ПЕПТИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ФУНКЦИЮ ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК C07K5/72 A61K38/05 A61P15/10 

Изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим пептиды, и касается дипептида, а также композиции на его основе и может быть использовано в медицинской практике в качестве средства, стимулирующего функцию половой системы, при заболеваниях и патологических состояниях репродуктивной системы, а также при угнетении функции половых желез при старении организма.

Как известно из литературных источников, в процессе старения наблюдается существенное изменение медиаторного статуса различных мозговых структур (Rodriguez-Gomes J.A., de la Rose С., Mashado A. The effect of age on monoamine in the hypothalamus // Mech. Ageing Dev. - 1995. - Jan.13; - N 77(3). - P.185-195; Kholl J. The facilitation of dopaminergic activity in the aged brain by (-) deprenyl. A proposal for a strategy to improve the quality of life in senescence // Mech. Ageing Dev. - 1985. - May 13. - 30(2). - P.109-122; Miguez J.M., Aldeguende M., Pas-Valinas L. Selective change in the contents of noradrenaline, dopamine and serotonin in rat brain areas during aging // J. Neural Transm. - 1999. - 106 (11-12). - P. 1089-1098). Наибольший вклад в возрастное снижение половой активности самцов вносит старение гипоталамуса - структуры, ответственной за эндокринную регуляцию организма, а также таких элементов лимбической системы, как гиппокамп и амигдала. Известно, что примерно с 20-месячного возраста в гипоталамусе крыс-самцов наблюдается снижение содержания норадреналина и дофамина, а концентрация серотонина при этом, наоборот, возрастает.

В данном случае под стимуляцией понимается усиление мотивационной составляющей полового поведения самцов животных, проявляющееся в сокращении временных интервалов, а также активация спаривательного поведения, проявляющаяся в увеличении количества копуляторных элементов - садок, интромиссий и эякуляций.

Возрастное снижение половой функции у животных и человека является сложным, многоуровневым процессом, затрагивающим центральную нервную систему, эндокринную систему, периферические органы и регулирующимся с помощью нейромедиаторов, нейропептидов и стероидных гормонов (Гладкова А.И. Половые различия инволюционных изменений сексуального поведения крыс // Пробл. старения и долголетия. - 1994. - N 3-4. - С.322-333). Половое поведение старых крыс-самцов характеризуется увеличением временных интервалов, уменьшением количества копуляторных элементов, снижением количества половых гормонов в крови, при этом в головном мозге наблюдаются возрастные изменения количества нейромедиаторов и их метаболитов (Chan S.W.C., Leathern J.H., Esashy T. Testicular metabolism and serum testosterone in aging male rats // Endocrinology. - 1977. - 101. - P.129-133; Rodriguez-Gomes J.A., de la Rose C., Mashado A. The effect of age on monoamine in the hypothalamus // Mech. Ageing Dev. - 1995. - Jan.13; - N 77(3). - P.185-195; Veldhuis J.D. Resent neuroendocrine facets of male reproductive aging // Exp.Gerontology. - 2000. - 35. - P.1281-1308).

Известны непептидные лекарственные средства, применяемые для лечения половых дисфункций у мужчин, такие как апоморфин и йохимбин - селективные блокаторы альфа-2-рецепторов к норадреналину, повышающие содержание и обмен дофамина в ядрах лимбической системы, что приводит к усилению моторной активности, увеличению ориентировочно-исследовательской и эмоциональной активности, а следовательно, к повышению половой активности (Smith Erla R., Davidson Julian M. Yohimbine attenuates aging-induced sexual deficiencies in male rats // Physiol. and Behav. - 1990. - 47, N 4. - P.631-634; Argiolas A., Melis M., Stancampiano R. Facilitation of male sexual behavior by dopaminergic agonists: A possible mechanism of action // Int. Meet. "Neuroendocrinimmunol. Reprod.", Elba Island, June 3-10, 1990 // New Trends Gynaecol. and Obstet. - 1991. - 7, N 3-4. - P.95-102).

Однако эти препараты имеют серьезные недостатки: так, апоморфин может вызывать рвоту, а йохимбин - двигательные расстройства.

Известен непептидный препарат сильденафил (виагра), применяющийся при лечении эректильной дисфункции (Vitezic D., Pelcic J.M. Erectile disfunction: oral pharmacotherapy options // Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. - 2002 Sep. - 40 (9). - P.393-403). Однако прием виагры несовместим с приемом кардиологических нитросодержащих препаратов, в том числе используемых местно (Dumestre-Toulet V., Cirimele V., Gromb S., Belooussoff Т. Last performance with VIAGRA: post-morten identification of sildenafil and its metabolites in biological speciments including hair sample // Forensic. Sci. Int. - 2002. - Mar 28. - 126 (1). - P.71-76).

Известны пептидные соединения, применяемые в качестве средств, стимулирующих функцию половой системы, среди которых следует отметить нейропептиды, обладающие центральным действием и оказывающие стимулирующее влияние на половое поведение.

Наиболее известны пептиды ACTH/MSH и окситоцин (Strand F.L. David and Goliath - the slingshot that started the neuropeptide revolution // Eur. J. Pharmacol. - 2000. - Sep 29. - 405, N 1-3. - P.3-12; Cantor J.M., Binik Y.M., Pfaus J.G. Chronic fluoxetine inhibition sexual behavior in male rats: reversal with oxitocin // Phsychopharmacology (Beri). - 1999. - Jun. - 144(4). - P.355-362; Smock Т., Albeck D., Stark R. A peptide basis for sexual behavior in mammals // Prog. Brain. Res. - 1998. - 119. - P.467-481; Arletti R., Calza L., Giardiano L. Sexual impotence is associated with a reduced production of oxitocin and with increased of opioid peptides in paraventricular nucleus of male rats // Neurosci. Lett. - 1997. - Sep 19. - 233(2-3). - P.65-68), имеющие крайне широкий спектр действия, в том числе способные оказывать стимулирующее влияние на половое поведение.

При этом необходимо отметить, что пептиды ACTH/MSH и окситоцин имеют целый ряд побочных эффектов и поэтому их использование в медицинской практике, в том числе для стимуляции полового поведения ограничено.

Известно использование пептидов для лечения эректильной дисфункции (РСТ WO 94/22460, патентах США №№5955421; 5932548 и патенте РФ №2264823).

Однако применение этих пептидов ограничивается только эректильной дисфункций и не распространяется на другие компоненты полового поведения самцов животных, которые являются наиболее важными при возрастном снижении половой активности. С другой стороны, с точки зрения физиологии эрекция без сексуальной стимуляции не является оптимальной.

Исходя из этого разработка эффективного биологически активного соединения пептидной природы, стимулирующего функцию половой системы, является актуальной.

Из уровня техники (Squires E.J., Feltham L.A., "Isolation, characterization and seasonal variations in the concentration of N-epsilon-(gamma-glutamyl)-lysine isodipeptide in the blood plazma of the winter flounder (Pseudopleuronectes americanus)", Biochem J. 1980 Mar 1; 185(3): 761-6 известно получение вариантов дипептидов Glu-Lys, в том числе N^α-(γ- Glu)-Lys.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения нового биологически активного соединения пептидной природы, стимулирующего функцию половой системы мужчин.

Технический результат изобретения заключается в создании дипептида, обладающего биологической активностью, проявляющейся в стимулировании функции половой системы, а также фармацевтической композиции, содержащей этот дипептид в качестве активного начала, использование которого стимулирует функцию половой системы, путем модуляции нейроэндокринного статуса при заболеваниях и патологических состояниях репродуктивной системы, а также при угнетении функции половых желез в процессе старения организма.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные по методикам, принятым в данной области.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Настоящее изобретение относится к применению дипептида, представляющего собой Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин, для стимулирования функции половой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса при старении и при гипогонадном состоянии.

Другим объектом предложенной группы изобретений является фармацевтическая композиция, стимулирующая функцию половой системы, содержащая в качестве активного начала эффективное количество дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин и фармацевтически приемлемый носитель. При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа стимуляции функции половой системы, заключающегося во введении фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала дипептид Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозе 1,0 мкг/кг - 1,0 мг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

При этом введение осуществляют парентерально.

Дипептид получают классическим методом пептидного синтеза в растворе (Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. - М.: Мир, 1985. - 456 с.).

Действие дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин, направленное на стимуляцию функции половой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса при старении и при гипогонадном состоянии, было выявлено при исследовании влияния данного дипептида на половое поведение самцов крыс по стандартным методикам (Agmo A. Protocol. Male rat sexual behavior // Brain Res. Protocols. - 1997. - 1. - P.203-209).

Модулирующее влияние дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на медиаторный статус гипоталамуса, гиппокампа и амигдалы - мозговых структур, ответственных за эндокринный статус и половое поведение животных, было выявлено при нейрохимическом исследовании содержания и обмена в них серотонина, дофамина и норадреналина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией.

Изучение влияния дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на эндокринный статус животных проводилось с помощью измерения уровней содержания тестостерона, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, пролактина, а также адренокортикотропного гормона в периферической крови животных методом иммуноферментного анализа.

В результате экспериментального изучения установлено, что дипептид Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин не обладает токсичностью.

Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие дипептид, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве средства, стимулирующего функцию мужской половой системы.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин как активное начало смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Понятие "эффективное количество" подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм.

Для парентерального введения носитель обычно включает физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности.

Предлагаемый дипептид может быть введен парентерально в соответствующим образом приготовленной лекарственной форме с фармацевтически приемлемыми наполнителями.

Сущность изобретения поясняется девятью таблицами.

В Таблице 1 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение старых самцов крыс при однократном введении в дозировке 100 мкг на животное.

В Таблице 2 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение старых самцов крыс при 18-кратном введении в дозировке 50 мкг на животное.

В Таблице 3 представлены данные по влиянию дипептида на нейромедиаторный статус гипоталамуса, гиппокампа и амигдалы старых самцов крыс при 18-кратном введении в дозировке 50 мкг на животное.

В Таблице 4 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение самцов крыс после односторонней гонадэктомии при однократном введении в дозировке 100 мкг на животное.

В Таблице 5 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение самцов крыс после односторонней гонадэктомии при однократном введении в дозировке 250 мкг на животное.

В Таблице 6 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение самцов крыс после односторонней гонадэктомии при 6-кратном введении в дозировке 50 мкг на животное.

В Таблице 7 представлены данные по влиянию дипептида на половое поведение самцов крыс после односторонней гонадэктомии при 12-кратном введении в дозировке 50 мкг на животное.

В Таблице 8 представлены данные по влиянию однократного введения дипептида в дозировке 250 мкг на животное на эндокринный статус самцов крыс после односторонней гонадэктомии.

В Таблице 9 представлены данные по влиянию 18-кратного введения дипептида в дозировке 50 мкг на животное на эндокринный статус самцов крыс после односторонней гонадэктомии.

Настоящее изобретение иллюстрируется примером синтеза дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин (пример 1), примерами, подтверждающими биологическую активность дипептида, демонстрирующими его фармакологические свойства и подтверждающими возможность достижения терапевтически эффективной фармацевтической композиции (примеры 2, 3, 4, 5, 6 и 7), примером испытания дипептида на токсичность (пример 8).

Приведенные в примерах, иллюстрирующих изобретение, результаты доклинического изучения дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин демонстрируют его фармакологические свойства и подтверждают возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Синтез дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин

1. Название соединения: Nα-(γ-L-глутамил)-лизин

2. Структурная формула: (H-Glu-OH)-Lys-OH

3. Брутто-формула без противоиона: C₁₁H₂₁N₃O₅

4. Молекулярный вес без противоиона: 275,30

5. Противоион: ацетат

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме

ВОС - трет.бутилоксикарбонильная группа,

OSu - N-оксисукцинимидный эфир,

DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид,

OBut - трет.бутиловый эфир,

TFA - трифторуксусная кислота

6. Характеристики готового препарата:

- содержание основного вещества: 98,40% (по ВЭЖХ, 220 нм)

- ТСХ - индивидуален, R_f=0,80 (ацетонитрил-вода 1:3)

- содержание влаги: 7%

- рН 0,001% раствора: 4,50

- Удельное оптическое вращение: [α]_D ²²:-27° (с=1, Н₂О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

1) BOC-Glu(OSu)-OBut (I), α-трет.бутиловый эфир N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-N-оксисукцинимидил)глутаминовой кислоты

α-Трет.бутиловый эфир N-трет.бутилоксикарбонилглутаминовой кислоты BOC-Glu-OBut (1,35 г, 4,0 ммоль) растворяли в 30 мл тетрагидрофурана, добавляли N-оксисукцинимид (0,50 г, 4,4 ммоль) и охлаждали до температуры минус 10°С. Отдельно приготавливали раствор N,N'-дициклогексилкарбодиимида (0,9 г 4,4 ммоль) в 5 мл тетрагидрофурана и охлаждали его до той же температуры. Далее оба раствора объединяли и перемешивали реакционную смесь в течение 24 ч при охлаждении льдом. Выпавшую N,N-дициклогексилмочевину отфильтровывали и растворитель упаривали в вакууме. Остаток закристаллизовывали в системе этилацетат/гексан. После сушки в вакууме получено 1, 64 г продукта (95%). R_f=0,71 (бензол-ацетон 2:1)

2) (BOC-Glu-OBut)-Lys(BOC)-OH (II), N_α-(α-трет.бутил-N-трет.бутилоксикарбонил-γ-глутамил)-N_ε-трет.бутилоксикарбониллизин

N_ε-трет.бутилоксикарбониллизин H-Lys(BOC)-OH (0,98 г, 4,0 ммоль) перемешивали в течение 1 ч в 10 мл N,N'-диметилформамида с добавкой 0,56 мл (4,0 ммоль) триэтиламина при температуре 40°С. Далее добавляли раствор BOC-Glu(OSu)-OBut (I) (1,2 г, 4,0 ммоль) в 10 мл N,N'-диметилформамида и реакционную смесь перемешивали в течение 1 суток при той же температуре. Затем подкисляли 0,5 н. раствором H₂SO₄ до рН 3-4 и экстрагировали этилацетатом 3×20 мл. Объединенный органический слой промывали 1 н. раствором H₂SO₄ 2×20 мл, водой 2×20 мл, 5% раствором NaHCO₃ в объеме 20 мл, водой 2×20 мл, насыщенным раствором NaCl. Сушили органический слой над Na₂SO₄ Растворитель упаривали в вакууме, остаток закристаллизовывали под гексаном. После сушки в вакууме получено 1,0 г продукта (80%). R_f=0,66 (бензол-ацетон 1:1).

3) (H-Glu-OH)-Lys-OH, N_α-γ-глутамил лизин

1,0 г Защищенного дипептида (BOC-Glu-OBut)- Lys(BOC)-OH (II) растворяли в 10 мл хлороформа, добавляли 2,0 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Полноту деблокирования контролировали по ТСХ в системе ацетонитрил-вода (1:3). Далее растворитель упаривали в вакууме.

Для очистки препарат растворяли в 5 мл 0,01% трифторуксусной кислоты (рН пробы 2,5) и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50×250 мм Diasorb-130-C16T, 7μ. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module.

Условия хроматографирования - A: 0,1% TFA; В: 50% MeCN in 0.1% TFA;

градиент В: 0→5% за 80 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при длине волны 219 нм, сканирование при длине волны 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 57-64 мин.

Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С, упаривание многократно (не менее 5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в 50 мл деионизованной воды и лиофилизовывали. Получено 300 мг очищенного препарата в виде аморфного порошка белого цвета без запаха.

4) Анализ готового препарата.

- Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex

С-18 LUNA 4,6х150 mm. A: 0,1% TFA, B: MeCN; градиент В 0-100% in 10 min. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при длине волны 220 нм, сканирование при длине волны 190-600 нм, проба 20μl. Содержание основного вещества 98,40%.

- ТСХ: индивидуален, R_f=0,80 (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ

Sorbfil, силикагель СТХ-1 ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

- содержание влаги: 7% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при температуре 100°С).

- рН 0,001% раствора: 4,50 (потенциометрически).

- Удельное оптическое вращение: [α]_D ²²: -27° (с=1, H₂O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Пример 2. Изучение влияния дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на половое поведение старых самцов крыс при однократном введении

Исследование влияния дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на половое поведение старых крыс-самцов проводили по стандартным методикам изучения полового поведения животных (Agmo A. Protocol. Male rat sexual behavior // Brain Res. Protocols. - 1997. - 1. - P.203-209).

В эксперименте использовали 16 крыс-самцов в возрасте 18 месяцев с массой тела 400-500 г и 8 крыс-самцов в возрасте 4 месяцев с массой тела 250-300 г. Животных разделили на 3 группы: 8 старых самцов образовали подопытную группу, а группы из 8 старых и 8 молодых животных использовали в качестве положительного и отрицательного контролей.

Животным подопытной группы за 1 ч до исследования внутрибрюшинно вводили дипептид Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозе 100 мкг на крысу в 0,1 мл стерильного физиологического раствора, при этом контрольные группы старых и молодых животных получали эквивалентное количество физиологического раствора - 0,1 мл. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище при реверсивном освещении (свет от 22 ч до 10 ч). Все животные имели половой опыт. Рецептивность у предварительно овариоэктомированных самок вызывали последовательными введениями эстрадиол-дипропионата (40 мкг на животное за 48 ч до начала эксперимента) и прогестерона (500 мкг на животное за 4 ч до начала эксперимента). Параметры полового поведения фиксировали визуально в течение 15 мин во время темновой фазы суточного цикла при тусклом освещении. Регистрировали латентные периоды и число садок (ЛпС и САД соответственно), интромиссий (ЛпИ и ИМС) и эякуляций (ЛпЭ и ЭЯК), а также рассчитывали период восстановления (ПВ) - время от первой эякуляции до следующей интромиссии и межэякуляторный интервал - время между первой и второй эякуляциями.

После введения дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин старым животным их половое поведение претерпело существенные изменения. Латентные периоды первой садки и первой интромиссии сокращались по сравнению с контрольной группой старых животных на 64,7% (р<0,05) и 53,1% (р<0,05) соответственно и приближались к значениям, характерным для полового поведения молодых самцов. Период восстановления недостоверно сокращался на 16,5%. Сокращение указанных временных интервалов говорит о том, что дипептид Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин способен оказывать стимулирующее влияние на мотивационную составляющую полового поведения животных. Число интромиссий увеличивалось на 40,1% (р<0,05), число садок и эякуляций имело тенденцию к увеличению на 19,2% и 19% соответственно. Возрастание значений этих показателей свидетельствует не только об активации копуляторного (спаривательного) поведения старых самцов, но и об увеличении их физической выносливости (Таблица 1).

Таким образом, применение дипептида при однократном введении позволило активизировать половую функцию старых самцов крыс как со стороны мотивационной составляющей, так и со стороны периферической составляющей. При этом параметры полового поведения старых животных приближались к таковым, характерным для молодых животных, кроме этого отмечалось существенное увеличение физической выносливости.

Пример 3. Изучение влияния дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на половое поведение и медиаторный статус мозговых структур старых крыс, самцов при многократном введении

В эксперименте использовали 16 крыс-самцов в возрасте 18 месяцев с массой тела 400-500 г и 8 крыс-самцов в возрасте 4 месяцев с массой тела 250-300 г в качестве контрольной группы. Эксперимент проводили по методике, описанной в примере 2, при этом подопытная группа животных ежедневно получала дипептид Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозе 50 мкг на крысу в течение 18 дней, а две контрольные группы - эквивалентное количество физиологического раствора. Тестирование животных проводили еженедельно.

После 6-кратного введения дипептида также наблюдали активацию полового поведения у старых животных (Таблица 2). Латентные периоды садки и интромиссии достоверно сокращались по сравнению с контрольной группой старых животных на 37,5% (р<0,05) и 60,7% (р<0,05) соответственно, а период восстановления достоверно уменьшался на 31,6% (р<0,05). Число садок и интромиссии при этом достоверно увеличивалось на 30,8% (р<0,05) и 40,6% (р<0,05) соответственно; кроме того, достоверно возрастало количество эякуляций на 38,9% (р<0,05). Приведенные данные позволяют говорить об активирующем влиянии многократного введения дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на половое поведение старых самцов.

Следовательно, хроническое введение дипептида привело к более выраженному эффекту активации полового поведения старых самцов крыс. Значительное сокращение временных латентных интервалов позволяет предположить стимулирующее влияние дипептида на центральную, мотивационную, составляющую полового поведения, а увеличение количества копуляторных элементов, особенно эякуляций, подразумевает положительное воздействие дипептида на периферические механизмы регуляции полового поведения.

Концентрацию норадреналина (НА), дофамина (ДА) и серотонина (СТ) в гипоталамусе, гиппокампе и амигдале животных обеих групп определяли методом HPLC на хроматографе «Beckman System Gold» с электрохимическим детектором LC-4C. Образцы мозговой ткани выделяли при температуре минус 20°С и хранили в жидком азоте до хроматографического анализа. Идентификацию и количественную оценку содержания нейромедиаторов производили по отношению площади полученных пиков к площади пиков от внешних стандартов.

Результаты исследования показали, что 18-кратное введение дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин приводило к существенному изменению медиаторного статуса старых животных. Содержание норадреналина в гипоталамусе возрастало на 18% (р<0,05), количество дофамина имело тенденцию к росту на 21%, однако уровень серотонина оставался неизменным. В гиппокампе содержание норадреналина не изменялось, а уровни дофамина и серотонина достоверно возрастали на 24% и 23% соответственно. В амигдале содержание норадреналина увеличивалось на 33% (р<0,05), а уровень дофамина имел тенденцию к росту на 11%, содержание серотонина не изменялось (Таблица 3). Эти данные свидетельствуют о том, что 18-кратное введение дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин старым крысам-самцам препятствовало возрастным изменениям в содержании норадреналина и, что особенно важно, дофамина. Лишь серотонинергическая система исследованных мозговых структур практически не взаимодействовала с данным дипептидом.

Таким образом, 18-кратное введение дипептида старым самцам крыс препятствует возрастным изменениям медиаторного статуса гипоталамуса, гиппокампа и амигдалы, что позволяет предположить модулирующее влияние дипептида на дофаминергическую и норадренергическую системы указанных мозговых структур.

Пример 4. Изучение влияния дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на половое поведение крыс-самцов после гемигонадэктомии при однократном введении

В эксперименте были использованы 24 крысы-самца с односторонней гонадэктомией (ГГЭ) в возрасте 5 месяцев с массой тела 300-400 г и 8 интактных крыс-самцов того же возраста с массой тела 250-350 г, составивших группу положительного контроля. Из 24 оперированных животных были сформированы 2 подопытные группы по 8 животных в каждой, получавшие внутрибрюшинно дипептид Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозах 100 мкг (1 подопытная группа) и 250 мкг (2 подопытная группа) на животное в 0,1 мл стерильного физиологического раствора, остальные 8 оперированных животных составили группу отрицательного контроля. Крысы обеих контрольных групп получали внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора - 0,1 мл. Условия проведения эксперимента и описываемые параметры полового поведения аналогичны условиям, рассмотренным в примере 3.

После введения гемигонадэктомированным самцам 100 мкг дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин наблюдали заметную активацию полового поведения подопытных животных. Так, ЛпС имел тенденцию к сокращению на 56,9%, а ЛпИ уменьшался на 34,4% (р<0,05), кроме этого сократился ПВ - на 19,6% (р<0,05) по сравнению с группой отрицательного контроля. Количественные характеристики - САД и ИМС возрастали на 36,6% (р<0,05) и 60,9% (р<0,05) соответственно. Однако ни латентный период эякуляции, ни само число эякуляций существенно не изменялись (Таблица 4).

При увеличении количества вводимого дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин до 250 мкг на крысу наблюдали более выраженную активацию полового поведения гемигонадэктомированных самцов. Так, ЛпС уменьшался на 51,8% (р<0,05) по сравнению с оперированными животными контрольной группы. Количественные параметры - САД и ИМС возросли на 26,9% (р<0,05) и 45,1% (р<0,05) соответственно, кроме этого увеличивалось число эякуляций на 45,8% (р<0,05), латентный период эякуляции имел тенденцию к сокращению на 26,5%, а межэякуляторный интервал уменьшался на 19,2% (р<0,05). Таким образом, параметры полового поведения животных при гипогонадном состоянии приближались к значениям, характерным для молодых интактных животных (Таблица 5).

Таким образом, введение дипептида гемигонадэктомированным самцам крыс позволило нивелировать последствия односторонней гонадэктомии, причем действие препарата носило дозозависимый характер: так, увеличение дозировки до 250 мкг на животное приводило к почти полной нормализации полового поведения.

Пример 5. Изучение влияния дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на половое поведение крыс-самцов после гемигонадэктомии при многократном введении

В эксперименте были использованы 16 крыс-самцов с односторонней гонадэктомией (ГГЭ) в возрасте 5 месяцев с массой тела 250-350 г и 8 интактных крыс-самцов того же возраста, составивших группу положительного контроля. Из 8 оперированных животных была сформирована подопытная группа, ежедневно получавшая внутрибрюшинно дипептид Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозе 50 мкг на животное в 0,1 мл стерильного физиологического раствора, остальные 8 животных составили группу отрицательного контроля. Обе контрольные группы получали внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора - 0,1 мл. Условия проведения эксперимента и регистрируемые параметры полового поведения аналогичны приведенным в примере 4.

После 6-кратного введения дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозе 50 мкг на животное наблюдалась активация сексуального поведения животных. Так, отмечалась тенденция к сокращению ЛпС на 34,4%, а ЛпИ достоверно сокращался на 35,1% (р<0,05). Количество садок (САД) при этом имело тенденцию к увеличению на 29,3%, а число интромиссий (ИМС) возрастало на 73,0% (р<0,001). Кроме того, уменьшался латентный период эякуляции (ЛпЭ) на 46,6% (р<0,05), само же число эякуляций возрастало на 26,4%, а период восстановления сокращался на 18,5% - оба изменения носили характер тенденции (Таблица 6).

Увеличение кратности введения препарата до 12 приводило к дальнейшей активации мотивационной составляющей полового поведения самцов: ЛпС сокращался на 35,2% (р<0,05), а ЛпИ уменьшался на 51,9% (р<0,001) по сравнению со значениями, полученными у животных из группы отрицательного контроля. Количество садок не изменялось, однако число интромиссий увеличивалось на 42,2% (р<0,05). Число эякуляций недостоверно возрастало на 22,0% и достигало уровня, свойственного молодым интактным животным. Кроме того, наблюдалась тенденция к сокращению как латентного интервала эякуляции, так и межэякуляторного интервала (Таблица 7).

Характер изменения этих параметров свидетельствует об активирующем влиянии дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на копуляторную составляющую полового поведения.

Последующее увеличение количества введений до 18 не приводило к дальнейшей активации полового поведения крыс-самцов с гипогонадным состоянием. Следовательно, многократное введение дипептида гемигонадэктомированным самцам крыс приводило к частичному восстановлению половой функции как со стороны мотивационной составляющей, так и со стороны периферических механизмов регуляции полового поведения. Однако при данном способе введения эффект был менее выражен, чем при однократном введении дипептида в большей дозировке.

Пример 6. Изучение влияния дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на эндокринный статус гемигонадэктомированных крыс-самцов при однократном введении

Уровень гормонов (лютеинизирующего - ЛГ, фолликулостимулирующего - ФСГ, тестостерона - Т, пролактина - ПРЛ и адренокортикотропного гормона - АКТГ) определяли в сыворотке крови с помощью тест-наборов для иммуноферментного анализа in vitro (DRG, Германия и Хема-Медика, Россия-Италия).

Исследование проводили на образцах сыворотки крови животных, которым однократно внутрибрюшинно вводили дипептид Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозе 250 мкг на животное. Хотя введение 250 мкг дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин не оказывало влияния на сниженный в результате односторонней гонадэктомии уровень тестостерона в сыворотке крови, содержание лютеинизирующего гормона возрастало в 3 раза и достигало половины значения, характерного для молодых интактных животных. Отмечалась тенденция к повышению уровня фолликулостимулирующего гормона (на 8%), содержание пролактина оставалось неизменным, а уровень адренокортикотропного гормона, сниженный в результате односторонней гонадэктомии, возрастал в 4,2 раза (Таблица 8).

Таким образом, однократное введение дипептида оказало модулирующее влияние на эндокринный статус гемигонадэктомированых самцов крыс, выражавшееся в повышении содержания в сыворотке крови животных лютеинизирующего и адренокортикотропного гормонов.

Пример 7. Изучение влияния дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин на эндокринный статус гемигонадэктомированных крыс-самцов после многократного введения

Исследование проводили на образцах сыворотки крови животных, которым проводили 18-кратное внутрибрюшинное введение дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозе 50 мкг на животное. Многократное введение указанного дипептида приводило к выраженным изменениям эндокринного статуса крыс-самцов. Уровень лютеинизирующего гормона в сыворотке крови превышал контрольные значения в 13,2 раза. Наблюдалось достоверное снижение содержания пролактина - на 8,4% (р<0,05), содержание адренокортикотропного гормона возрастало в 9,7 раза (Таблица 9).

Следовательно, 18-кратное введение дипептида гемигонадэктомированным самцам крыс приводило к резкому увеличению содержания лютеинизирующего и адренокортикотропного гормонов, а также наблюдалось снижение повышенного в результате односторонней гонадэктомии уровня пролактина, что особенно важно для нормализации полового поведения животных.

Выявленные в результате экспериментального исследования свойства дипептида позволяют считать показанным его профилактическое и/или лечебное применение в качестве средства для стимуляции функции мужской половой системы при старении и гипогонадном состоянии.

Пример 8. Изучение общетоксического действия дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин

Общетоксическое действие дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении дипептида.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 60 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-23 г.Животные были разделены на 6 равных групп. Дипептид вводили животным однократно внутримышечно в дозах 1 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг в 0,1 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.

Исследования по изучению хронической токсичности проведено на 60 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-250 г и на 100 морских свинках-самцах с массой тела 300-350 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили дипептид внутримышечно в течение 90 дней, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, в дозах 100 мкг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг в 0,25 мл 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме 0,9% раствор NaCl. До введения дипептида, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почек, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение дипептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 10000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение хронической токсичности дипептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 5000 раз. Не отмечено достоверного влияния препарата на СОЭ, резистентность эритроцитов и биохимические показатели в сыворотке крови.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию, содержащую дипептид в качестве активной субстанции, для проведения клинических испытаний в качестве средства, стимулирующего функцию половой системы при заболеваниях и патологических состояниях репродуктивной системы, а также при угнетении функции половых желез при старении организма.

Пептидное соединение, стимулирующее функцию половой системы

Таблица 1ПоказательЛпС, секСАД, nЛпИ, секИМС, nЛпЭ, секЭ, nМЭИ, секПВ, секМолодые животные6,5±1,426,3±4,517,7±7,117±3283±452,0±0,3442±32277±34Старые животные23±815,8±2,125,6±8,18,8±2,0403±801,4±0,2544±50352±43Старые животные + дипептид7,5±1,8*18,8±3,212,0±4,5*12,3±1,4*305±661,7±0,2525±48294±28* - Р<0,05 по сравнению с показателем у старых животныхТаблица 2ПоказательЛпС, секСАД, nЛпИ, секИМС, nЛпЭ, секЭ, nМЭИ, секПВ, секМолодые животные7,3±2,328,4±2,016,7±2,91б,8±2,9331±702,0±0,4423±75285±42Старые животные12,8±2,317,2±2,334,8±10,09,6±3,6399±501,2±0,2594±82392±б0Старые животные + дипептид8,0±1,4*22,5±2,1*13,6±3,1*13,5±2,2*400±651,7±0,2*508±74268±4** - Р<0,05 по сравнению с показателем у старых животных

Пептидное соединение, стимулирующее функцию половой системы

Таблица 3ПоказательСтарые крысы самцы интактныеСтарые крысы самцы + 18-кратное введение дипептидаГипоталамусНА (нг/мг)1,14±0,091,36±0,1*ДА (нг/мг)0,23±0,030,28±0,05СТ (нг/мг)1,7±0,11,7±0,1ГиппокампНА (нг/мг)0,02±0,0060,016±0,009ДА (нг/мг)4,9±0,46,2±0,6СТ (нг/мг)0,59±0,040,73±0,03*АмигдалаНА (нг/мг)0,24±0,030,32±0,03*ДА (нг/мг)0,26±0,050,29±0,06СТ (нг/мг)1,6±0,11,61±0,08* - Р<0,05 по сравнению с показателем у старых животныхТаблица 4ПоказательЛпС, секСАД, nЛпИ, секИМС, nЛпЭ, секЭ, nМЭИ, секПВ, секМолодые животные8,0±2,325,7±3,951,7±11,210,6±2,1319±1001,5±0,4457±70300±61ГГЭ животные20,2±15,618,7±1,9103,1±25,68,9±2,0377v1201,3±0,4548±96344±49ГГЭ животные + дипептид8,7±2,225,5±4,4*67,6±10,2*14,2±2,7*349±581,6±0,4490±66277±35* - Р<0,05 по сравнению с показателем у ГГЭ животных

Пептидное соединение, стимулирующее функцию половой системы

Таблица 5ПоказательЛпС, секСАД, nЛпИ, секИМС, nЛпЭ, секЭ, nМЭИ, секПВ, секМолодые животные8,0±2,325,7±3,951,7±11,210,6±2,1319±1001,5±0,4457±70300±61ГГЭ животные10±418,2±4,378±10,77,8±1,7455±1681,3±0,4534±78314±43ГГЭ животные + дипептид4,8±2,5*23,2±2,3*85,4±10,111,4±2,5*334±701,88±0,28*458±47*289±32* - Р<0,05 по сравнению с показателем у ГГЭ животныхТаблица 6ПоказательЛпС, секСАД, nЛпИ, секИМС, nЛпЭ, секЭ, nМЭИ, секПВ, секМолодые животные6,6±1,426,3±4,613,7±3,617±3,7258±472±0,3443±60277±34ГГЭ животные9,1±4,218,2±4,378,4±20,77,9±1,7455±1681,3±0,4567±101325±39ГГЭ животные + дипептид6±1,522,5±3,250,9±13,4*13,6±2,5**243±871,6±0,4462±80348±73* - Р<0,05 по сравнению с показателем у ГГЭ животныхТаблица 7ПоказательЛпС, секСАД, nЛпИ, секИМС, nЛпЭ, секЭ, nМЭИ, секПВ, секМолодые животные7,3±2,428,4±6,212,8±3,517,4±3,132±872±0,4423±76285±42ГГЭ животные7,7±1,423±4,486±168±1,5343±1801,4±0,4499±110315±43ГГЭ животные + дипептид5±1,1*21±1,641,6±5,7**11,4±1,3*302±1041,8±0,4449±46336±43* - Р<0,05 по сравнению с показателем у ГГЭ животных

Пептидное соединение, стимулирующее функцию половой системы

Таблица 8ПоказательТестостерон Т, нмоль/лФСГ, МЕд/лЛГ, МЕд/лПролактин, мМЕд/лАКТГ, пМоль/лМолодые животные8,2±0,26,2±0,12,3±0,2102,7±6,23±0,4ГГЭ животные5,7±0,36,3±0,20,4±0,1153,1±5,81,9±0,2ГГЭ животные + дипептид5,5±0,36,8±0,31,2±0,2*148,1±6,28±1,2**- Р<0,05 по сравнению с показателем у ГГЭ животныхТаблица 9ПоказательТестостерон Т, нмоль/лФСГ, МЕд/лЛГ, МЕд/лПролактин, мМЕд/лАКТГ, пМоль/лМолодые животные8,2±0,26,2±0,12,3±0,2102,7±6,23±0,4ГГЭ животные5,7±0,36,3±0,20,4±0,1153,1±5,81,9±0,2ГГЭ животные + дипептид5,4±0,26,1±0,25,3±0,2**140,3±6,2*18,5±1,2*** - Р<0,05 по сравнению с показателем у ГГЭ животных.
** - Р<0,001 по сравнению с показателем у ГГЭ животных.

Изобретение относится к применению дипептида общей формулы Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин для стимулирования функции половой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса при старении и при гипогонадном состоянии. Также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин и способ стимуляции функции половой системы. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 табл.

1. Применение дипептида, представляющего собой Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин, для стимулирования функции половой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса.2. Фармацевтическая композиция, стимулирующая функцию половой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса, содержащая в качестве активного начала эффективное количество дипептида общей формулы Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин и фармацевтически приемлемый носитель.3. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для парентерального введения.4. Способ стимуляции функции половой системы, заключающийся во введении фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала дипептид общей формулы Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин в дозе 1,0 мкг/кг - 1,0 мг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.5. Способ по п.4, отличающийся тем, что введение осуществляют парентерально.