СПОСОБ РАДИОСЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2025 года по МПК A61K33/244 A61P35/00 

Изобретение относится к области онкологии, в частности к радиотерапии, и касается способов радиосенсибилизации опухолевых клеток, которые могут быть использованы для сочетанной терапии в рамках комплексного подхода к лечению опухолей.

Современная лучевая терапия включает использование максимальных доз облучения опухоли при минимизации воздействия на соседние здоровые ткани. Снижение дозы может снизить эффективность терапии, а увеличение общих доз в попытке улучшить терапевтический результат сопровождается побочными эффектами и повреждением здоровых тканей. Стратегия повышения эффективности и уменьшения побочных эффектов лучевой терапии заключается в повышении радиочувствительности опухолей, в том числе посредством усилителей терапевтического действия ионизирующего излучения (радиосенсибилизаторов).

Известен способ радиосенсибилизации опухолевых клеток [RU 2723393 C1, МПК A61K 31/7008 (2006.01), A61N 5/10 (2006.01), Опубликовано: 11.06.2020], заключающийся в воздействии на опухолевую клетку веществом, являющимся ингибитором гликолиза и одновременно блокирующим клеточную пролиферацию, в качестве которого используют глюкозамин D гидрохлорид в концентрации 10 мМ.

Известен способ радиосенсибилизации опухолевых клеток, [RU 2720455 C1, МПК (2006.01) A61K 31/375, А61K 41/00, A61P 35/00, опубл. 30.04.2020], выбранный в качестве прототипа, который заключается в воздействии на опухолевые клетки водным раствором аскорбата лития с формулой LiС₆Н₇О₆ концентрацией 1,2 ммоль/л. Опухолевые клетки выдерживают 60 минут в СО₂ инкубаторе при 37°С в среде 5% углекислого газа. Далее проводят облучение на рентгеновской установке с интенсивностью 20 мГр/сек в суммарной дозе 3 Гр.

Однако, данный способ обеспечивает подавление жизнеспособности культуры опухолевых клеток при использовании высокой концентрации радиосенсибилизирующего средства.

Техническим результатом заявленного изобретения является расширение арсенала способов радиосенсибилизации опухолевых клеток.

Предложенный способ радиосенсибилизации опухолевых клеток заключается в воздействии на опухолевые клетки водным раствором аскорбатфенантролинатного комплекса европия с общей формулой EuAscNO₃Phen·4·H₂O концентрацией 0,03-0,12 ммоль/л в течение 60 минут при 37ºС с последующим облучением рентгеновским излучением в суммарной поглощенной дозе 3 Гр.

На фиг. 1. показана оценка уровня жизнеспособности адгезивных опухолевых клеток HCT-116 (колоректальный рак) через 72 часа после облучения в поглощенной дозе 3 Гр.

На фиг. 2. показана оценка уровня жизнеспособности суспензионных опухолевых клеток Jurkat (Т-лимфобластная лейкемия) через 72 часа после облучения в поглощенной дозе 3 Гр.

Использован комплекс европия c общей формулой EuAscNO₃Phen·4·H₂O, метод получения которого известен [Евтушенко Д.Н., Скорик Н.А., Плотников В.М. Изучение взаимодействия европия, самария и платины с аскорбиновой кислотой и 1, 10 – фенантролином. Журнал неорганической химии. 2002; 47(11): 1877-1882].

Пример 1.

Готовили рабочий раствор с концентрацией 3 ммоль/л для чего растворили 8,7 мг аскорбатфенантролинатного комплекса европия в 5 мл физиологического раствора хлорида натрия. В качестве объекта воздействия использовали адгезивные опухолевые клетки линии колоректального рака HCT-116 в среде DMEM, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (пенициллин-стрептомицин). Суспензию клеток в концентрации 50 тыс. кл/мл вносили в лунки 96-луночного планшета по 100 мкл в лунку. Далее инкубировали 24 часа в СО₂-инкубаторе при 37ºС в среде 5% углекислого газа.

После чего вносили препарат из рабочего раствора по 4,0 мкл, 2,0 мкл или 1,0 мкл в лунку, получая конечную концентрацию препарата в среде 0,12, 0,06 или 0,03 ммоль/л соответственно.

Аскорбат лития (прототип) с формулой LiС₆Н₇О₆ вносили в аналогичных объемах из рабочего раствора с концентрацией 3 ммоль/л, получая финальные концентрации 0,12, 0,06 или 0,03 ммоль/л. В контрольные образцы вносили соответствующие объемы физиологического раствора. Клетки выдерживали 60 минут в инкубаторе при 37°С в 5% СО₂.

Далее экспериментальные планшеты с клетками облучали рентгеновским излучением с интенсивностью 20 мГр/сек в суммарной поглощенной дозе 3 Гр. После облучения все планшеты, включая контрольные, инкубировали в течение 72 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа.

Для учета результатов проводили определение уровня жизнеспособности культуры через 72 часа после облучения с заявленным средством и без него с помощью МТТ-теста. Для этого среду из планшетов удаляли и в лунки вносили раствор МТТ 0,45 мг/мл, далее инкубировали при 37°С, в 5% СО₂ в течение 4 часов. После чего среду аспирировали и в лунки вносили 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Далее измеряли оптическую плотность образцов при длине волны 570 нм на спектрофотометре Multiscan FS (ThermoFisher). По полученным значениям оптической плотности рассчитывали жизнеспособность в процентах от контроля без облучения и применения препаратов.

Результаты определения уровня жизнеспособности культуры линии колоректального рака HCT-116 через 72 часа после рентгеновского облучения в поглощенной дозе 3 Гр показаны на фиг. 1.

Процент жизнеспособных клеток после лучевого воздействия в дозе 3 Гр при инкубации с 0,12 ммоль/л аскорбатфенантролинатного комплекса европия составил 6±3%, тогда как при инкубации с 0,12 ммоль/л аскорбата лития этот параметр составил 43±6%, а в контрольной группе с облучением без препаратов - 48±5% (клетки без облучения и воздействия препаратов приняты за 100%). Применение заявленного способа радиосенсибилизации опухолевых клеток позволяет получить лучшие результаты, которые статистически значимо отличаются по сравнению с контрольным облучением и облучением в комбинации с аскорбатом лития (p<0,001).

Пример 2.

Готовили рабочий раствор аскорбатфенантролинатного комплекса европия аналогично описанному в примере 1. В качестве объекта воздействия использовали суспензионные опухолевые клетки Т-лимфобластной лейкемии линии Jurkat. Клетки культивировали в среде RPMI-1640, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (пенициллин-стрептомицин). Суспензию клеток в концентрации 300 тыс. кл/мл вносили в лунки 96-луночного планшета по 100 мкл в лунку и сразу вносили аскорбатфенантролинатный комплекс европия из рабочего раствора по 4,0 мкл, 2,0 мкл или 1,0 мкл в лунку, получая конечную концентрацию препарата в среде 0,12, 0,06 или 0,03 ммоль/л соответственно.

Аскорбат лития (прототип) с формулой LiС₆Н₇О₆ вносили в соответствующие лунки планшета в аналогичных объемах из рабочего раствора с концентрацией 3 ммоль/л, получая финальные концентрации 0,12, 0,06 или 0,03 ммоль/л. В контрольные образцы вносили соответствующие объемы физиологического раствора. Клетки выдерживали 60 минут в инкубаторе при 37°С в 5% СО₂.

Далее экспериментальные планшеты с клетками облучали рентгеновским излучением с интенсивностью 20 мГр/сек в суммарной поглощенной дозе 3 Гр. После облучения все планшеты, включая контрольные, инкубировали в течение 72 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа.

Для учета результатов проводили определение уровня жизнеспособности культуры через 72 часа после облучения с заявленным средством и без него с помощью резазуринового теста. Для этого в лунки с клетками вносили раствор резазурина 0,02 мг/мл, далее инкубировали при 37°С, в 5% СО₂ в течение 4 часов. После чего эти планшеты без дальнейшей обработки использовали для измерения оптической плотности образцов при длине волны 570 нм на спектрофотометре Multiscan FS (ThermoFisher). По полученным значениям оптической плотности рассчитывали жизнеспособность в процентах от контроля без облучения и применения препаратов.

Результаты определения уровня жизнеспособности культуры суспензионных опухолевых клеток Jurkat (Т-лимфобластная лейкемия) через 72 часа после рентгеновского облучения в поглощенной дозе 3 Гр показаны на фиг. 2.

Процент жизнеспособных клеток после лучевого воздействия в дозе 3 Гр при инкубации с 0,12 ммоль/л аскорбатфенантролинатного комплекса европия составил 8±3%, тогда как при инкубации с 0,12 ммоль/л аскорбата лития этот параметр составил 58±4%, а в контрольной группе с облучением без препаратов - 67±4% (клетки без облучения и воздействия препаратов приняты за 100%). Таким образом, применение заявленного способа радиосенсибилизации опухолевых клеток позволяет получить лучшие результаты, которые статистически значимо отличаются по сравнению с контрольным облучением и облучением в комбинации с аскорбатом лития (p<0,001).

Изобретение относится к области онкологии, в частности к радиотерапии, и касается способов радиосенсибилизации опухолевых клеток, которые могут быть использованы для сочетанной терапии в рамках комплексного подхода к лечению опухолей. Способ радиосенсибилизации опухолевых клеток заключается в воздействии на опухолевые клетки водным раствором аскорбатфенантролинатного комплекса европия с общей формулой EuAscNO₃Phen⋅4H₂O концентрацией 0,03-0,12 ммоль/л в течение 60 минут при 37°С с последующим облучением рентгеновским излучением в суммарной поглощенной дозе 3 Гр. Способ обеспечивает расширение арсенала способов радиосенсибилизации опухолевых клеток. 2 ил., 2 пр.

Способ радиосенсибилизации опухолевых клеток, заключающийся в воздействии на опухолевые клетки водным раствором аскорбатфенантролинатного комплекса европия с общей формулой EuAscNO₃Phen·4H₂O концентрацией 0,03-0,12 ммоль/л в течение 60 минут при 37°С с последующим облучением рентгеновским излучением в суммарной поглощенной дозе 3 Гр.