1 М фосфатном буфере. Концентрация фермента 10 моль/л (15 мг/мл). Электрод выдерживают в растворе фермента при комнатной температуре ( 15-20°С ) в течение 15ч. Промывают электрод ф осфатным буфером по 20 мл и подключают к полярогр фу. Определяют стационарньй анодный ток электрода, который устанавливает ся в течение 1 мин при разных концентрациях глюкозы. Зависимость анодного тока окисле.ния глюкозы адсорбированной на , комплексе ШФ ТЦХМ глюкозооксидазы ;(рН 7,2 0,1 М фосфатный буфер, 25°С) приведена в табл.1. Электрод сохраняет высокую стабильность во времени. Зависимость тока глюкозооксидазного электрода при непрерывной его работе в течение продолжительного времени (концентрация глюкозы 2,55 мМ др., условия как в табл.1) приведена в табл.2. Чувствительность электрода в начале увеличивается и в дальнейшем сохраняется на постоянном уровне в

7891774

Продолжение табл. 2

8 Продолжение табл.3

Пример 2. Электрод изготавливают из 26 мг комплекса состава ЧМФ ТЦХМ и погружают в раствор высокоочищенной пероксидазы из хрена в 0,1 М фосфатном буфере. Концентрация фермента 10 моль/л (4-10 мг/мл). Адсорбция проводится в течение 2530 мин при . Ферментный электрод пропитывают фосфатньм буфером и проводят определение тока электрода в зависимости от концентрации перекиси водорода.

Зависимость катодного тока восстанов)1ения перекиси водорода адсорбированной на комплексе МНФ Ти;ХМ пер.оксидазой (20Рс, ,0,; 0,1 М фосфатный буфер) показана в табЛ.З. , Злектрод сохраняет работоспособ ность в течение суток Когда на комплексе захватывается раствор пер.оксидазы (0,1 мг/мл) при помощи диализной мембраны, электрод сохраняет активность более, чем в течение месяца.

Таблица 3

Ток

Концентраэлектция перерода, киси водомкАрода, мМ

3

2

275б

оГГ

4,72

1,0 6,32 1,5 7,52 2.0 8,80

2,5

3,5

10,32 Пример 3. 1мл комплекса со става ММФ ТЦХМ добавляют в 3 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,2 и температуре , содержащего 0,1 мг цитохрЬма Ь активностью 70 ед/мг, вьщеленной из дрожжей Hansenuia anoma,la. Полученную суспензию наносят на токоотводящий электрод (плати новый или из стеклоуглерода) и закры вают полупроницаемой мембраной. На электрод подается потенциал в интервале 0,3-0,4 В (относительно Ag/AgC1 электрода сравнения) и измеряется зависимость стационарного ток после 1 мин при добавлении D-, L-лак тата. Зависимость тока анодного окисления лактата адсорбированного на комп лексе N№)TUXM цитохрома Ь (2G°C, рН 7,2, 0,1 М фосфатного буфера) при ведена в табл.4. Таблица Ток электКонцентраПотенциал аноция D-, Lрода, мкА Да,Б -лактата, мМ 0,05 0,15 . 0., 34 0,64 0,93 1,52 О Пример 4. 1,2мг комплекса состава (ТЦХМ) добавляют в 4 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН которого 7,2 при , содержащего 0,1 мг цитохрома bj.. Другие операции аналогичны примеру 3. тока анодного окисдсорбированного на )2 цитохрома bz ,1 М фосфатный буфер), л.5. Таблица5 КонцентраТок электция D-, Lрода, мкА -лактата, мМ 0,08 0,24 0,68 1,20 . ,68 2,12 2,48 тока ферментного охром Ь (ТЦХМ )1 (потенциал анода ация D-, L-лактата осфатный буфер), при. Таблица 6

11

Продолжение табл.6

Пример 5. Таблетку прессуют из 12 мг комплекса ЙМР ТШФГ диаметром 2 мм и толпщной около 0,5 ммдвыкладъизают на торец электрода, изготовленного из впаянной в стекло и отшлифованной титановой проволоки.

Комплекс прижимают к электроду при помощи капроновой сетки (толщина нитей 0,1 мм, 160 меш). На сетку наносят Ojl мм раствора глюкозооксидаз (1,3 мг/мл) и раствор закрывают целлофановой мембраной. Определяют токэлектрода в присутствии глюкозы.

Зависимость разностного анодного тока глюкозоокс1здазного электрода, в качестве токоотводящего электрода в котором служит титановая проволока

(комплекс ММФ ТЦХМ, рИ 7,2, 0,1 М фосфатный буфер, , потенциал

0,2

llpOAOJDKeune табл,8

Пример 7.0,10-0,12 мг лиофилизированного порошка оксидазы L-аминокислоты (или уриказы, или колестериноксидазы) растворяют в О,I мл фосфатного буфера и раствор наносят на поверхность электрода N-метилхинолиний ТЦХМ. Раствор покрывают диализной мембраной. Электрод погружают в фосфатный буферный раствор и выдерживают в течение 0,51,5 ч при 25°С. Определяют ток электрода в зависимости от концентрации субстрата.

Зависимость анодного тока окисления L-лизина, адсорбиропа.киой на .комплексе оксидазой L-аминокислот от концентрации субстрата при 0,048 В относительно н.с.э. (рН 7,2, 0,1 М фосфатный буфер, 25 С, анаэробный раствор), приведена в табл.9.

Таблица 9

Примечания. 1.В случае мочевой кислоты и холестерина калиб,- . ровка выполнена до 0,63 мМ субстратов. Величины токов близки по значению к току электрода на основе оксидазы аминокислот.

Пример 8. 55i«n раствора диафоразы, вьоделенной из митохондрий и обладающей НАДН-окиелительной способностью (0,2 ед/мг), захватьшают в приэлектродном слое комплекса N-метилпиридиний-ТЦХМ и проводят определения тока электрода в зависимости от концентрации субстрата.

Зависимость тока окисления НАДНц адсорбированной на комплексе НМПИ ТЦХМ диафоразой от концентрации субстратов (потенциал анода 0,072 В относительно н.с..э., рН 7,2, 0,1 М фосфатный буфер, 25°С, анаэробный раствор), приведена в .табл.10.

5891774

Таблица 10

НАДН,

Ток электрода, . мкА

Пример 9. 10мл раствора глюкозооксидазы (69 мМ) захватьшают при помощи диализной мембраны на поверхности электрода из комплекса метилзиологен - ТЦХМ, определяют ток электрода в зависимости от концентрации глюкозы.

Зависимость тока окисления глзокозы адсорбированной на МБ ТЦХМ глюкозооксвдазой от концентрации субстрата (0,048 В относительно н.с.э., другие условия, как в табл.З), приведена в табл.11.

Таблица 11

16 Формула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

кл. С 25 В П/12, 1979.

с. 169-176.

i

/5

g

.