ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ НАЗАЛЬНОГО ВСАСЫВАНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/00 A61K9/14 A61K38/26 A61K38/28 A61K47/02 A61K47/12 A61K47/36 A61K47/38 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для назального всасывания и, более конкретно, к фармацевтической композиции для назального всасывания, которая содержит в качестве активного ингредиента биологически активный кислый полипептид с изоэлектрической точкой 7 или ниже и добавки, которые усиливают биодоступность пептида.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биологически активные полипептиды представляют собой высокомолекулярные соединения, обладающие различными специфическими фармакологическими активностями, и представляют собой соединения, весьма полезные для использования в области медицины для различных целей. Например, известен глюкагоноподобный пептид I (далее в настоящем документе упоминается как GLP-1), пептидный гормон, происходящий из предшественника глюкагона (проглюкагона) (Bell et al., Nature, 304, 368, 1983). Проглюкагон, который был идентифицирован у млекопитающих, представляет собой белок-предшественник, состоящий из 160 аминокислот и вырабатываемый А-клетками панкреатических островков (островков Лангерганса) и L-клетками кишечника. В поджелудочной железе проглюкагон преобразовывается преобразующим ферментом в глюкагон и главный проглюкагоновый фрагмент, в то время как в кишечнике проглюкагон преобразовывается по-другому, с образованием глицентина, GLP-1, и глюкагоноподобного пептида-2 (далее в настоящем документе упоминается как GLP-2) (Mojsovr et al., J. Biol. Chem., 261, 11880, 1986).

Пептид, образованный аминокислотами 72-108 проглюкагона (эквивалентный GLP-1), активен в отношении усиления секреции инсулина. Также GLP-1(7-37), который образуется в результате удаления первых 6 N-концевых аминокислот из GLP-1, и GLP-1(7-36)NH₂, который образуется в результате амидирования GLP-1(7-37) по позиции 36, являются наиболее эффективными промоторами секреции инсулина среди ранее известных промоторов секреции инсулина (Mojsov et al., J. Clin. Invest., 79, 616, 1987). Они также активны в отношении подавления секреции глюкагона. Было показано, что GLP-1 секретируется из L-клеток кишечника в кровоток в форме GLP-1(7-36)NH₂ (Gutniak et al., N. Engl. J. Med., 326, 1316, 1993).

GLP-1(7-36)NH₂ немедленно секретируется из L-клеток кишечника в ответ на раздражитель в виде проглатывания пищи и действует на поджелудочную железу, способствуя секреции инсулина. В то же время он уменьшает секрецию глюкагона, увеличивает экспрессию мРНК в инсулин-секретирующих клетках, уменьшает глюконеогенез в печени и подавляет активность желудочно-кишечного тракта. Это предполагает жизненно важную роль GLP-1, включая GLP-1(7-36)NH₂, как инкретина (стимулятора секреции инсулина), который отвечает требованиям энергетического метаболизма в организме человека.

Обладая описанными выше биологическими активностями, пептиды находят свое применение в качестве лекарственного средства для лечения диабета. Конкретно, GLP-1(7-36)NH₂ можно вводить перед приемом пищи для подавления подъема после приема пищи уровня глюкозы в крови, так что он может действовать как эффективный терапевтический агент для пациентов с диабетом II типа. Лекарственные средства на основе сульфонилмочевины, которые обладают сходной активностью в отношении усиления секреции инсулина, связаны с риском возникновения чрезмерно низкого уровня глюкозы в крови, поскольку указанные лекарственные средства проявляют свою активность вне зависимости от уровня глюкозы в крови. В случае введения в течение продолжительного периода времени указанные лекарственные средства могут также сделать инсулин-продуцирующие клетки менее активными. Напротив, поскольку активность GLP-1(7-36)NH₂ в отношении усиления секреции инсулина регулируется механизмом обратной связи, отражающим концентрацию глюкозы в крови, GLP-1(7-36)NH₂ редко вызывает возникновение чрезмерно низкого уровня глюкозы в крови. Кроме того, GLP-1(7-36)NH₂ стимулирует инсулин-продуцирующие клетки. Таким образом, в настоящее время существует резкий контраст между GLP-1(7-36)NH₂ и лекарственными средствами на основе сульфонилмочевины при клиническом использовании в качестве лекарственного средства для лечения диабета.

Различные активности GLP-1(7-36)NH₂, включая подавление глюконеогенеза в печени, активацию инсулин-продуцирующих клеток, усиление захвата сахара мышцами, подавление активности желудочно-кишечного тракта и подавление аппетита через центральную нервную систему, дали основания ожидать, что, помимо его активности в отношении коррекции уровней глюкозы в крови после приема пищи, введение GLP-1(7-36)NH₂ в течение продолжительного периода времени может нормализовать и активировать целостность системного метаболизма глюкозы и уменьшать ожирение, один из главных факторов диабета.

Другим пептидом, который имеет сходную с GLP-1(7-36)NH₂ эндокринную активность (т.е. стимулирует секрецию инсулина), является эксендин-4, который был выделен из ядозуба (вида рептилии), и структура которого была установлена. Указанный пептид является менее чувствительным к деградации в плазме крови по сравнению с GLP-1(7-36)NH₂ и, следовательно, способен сохранять свою активность в отношении усиления секреции инсулина в течение продолжительного периода времени. Как в случае GLP-1(7-36)NH₂, известно, что эксендин-4 индуцирует дифференцировку/неогенез β-клеток.

Поскольку 8-я позиция GLP-1(7-37) и GLP-1(7-36)NH₂ расщепляется дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), существующей в живом организме, производное, в котором Ala в 8-й позиции замещен аминокислотой, которая нелегко расщепляется, такой как Val, т.е. [Val⁸]-GLP-1(7-37), и производное, в котором GLP-1 модифицирован жирной кислотой для удлинения видимого полупериода существования в плазме крови путем контролирования скорости растворения, т.е. [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), как надеются, имеют то же самое действие. С другой стороны, недавние исследования показали, что GLP-1(9-37), который расщеплен в 8-й позиции, обладает тем же понижающим уровень глюкозы в крови действием (Deacon et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Matb. 282, 873-879, 2002). Благодаря данному открытию, нет необходимости подтверждать преимущество замены аминокислотного остатка GLP-1(7-36)NH₂ в 8-й позиции и модификации GLP-1(7-36)NH₂ жирной кислотой для продления видимого полупериода существования в плазме крови.

Желудочный ингибирующий полипептид (далее в настоящем документе упоминается как GIP), пептид, который стимулирует секрецию инсулина глюкозозависимым образом, отличается от GLP-1 и эксендина-4 в том, что пептид, помимо способности усиливать секрецию инсулина, может усиливать секрецию глюкагона.

Из указанных пептидных инкретинов GLP-1(7-36)NH₂ имеет аминокислотную последовательность, общую для млекопитающих, и считается идеальным лекарственным средством для лечения диабета. Однако GLP-1(7-36)NH₂ плохо всасывается из желудочно-кишечного тракта в силу своей пептидной природы. Это в значительной степени мешает разработке пептида в качестве лекарственного средства для лечения диабета.

Как известно, помимо перорального введения, пептид можно вводить через кожу путем подкожной инъекции. Однако долгосрочные подкожные инъекции должны контролироваться врачами, а учитывая обременительность и боли в местах инъекций, инъекция не является удобным путем для долгосрочного введения лекарственного средства для лечения диабета. Хотя пептид может эффективно корректировать высокие уровни глюкозы в крови, когда его вводят после каждого приема пищи, подкожные инъекции 3 раза в день очевидно не являются практичным путем для введения пептида. Кроме того, маловероятно, что самостоятельные инъекции инсулина, которые производят не только пациенты с диабетом I типа, но также пациенты с диабетом II типа, будут производиться в комбинации с самостоятельными инъекциями композиции GLP-1.

Для того, чтобы решить описанные выше проблемы, были предприняты попытки абсорбировать GLP-1(7-36)NH₂ через слизистую оболочку ротовой полости в форме препарата типа пластыря (Gutniak et al., Diabetes care, 20, 1874, 1997). Данная конкретная форма введения, однако, включает использование усилителей всасывания, в данном примере таурохолата натрия, который представляет собой тип желчной кислоты и вызывает сильное раздражение. В результате раздражение является неизбежным, и слизистая оболочка может быть повреждена, что делает данный способ введения непригодным для долгосрочного введения.

Таким образом, на данный момент времени не существует практичной неинъекционной методики введения GLP-1(7-36)NH₂ и других пептидных инкретинов, которая была бы безопасной, обеспечивала бы высокую биодоступность и была бы удобной для частой доставки лекарственного средства. Все еще существует потребность в разработке подобной методики.

В отличие от низкомолекулярных соединений, биологически активные полипептиды не вводятся эффективным образом никаким путем введения, кроме инъекции. Главными причинами этого является тот факт, что биологически активные полипептиды подвергаются расщеплению пищеварительными ферментами, присутствующими в желудке и тонком и толстом кишечнике или в абсорбирующих эпителиях данных органов, носовой полости и легких, и что полипептиды, благодаря своей большой молекулярной массе, не транспортируются посредством обычных путей транспортировки. По указанным причинам недавно были предложены назальные пептидные препараты, предназначенные для назального всасывания, в качестве жизнеспособной неинъекционной методики для введения пептидов. Обычно указанный назальный пептидный препарат вводят распылением раствора пептида с помощью ингалятора в носовую полость в присутствии усилителей всасывания. Одна проблема данного подхода состоит в том, что среди различных известных биологически активных полипептидов некоторые пептиды, включая GLP-1(7-36)NH₂, которые имеют изоэлектрическую точку (далее упоминается как pI) в кислом или нейтральном диапазоне, имеют тенденцию становиться нестабильными в кислом или нейтральном растворе.

Например, в результате наблюдений авторов настоящего изобретения было установлено, что в то время как раствор GLP-1(7-36)NH₂ при назальном введении крысам и другим животным до некоторой степени всасывается, пептид становится нерастворимым, когда раствор хранится более нескольких десятков часов (см. ссылочный пример, ниже). Таким образом, препарат в виде раствора является неудобным для использования с фармацевтической композицией, даже если она представляет собой такой тип, в котором пептид растворяют каждый раз, когда используется препарат.

Подобно этому, известно, что глюкагон и инсулин имеют изоэлектрическую точку в кислом или нейтральном диапазоне рН и становятся нерастворимыми или кристаллизуются в кислом или нейтральном растворе. Известно, что многие подобные пептиды имеют изоэлектрическую точку в кислом или нейтральном диапазоне рН и, таким образом, становятся нерастворимыми или кристаллизуются в кислом или нейтральном растворе. Следовательно, практически невозможно вводить данные пептиды интраназально в форме препарата кислого или нейтрального раствора.

С другой стороны, ожидается, что кислые биологически активные полипептиды будут хорошо растворяться в щелочном (основном) растворителе. Однако, когда кислые биологически активные полипептиды подвергались воздействию основного раствора, кислый биологически активный полипептид не только становился чувствительным к деградации, такой как гидролиз, которая также может иметь место в кислой среде, но также приобретал тенденцию к рацемизации. В результате его химическая стабильность снижалась. Как кислые, так и основные биологически активные полипептиды могут подвергаться указанным побочным реакциям. Известно, например, что казеин (pI = около 4,6), основный биологически активный полипептид, становится нестабильным, когда его аминокислотные остатки аспарагиновой кислоты, фенилаланина, глутаминовой кислоты и аланина претерпевают рацемизацию в основном растворе (Friedman et al., J. Food Sci., 47, 760-764, 1982). Органические кислоты включают разнообразные материалы, включая уксусную кислоту и масляную кислоту, каждая из которых является биологическим соединением, и длинноцепочечные карбоновые кислоты, такие как октановая кислота и декановая кислота, каждая из которых является пищевым веществом. Многие из указанных органических кислот можно использовать в фармацевтической композиции в качестве добавок. С другой стороны, многие органические основания, такие как серотонин и дофамин, как известно, обладают фармакологической активностью. Щелочные металлы, такие как натрий, во многих случаях не подходят в качестве добавки в фармацевтической композиции, поскольку они часто делают затруднительным подбор рН композиции и имеют тенденцию образовывать соль с кислым пептидом, влияя, таким образом, на свойства пептида. По указанным причинам не является предпочтительным, принимая во внимание химическую стабильность и выбор добавочных компонентов, представлять кислый биологически активный полипептид в форме щелочного раствора.

Как описывалось выше, не является предпочтительным представлять кислые биологически активные полипептиды ни в форме кислого или нейтрального раствора, ни в форме щелочного раствора. Таким образом, кислые биологически активные полипептиды не подходят для применения в препаратах в виде растворов для назального введения.

Для определенных типов биологически активных полипептидов, таких как инсулин, кальцитонин, паратироидный гормон (PTH), гормон роста человека (HGH) и гормон гипоталамуса (LH-RH), в качестве альтернативы назальному препарату в форме раствора были предложены порошкообразные препараты для назального всасывания. Многие соединения испытывались на возможность их использования в качестве носителя для указанных порошкообразных препаратов для назального введения, и были предложены различные порошкообразные композиции с использованием нескольких различных носителей для назального введения биологически активных полипептидов.

В ходе исследований было установлено, что вещества, которые являются нерастворимыми или малорастворимыми в воде, но могут растворяться в воде в кислых условиях, могут служить высокоэффективными носителями для порошкообразного препарата для назального введения биологически активных полипептидов. Например, были предложены фармацевтические композиции для назального введения, в которых в качестве носителя используется соединение поливалентного металла, такое как гидроксиапатит и карбонат кальция (выложенная заявка на патент Японии № Hei 8-27031), вещества, обладающие способностью восстанавливать или защищать слизистую оболочку, в частности, слизистую оболочку желудка (выложенная заявка на патент Японии № Hei 9-255586), или порошкообразные зерна (выложенная заявка на патент Японии № 2000-239187).

Однако один порошкообразный препарат, который был изготовлен диспергированием и адсорбцией GLP-1(7-36)NH₂ на носителе, таком как соединение поливалентного металла, показал биодоступность GLP-1(7-36)NH₂, составляющую у собак приблизительно 4% и у обезьян - 1% или менее, при назальном введении указанным животным. Таким образом, назальное всасывание препарата было менее чем удовлетворительным.

Биологически активные полипептиды, такие как GLP-1(7-36)NH₂, чьи изоэлектрические точки находятся в кислом или нейтральном диапазоне рН, обладают низкой растворимостью в кислом или нейтральном диапазоне рН и, даже будучи растворены в растворе, имеют тенденцию к агрегации. Указанные полипептиды не могут достигать достаточной биодоступности не только при назальном введении в форме раствора, но даже при назальном введении в форме порошкообразного препарата. Таким образом, еще предстоит установить эффективный неинъекционный путь для введения данных пептидов.

Композиция для назального введения, состоящая из циклического пептида и композиции поливалентного металла в качестве носителя, описана в WO 01/52894 A2. Описано также, что можно добавлять усилитель всасывания, такой как рисовая мука и крахмал, а размеры частиц указанного усилителя должны предпочтительно составлять 250 мкм или менее, более предпочтительно от 20 до 180 мкм. Тем не менее, в указанном источнике нет описания, касающегося способа улучшения биодоступности путем добавления усилителя приблизительно с тем же размером частиц, что и у носителя, к биологически активному кислому полипептиду с изоэлектрической точкой 7 или ниже по настоящему изобретению.

Соответственно, целью настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции, которая делает возможным назальное введение биологически активных полипептидов с изоэлектрической точкой в кислом или нейтральном диапазоне рН. Указанные полипептиды имеют плохую биодоступность при пероральном введении или при введении другими неиъекционными путями, имеют низкую растворимость в кислом или нейтральном диапазоне рН и имеют тенденцию агрегировать, даже когда они растворены в растворе. Фармацевтическая композиция является безопасной и достигает высокой биодоступности, в то же время не вызывая раздражения.

Пытаясь найти пути достижения указанной цели, авторы настоящего изобретения изучали возможные добавки в качестве потенциального компонента композиции для назального введения пептидов. Сначала изучали крахмал, чтобы установить, может ли он в качестве добавки помочь стабилизировать пептид.

Крахмал, пищевое вещество, имеющееся в избытке в зерновых, представляет собой материал, который можно безопасно использовать в качестве добавки в композиции для назального всасывания. Крахмал состоит из амилозы, которая составлена из глюкозных единиц, соединенных α-1,4-связями, с образованием прямой цепи, и амилопектина, который включает α-1,6-связи и, таким образом, является разветвленным.

Соединение поливалентного металла используется в качестве носителя в комбинации с несколькими различными типами крахмала, содержащими амилозу и амилопектин в различных пропорциях, в качестве добавок для изготовления фармацевтических композиций для назального всасывания. Каждую фармацевтическую композицию изучали на предмет ее назальной всасываемости. Также изучалось влияние размера частиц крахмала в качестве добавки для фармацевтической композиции на усиление назального всасывания.

В результате авторы настоящего изобретения установили, что введением следующей назальной порошкообразной композиции в носовую полость может достигаться улучшенное назальное всасывание и может, таким образом, обеспечиваться эффективное клиническое лечение. Указанную композицию изготавливают однородным диспергированием и закреплением кислого биологически активного полипептида, такого как GLP-1(7-36)NH₂, на поверхности порошкообразного или кристаллического соединения поливалентного металла в качестве носителя, который является нерастворимым или малорастворимым в воде и имеет средний размер частиц 100 мкм или менее, такого как соединение двухвалентного металла или металла с более высокой валентностью, например соединения кальция, с использованием добавки, такой как рисовая мука (порошок Domyo-ji), кукурузный крахмал, картофельный крахмал и их прежелатинизированный или частично прежелатинизированный крахмал, каждый из которых содержит амилопектин и амилозу в определенной пропорции.

Авторы настоящего изобретения также установили, что в случае использования нерастворимого в воде крахмала в качестве добавки и соединения поливалентного металла, такого как карбонат кальция, со средним размером частиц 100 мкм или менее, в качестве носителя, нерастворимый в воде крахмал с размером частиц меньше, чем у носителя, демонстрирует замечательный эффект усиления всасывания кислого пептида, такого как GLP-1(7-36)NH₂. Настоящее изобретение было завершено на основе данных открытий.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для назального всасывания, включающей биологически активный кислый полипептид с изоэлектрической точкой 7 или ниже, носитель, который является нерастворимым или малорастворимым в воде, и добавку для диспергирования и закрепления полипептида на поверхности носителя.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции для назального всасывания, включающей биологически активный полипептид с изоэлектрической точкой 7 или ниже, т.е. в нейтральном или кислом диапазоне рН, соединение поливалентного металла в качестве носителя и добавку для диспергирования и закрепления полипептида на поверхности носителя.

Конкретный вариант фармацевтической композиции по настоящему изобретению для назального всасывания содержит, вместе с добавкой, имеющей средний размер частиц от 1 мкм до 20 мкм, эффективную дозу биологически активного полипептида с изоэлектрической точкой в нейтральном или кислом диапазоне рН таким образом, что полипептид является однородно диспергированным и закрепленным на поверхности порошкообразного или кристаллического соединения поливалентного металла в качестве носителя, имеющего средний размер частиц 100 мкм или менее.

Другой конкретный вариант фармацевтической композиции по настоящему изобретению для назального всасывания содержит пептидный инкретин, соединение поливалентного металла в качестве носителя, и, более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей носитель, который является нерастворимым или малорастворимым в воде, вместе с соединением поливалентного металла в форме тонкоизмельченного порошка или в кристаллической форме, имеющим средний размер частиц 100 мкм или менее, и добавку для диспергирования и закрепления пептидного инкретина на поверхности носителя со средним размером частиц от 1 мкм до 20 мкм.

Средний размер частиц добавки представляет средний размер частиц нерастворимой в воде или малорастворимой в воде композиции крахмала на поверхности носителя, когда композицию изготавливают способом по настоящему изобретению с использованием включения крахмала с прежелатинизированным крахмалом или компонентами, включая прежелатинизированный крахмал.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, показывающий изменения в плазменных концентрациях GLP-1(7-36)NH₂ в примере 2 после подкожного введения.

Фиг.2 представляет собой график, показывающий изменения с течением времени в плазменных концентрациях GLP-1(7-36)NH₂ в примере 2 после назального введения композиций, не содержащих добавок.

Фиг.3 представляет собой график, показывающий изменения с течением времени в плазменных концентрациях GLP-1(7-36)NH₂ в примере 2 после назального введения композиций, не содержащих добавок, с использованием сукралфата в качестве носителя.

Фиг.4 представляет собой график, показывающий изменения с течением времени в плазменных концентрациях GLP-1(7-36)NH₂ в примере 2 после назального введения композиций, содержащих добавки.

ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано выше, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для назального всасывания, которая имеет высокую биодоступность и делает возможным назальное введение биологически активных полипептидов, имеющих изоэлектрическую точку 7 или ниже, которые демонстрируют низкую растворимость в кислом или нейтральном диапазоне рН и имеют тенденцию к агрегации, даже когда они растворены в растворе. Указанные полипептиды имеют низкую биодоступность и не подходят для перорального введения или введения посредством других неинъекционных путей. В одном конкретном, предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для назального всасывания, содержащей производные GLP-1, такие как GLP-1, амид GLP-1, GLP-1(7-36)NH₂, GLP-1(9-36)NH₂, GLP-1(9-37), GLP-1(7-37), [Val⁸]-GLP-1(7-36)NH₂, [Val⁸]-GLP-1(7-37), [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37) и GLP-2, эксендин-3, эксендин-4, глюкагон, желудочный ингибирующий пептид (GIP) или инсулин.

Высокая биодоступность фармацевтической композиции для назального всасывания по настоящему изобретению обеспечивается благодаря биологически активным полипептидам, диспергированным и закрепленным на поверхностях носителя стабильным и однородным образом с помощью добавки.

В случае использования бета- или частично прежелатинизированных, нерастворимых в воде или малорастворимых в воде крахмалов в качестве добавок, использование рисового крахмала и кукурузного крахмала с малым средним размером частиц может увеличить площадь поверхности и может улучшить элюирование, и, таким образом, может быть улучшено всасывание. Следовательно, добавки со средним размером частиц от 1 мкм до 20 мкм предпочтительно используются для улучшения всасывания по настоящему изобретению.

Таким образом, добавкой для использования в настоящем изобретении может быть любая добавка, которая позволяет биологически активному полипептиду диспергироваться и закрепляться на поверхностях носителя стабильным и однородным образом. Например, крахмалы, содержащие амилопектин и амилозу, как независимо, так и в определенной пропорции, могут быть использованы в качестве указанной добавки. Крахмалы, полученные из риса, кукурузы и т.п., обычно классифицируются на крахмалы "неклейкого рисового" типа, содержащие амилопектин и амилозу в соотношении приблизительно от 7:3 до 8:2, и крахмалы "клейкого рисового" типа, состоящие практически только из амилопектина. Конкретно, примеры добавок для использования в настоящем изобретении включают рисовую муку, рисовый крахмал, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, бета-крахмал, такой как рисовый бета-крахмал (неклейкого рисового типа), рисовый бета-крахмал (клейкого рисового типа), кукурузный бета-крахмал (неклейкого рисового типа), кукурузный бета-крахмал (клейкого рисового типа) и картофельный бета-крахмал (неклейкого рисового типа); прежелатинизированный рисовый крахмал (неклейкого рисового типа), прежелатинизированный рисовый крахмал (клейкого рисового типа), прежелатинизированный кукурузный крахмал (неклейкого рисового типа), прежелатинизированный кукурузный крахмал (клейкого рисового типа), прежелатинизированный картофельный крахмал (неклейкого рисового типа), прежелатинизированный пшеничный крахмал (неклейкого рисового типа) и их частично прежелатинизированный крахмал.

Несмотря на свою небольшую растворимость в воде, крахмалы можно желатинизировать нагреванием с водой, что вызывает утрату кристаллической структуры. Как полностью желатинизированный крахмал (прежелатинизированный крахмал или альфа-крахмал), так и частично прежелатинизированный крахмал можно использовать в качестве добавки по настоящему изобретению.

Рисовую муку изготавливают размалыванием белков рисовых семян, которые остаются после удаления из семян шелухи и зародышей. Рисовая мука содержит много крахмала и широко используется в пищу и в фармацевтических добавках. В настоящем изобретении рисовая мука, не прошедшая тепловую обработку, которая состоит из бета-крахмала, является предпочтительной по сравнению с прошедшей тепловую обработку рисовой мукой, содержащей прежелатинизированный крахмал (альфа-крахмал) или частично прежелатинизированный крахмал, однако прошедшую тепловую обработку рисовую муку можно также использовать. Одним примером предпочтительной рисовой муки является порошок Domyo-ji, содержащий прежелатинизированный рисовый крахмал. Кроме того, в настоящем изобретении можно использовать не только кукурузный крахмал, состоящий из бета-крахмала, но также частично прежелатинизированный или прежелатинизированный кукурузный крахмал (альфа-крахмал).

Помимо этого, в качестве добавки в назальных композициях по настоящему изобретению можно использовать смеси указанных крахмалов.

Также в качестве добавки в назальных композициях по настоящему изобретению можно использовать олигосахариды, карбоксивиниловый полимер, повидон, гидроксипропилцеллюлозу (НРС), ксантановую камедь, пектин, альгинат натрия, порошкообразную аравийскую камедь и желатин.

Биологически активные полипептиды, используемые в композиции для назального всасывания по настоящему изобретению, представляет собой такие полипептиды, которые имеют изоэлектрическую точку (pI) 7 или ниже. Указанные полипептиды обладают низкой растворимостью в кислом или нейтральном диапазоне рН и имеют тенденцию агрегировать, даже когда они растворены в растворе.

Примеры предпочтительных биологически активных полипептидов показаны ниже, вместе с соответствующими им изоэлектрическими точками:

GLP-1 (pI=5,05); амид GLP-1 (pI=5,47); GLP-1(7-36)NH₂ (pI=6,76); GLP-1(7-37) (pI=5,53); GLP-1(9-36)NH₂ (pI=4,68); GLP-1(9-37) (pI=4,87); [Val⁸]-GLP-1(7-36)NH₂ (pI=6,76); [Val⁸]-GLP-1(7-37) (pI=5,53); [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37) (pI=4,57); GLP-2 (pI=4,45); эксендин-3 (pI=4,96); эксендин-4 (pI=4,96); глюкагон (pI=6,75) и желудочный ингибирующий пептид (GIP) (pI=6,92); инсулин (pI=5,39).

Другие биологически активные полипептиды, которые можно вводить назально, также можно использовать; ниже приводятся примеры (далее pI обозначает изоэлектрическую точку, М.м. обозначает молекулярную массу, и все соединения получены от людей, за исключением эксендина-3 и эксендина-4):

кальцитонин (pI: 6,72, М.м.: 3420,88), катакальцин (pI: 5,26, М.м.: 2436,62), холецистокинин-12 (pI: 3,93, М.м.: 1535,71), холецистокинин-8 (pI: 3,56, М.м.: 1064,20), предшественник кортикотропина-липотропина (pI: 5,22, М.м.: 8469,32), кортикотропиноподобный промежуточный пептид (pI: 3,91, М.м.: 2309,51), липотропин-β (pI: 6,17, М.м.: 9805,94), липотропин-γpI: 4,66, М.м.: 6074,57), меланотропин-β (pI: 5,57, М.м.: 2204,40), кортиколиберин (pI: 5,09, М.м.: 4758,49), эндотелин-1 (pI: 4,54, М.м.: 2495,94), эндотелин-2 (pI: 4,54, М.м.: 2550,9), эндотелин-3 (pI: 5,38, М.м.: 2647,09), пептид, связанный с галаниновым сигналом (pI: 4,49, М.м.: 6671,52), гастрин-71 (pI: 5,17, М.м.: 8066,88), гастрин-34 (pI: 4,25, М.м.: 3867,26), гастрин-17 (pI: 3,40, М.м.: 2116,24), желудочный ингибирующий пептид (pI: 6,92, М.м.: 4983,59), полипептид, связанный с глицентином (pI: 4,13, М.м.: 3384,50), глюкагон (pI: 6,75, М.м.: 3482,79), глюкагоноподобный пептид-1 (pI: 5,05, М.м.: 4167,02), амид глюкагоноподобного пептида-1 (pI: 5,47, М.м.: 4111,50), амид глюкагоноподобного пептида-1(7-36) (pI: 6,76, М.м.: 3297,68), глюкагоноподобный пептид-1(7-37) (pI: 5,53, М.м.: 3355,71), амид [Val⁸]-глюкагоноподобного пептида-1(7-36) (pI: 6,76, М.м.: 3326,74), [Val⁸]-глюкагоноподобный пептид-1(7-37) (pI: 5,53, М.м.: 3383,87), [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37) (pI: 4,57, М.м.: 3751,2), GLP-1(9-36)NH₂ (pI: 4,68, М.м.: 2933,2), GLP-1(9-37) (pI: 4,87, М.м.: 3090,4), глюкагоноподобный пептид-2 (pI: 4,21, М.м.: 3922,35), эксендин-3 (pI: 4,96, М.м.: 4202,63), эксендин-4 (pI: 4,96, М.м.: 4186,60), β-цепь инсулина (pI: 6,90, М.м.: 3429,96), α-цепь инсулина (pI: 3,79, М.м.: 2383), инсулин (pI: 5,39, М.м.: 5807,6), прогонадолиберин-I (pI: 5,63, М.м.: 7893,83), гонадолиберин-II (pI: 6,92, М.м.: 1254,33), пептид-I, связанный с гонадолиберином (pI: 4,67, М.м.: 6370,11), нейромедин С (pI: 6,92, М.м.: 1121,28), А-цепь инсулиноподобного белка (INSL) (pI: 6,36, М.м.: 3542,16), пептид Е, связанный с мотилином (pI: 4,72, М.м.: 7433,47), лейцин-энкефалин (pI: 5,52, М.м.: 555,63), метионин-энкефалин (pI: 5,52, М.м.: 573,66), лейморфин (pI: 6,21, М.м.: 3351,68), окситоцин (pI: 5,51, М.м.: 1010,19), нейрофизин-1 (pI: 4,94, М.м.: 9600,88), нейрофизин-2 (pI: 5,05, М.м.: 9787,07), копептин (pI: 4,11, М.м.: 4021,46), нейромедин В (pI: 6,74, М.м.: 1133,29), нейромедин N (pI: 5,52, М.м.: 617,79), нейропептид Y (pI: 6,76, М.м.: 4272,72), нейропептид AF (pI: 6,05, М.м.: 1979,18), пептид, связанный с PACAP (pI: 5,38, М.м.: 4800,32), панкреатический гормон (pI: 6,26, М.м.: 4182,74), панкреатический икозапептид (pI: 6,01, М.м.: 2235,44), пептид YY (pI: 6,77, М.м.: 4310,80), тиролиберин (pI: 6,74, М.м.: 380,40), нейрохинин А (pI: 6,74, М.м.: 1134,32), урокортин (pI: 5,58, М.м.: 4697,29), уротензин II (pI: 4,37, М.м.: 1390,59), кишечный пептид (РНМ-27) (pI: 6,75, М.м.: 2986,43) и кишечный пептид-42 (pI: 6,76, М.м.: 4552,18).

Помимо описанных выше, композицией по настоящему изобретению может быть любой биологически активный пептид, который можно вводить назально.

В настоящем изобретении носитель для биологически активного полипептида и добавки включает носители, нерастворимые или малорастворимые в воде. Например, можно использовать соединения поливалентного металла с валентностью 2 или выше, выбранные из соединений алюминия, соединений кальция, соединений магния, соединений кремния, соединений железа или соединений цинка.

Конкретно, примеры каждого типа соединений поливалентного металла приводятся ниже.

Соединение алюминия включает высушенный гель гидроксида алюминия, хлоргидроксиалюминий, синтетический силикат алюминия, легкий оксид алюминия, коллоидный водный силикат алюминия, гидроксид алюминия-магния, гидроксид алюминия, гель гидроксида алюминия, сульфат алюминия, дигидроксиацетат алюминия, стеарат алюминия, природный силикат алюминия, моностеарат алюминия и сульфат алюминия-калия.

Соединение кальция включает апатит, гидроксиапатит, карбонат кальция, динатрий-эдетат кальция, хлорид кальция, цитрат кальция, глицерофосфат кальция, глюконат кальция, силикат кальция, оксид кальция, гидроксид кальция, стеарат кальция, третичный фосфат кальция, лактат кальция, пантотенат кальция, олеат кальция, пальмитат кальция, D-пантотенат кальция, альгинат кальция, безводный фосфат кальция, гидрофосфат кальция, дигидрофосфат кальция, ацетат кальция, сахарат кальция, сульфат кальция, моногидрофосфат кальция, пара-аминосалицилат кальция и биологически кальцифицированные соединения.

Соединение магния включает L-аспартат магния, хлорид магния, глюконат магния, алюмосиликат магния, силикат магния, оксид магния, гидроксид магния, стеарат магния, карбонат магния, алюмометасиликат магния, сульфат магния, силикат магния-натрия и синтетический силикат магния-натрия.

Соединение кремния включает водный диоксид кремния, легкую безводную кремниевую кислоту, синтетический гидротальцит, диатомит и диоксид кремния. Соединение железа включает сульфат железа. Соединение цинка включает хлорид цинка, стеарат цинка, оксид цинка и сульфат цинка.

Указанные соединения поливалентных металлов можно использовать как индивидуально, так и в виде смеси двух или более соединений. Из соединений поливалентных металлов соединения кальция, такие как гидроксиапатит, карбонат кальция или лактат кальция, давали благоприятные результаты.

Если средний размер частиц соединения поливалентного металла слишком велик, то распыление соединения ухудшается, а частицы быстро осаждаются. Наоборот, если средний размер частиц слишком мал, то частицы с трудом задерживаются в носовой полости и вдыхаются в бронхи и легкие. Таким образом, предпочтительно чтобы соединение поливалентного металла имело средний размер частиц от 10 до 100 мкм, более предпочтительно от 20 до 60 мкм, так что соединение металла может эффективно оставаться в носовой полости.

Несмотря на то что количество биологически активного полипептида в композиции по настоящему изобретению для получения эффективной дозы полипептида может варьироваться в зависимости от многих факторов, включая тип выбранного активного вещества, тип заболевания, по поводу которого проводится лечение, желаемое количество введений, возраст пациентов, вес тела, тяжесть симптомов, путь введения, желательные эффекты и другие факторы, предпочтительно, чтобы в случае, например, амида GLP-1(7-36) композицию по настоящему изобретению вводили назально в такой дозе, которая может доставить от 50 до 5000 мкг амида GLP-1(7-36).

Конкретно, эффективную дозу биологически активного полипептида в сухом виде смешивают с носителем (например, соединением поливалентного металла, включая соединение кальция, соединение алюминия, соединения магния, соединение кремния, соединение железа и соединение цинка) и добавкой. Носитель, нерастворимый или малорастворимый в воде, берут в форме порошка или в кристаллической форме, и он имеет средний размер частиц 250 мкм или менее предпочтительно 100 мкм или менее, и более предпочтительно от 20 до 60 мкм. Альтернативно, компоненты можно во влажном состоянии смешивать друг с другом в воде или в органическом растворителе, таком как этанол, а затем высушивать. При таких способах биологически активный полипептид однородно диспергируется и закрепляется на поверхностях носителя, в результате чего получают фармацевтическую композицию для назального всасывания по настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция для назального всасывания по настоящему изобретению вполне может содержать носители, которые широко используются для изготовления лекарственных средств, включая смазывающий агент, ингибитор DPP-IV, наполнитель, загуститель, поддерживающее вещество, стабилизатор, антиоксидант, связывающий агент, разрыхлитель, увлажнитель, окрашивающий агент, отдушку, корригент, суспендирующий агент, эмульгатор, солюбилизирующий агент, буферный агент, агент, обеспечивающий изотоничность, поверхностно-активный агент, смягчающий агент и различные другие функциональные компоненты.

Смазывающий агент включает стеарат кальция, стеарат магния, стеарат алюминия, стеариновую кислоту и тальк.

Стабилизатор включает четвертичные аммониевые соли, такие как хлорид бензалкония, хлорид бензетония, хлорид цетилпиридиния, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (Tween 80), и сложные эфиры сорбитана и жирных кислот, такие как моноолеат сорбитана (Span 80).

В случае, когда используется кислый биологически активный полипептид, такой как GLP-1, который является чувствительным к разложению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция содержала ингибитор DPP-IV.

Примеры ингибитора DPP-IV включают дипротин А, бацитрацин и тиазолидид изолейцина. В то время как добавленное количество ингибитора DPP-IV может варьироваться в зависимости от ингибирующей активности каждого ингибитора, его можно добавлять в фармацевтическую композицию в количестве, составляющем приблизительно от 1 до 10000 величин массы биологически активного полипептида или активного ингредиента.

При изготовлении композиции по настоящему изобретению количество биологически активного полипептида предпочтительно составляет от 0,005 до 50%, более предпочтительно от 0,01 до 20% и еще более предпочтительно от 0,1 до 10,0% если принимать массу препарата за 100%. Количество носителя в композиции по настоящему изобретению может представлять собой любое количество, подходящее для клинического использования, и составляет, например, от 70 до 99,995%, предпочтительно от 80 до 99,99%, еще более предпочтительно от 90 до 99,9%, если принимать массу препарата за 100%. Если количество носителя находится в указанных пределах, можно добиться лучшего назального всасывания. Количество добавки в композиции по настоящему изобретению составляет, например, от 0,005 до 50%, предпочтительно от 0,01 до 20%, более предпочтительно от 0,05 до 10,0%, если принимать массу препарата за 100%.

Фармацевтическую композицию для назального всасывания по настоящему изобретению можно изготавливать смешиванием соединения поливалентного металла в качестве носителя, который является нерастворимым или малорастворимым в воде, биологически активного полипептида и добавки. В одном примере порошок GLP-1(7-36)NH₂, служащий в качестве пептидного компонента, тщательно смешивают с кукурузным крахмалом. Смесь затем помещают в контейнер, в который постепенно добавляют карбонат кальция вместе с малыми количествами очищенной воды, чтобы получить суспензию. Суспензию сушат в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении. Высушенные продукты фильтруют через сито и, если это желательно, примешивают нужное количество стеарата кальция. В результате получают фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.

Фармацевтическую композицию для назального всасывания по настоящему изобретению можно также изготавливать сначала получением суспензии кукурузного крахмала и карбоната кальция, добавленного вместе с малыми количествами очищенной воды. Смесь затем помещают в контейнер, в который постепенно добавляют порошок GLP-1(7-36)NH₂, и разминают с водой, содержащей хлорид бензалкония. Смесь сушат и фильтруют, а затем примешивают должное количество стеарата кальция. В результате также получают фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.

Должными количествами полученной фармацевтической композиции для назального всасывания наполняют капсулы, изготовленные из гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМС), крахмала или желатина, и капсулы должным образом упаковывают предпочтительно в герметичную упаковку. Предпочтительной герметичной упаковкой является комбинация блистерной упаковки и упаковки из алюминиевой фольги. Если это необходимо, в мешочек из алюминиевой фольги можно помещать дессикант. Желательно осуществлять весь процесс при влажности 60% или менее.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение далее описывается более подробно с помощью примеров, которые не предназначены для какого бы то ни было ограничения объема настоящего изобретения.

Если не указано иное, в примерах используются способы и оборудование для испытаний, описанные ниже.

Основные сокращения, используемые в настоящем описании, имеют следующие значения

FmocфлуоренилметоксикарбонилBocтрет-бутоксикарбонилTrtтритилPmcпентаметилхромансульфонилDCCдициклогексилкарбодиимидHOBtN-гидроксибензотриазолTFAтрифторуксусная кислотаDIPEAдиизопропилэтиламинDMFдиметилформамидNMPN-метилпирролидонTFEтрифторэтанол

1. Пептидный анализ с использованием ВЭЖХ

Следующее оборудование и условия используются для выполнения ВЭЖХ с обращенной фазой, чтобы определить содержание пептидов в препаратах и для целей пептидного анализа в тесте на стабильность.

Инструмент:Система SHIMADZU LC-9AКолонка:YMC-PROTEIN-RP (диаметр 4,6 мм × 150 мм)Температура колонки:40°СЭлюент:ацетонитрил в 0,1% трифторуксусной кислоте,
с линейным изменением концентрации
ацетонитрила в течение 10 минутСкорость потока:1 мл/минОбнаружение:УФ (214 нм)Загружаемый объем:50 мкл

2. Масс-спектрометрия

Массу пептида определяли с использованием следующего оборудования и условий.

Инструмент:Finnigan MAT TSQMSИсточник ионов:ESIСпособ обнаружения ионов:положительныйНапряжение распыления:4,5 кВКапиллярная температура:250°СПодвижная фаза:смесь 0,2% уксусная кислота/метанол (1:1)Скорость потока:0,2 мл/минПределы сканирования:m/z от 550 до 850

3. Анализ аминокислотной последовательности

Следующий инструмент использовали для анализа аминокислотных последовательностей пептида:

Инструмент: секвенатор Perkin Elmer 477A

4. Анализ аминокислотного состава

Следующий инструмент использовали для анализа аминокислотного состава пептида:

Инструмент: анализатор аминокислот Hitachi L-8500

5. Сохранение образцов (тест на стабильность)

Образцы хранили в следующем термостате при следующих температурных условиях:

Инструмент:Nagano Science LH-30-14Температурные режимы:40±2°С, 25±1°С

6. Лиофильная сушка

Инструмент: использовали FZ-6, LABCONCO Corp.

7. Измерение концентрации в плазме

После введения фармацевтической композиции концентрацию GLP-1(7-36)NH₂ в плазме измеряли с помощью радиоиммунного анализа (RIA) или твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

7-1. Радиоиммунный анализ (RIA)

Кролика сенсибилизировали комбинированным адъювантом GLP-1(7-36)NH₂ и тироглобулина крупного рогатого скота, чтобы получить антисыворотку (фракцию IgG). Плазму помещали в тест-пробирку вместе с кроличьим антителом против GLP-1(7-36)NH₂, полученным из антисыворотки, и смесь оставляли стоять в течение ночи при 4°С. Затем добавляли ¹²⁵I-GLP-1(7-36)NH₂ и смесь оставляли стоять в течение ночи при 4°С. Затем добавляли антикроличьи IgG козьей сыворотки и смесь оставляли стоять в течение 1 часа при 4°С. Полученный образец центрифугировали и измеряли радиоактивность (гамма-лучи) осадка с помощью гамма-сетчика.

7-2. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)

Антитело против GLP-1(7-36)NH₂ (поликлональное антитело кролика) иммобилизировали на 96-луночном планшете. В планшет добавляли плазму и реакции позволяли протекать в течение 2 часов. После промывания планшета добавляли антитело против GLP-1(7-36)NH₂ (поликлональное антитело мыши), меченное пероксидазой хрена, и реакции позволяли протекать в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания планшета для реакции добавляли тетраметилбензидин. Измеряли поглощение на 450 нм.

8. Расчет изоэлектрических точек (pI) биологически активных полипептидов

Использовали сервер ExPASy (Expert Protein Analysis System) Molecular Biology Server, Швейцарский институт биоинформатики. Для расчета С-концевых амидов один из остатков Asp или Glu в последовательности заменяли на Asn или Gln.

9. Синтез пептида (инкретинового пептида)

Используя синтезатор 433А (ABI Corporation), синтезировали защищенный пептидный полимер согласно FastFmoc (0,25 ммоль) стандарта ABI.

10. Распределение размеров продукта (измерение размеров частиц карбоната кальция и крахмала)

Инструмент: использовали анализатор Laser Diffraction Analyser (RODOS SR), SYMPATEC HELOS & RODOS Corp.

Ссылочный пример 1: Получение GLP-1(7-36)NH₂

Получали экспрессионную плазмиду pG97ompPR для экспрессии слитого белка, состоящего из производного β-глактозидазы Escherichia coli (β-gal 97), линкера длиной 25 аминокислот и GLP-1(7-37) (международная патентная публикация № WO99/38984). Линкерная область экспрессируемого слитого белка включает мотив расщепления для ompT протеиназы (Arg-Arg) и мотив расщепления для Kex2 протеиназы (Pro-Arg) и расщепляется протеиназами в соответствующих областях расщепления.

Для того, чтобы получить слитый белок, pG97ompPR вводили в штамм Escherichia coli, происходящий от штамма W3110. Полученные трансформанты инкубировали в среде для роста, содержащей дрожжевые экстракты, неорганические соли и глюкозу, в 300 л инкубаторе. Клетки инкубировали до тех пор, пока концентрация бактерий не достигала ОП660=180. Полученный культуральный раствор обрабатывали в гомогенизаторе под высоким давлением для разрушения клеточных тел, а затем центрифугировали для сбора тел включения. Осадок, содержащий тело включения, ресуспендировали в деионизированной воде и центрифугировали для промывания тел включения, а затем ресуспендировали в деионизированной воде для получения конденсата (около 30 л) тел включения с ОП660=1000.

К 3,9 л конденсата тел включения добавляли 1 л 1 М Tris-HCl с недоведенным рН вместе с 10 л 8 М мочевины. Затем добавляли деионизированную воду до конечного объема 20 л. рН полученного раствора доводили до 6,5 с помощью 5 н. хлористоводородной кислоты и раствор держали при 37°С в течение 2 часов, чтобы позволить OmpT-протеиназе Escherichia coli, присутствующей в теле включения, действовать на слитый белок, отщепляя GLP-1(7-37), имеющий 13 аминокислот, добавленных к его N-концу (далее упоминается как RHHGP[G]). По окончании реакции к реакционной смеси добавляли порошкообразную мочевину до концентрации 7 М и рН доводили до 8,0 с помощью 5 н. NaOH. Реакционную смесь затем фильтровали под давлением с получением 30 л надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость загружали на колонку с SP-Sepharose Big Beads (140 мм внутренний диаметр × 160 мм, Amersham Pharmacia Biotechnology), уравновешенную раствором 5 М мочевина/20 мМ Tris-HCl (рН 8,0)/0,1% Tween 80, а затем промывали раствором 0,2 М NaCl/20 мМ Tris-HCl (рН 8,0)/0,1% Tween 80. Затем RHHGP[G] элюировали раствором 0,5 М NaCl/20 мМ Tris-HCl (рН 8,0)/0,1% Tween 80 и в результате получали фракцию (около 20 л), содержащую приблизительно 100 г RHHGP[G].

С использованием очищенной воды (UF вода) полученную фракцию RHHGP[G] доводили до 5,0 мг/мл. К раствору добавляли 20 мМ ацетата натрия (рН 5,2), 5,0 мкМ сульфата меди, 0,5 г/л аскорбиновой кислоты, 1 мг/л каталазы, 0,1% Tween 80 и 1500 единиц/мл фермента амидирования. Затем реакцию оставляли протекать при 32°С в течение 80 минут, при продувании раствора кислородом для поддержания концентрации растворенного кислорода на уровне 100%. В результате С-конец RHHGP[G] был амидирован с образованием амидной формы (RHHGP-1). К раствору добавляли Tris-HCl (рН 8,0), Tween 80, хлорид кальция и Kex2-протеиназу до конечных концентраций 20 мМ, 0,1%, 1 мМ и 8000 ЕД/мл соответственно и реакцию оставляли протекать при 32°С в течение двух с половиной часов.

13 аминокислот удаляли с N-конца RHHGP-1 с получением свободного GLP-1(7-36)NH₂. Приблизительно 10 л часть (3,4 г/л) полученного раствора разбавляли (до 26 л) 0,3% Tween 80/20 мМ буфером (рН 4,5) Briton Robinson (далее упоминается как BR) и загружали на колонку для катионообменной хроматографии (внутренний диаметр 90 мм × 400 мм, MacroPrep High-S, Biorad), уравновешенную раствором 20 мМ NaCl/0,3% Tween 80/20 мМ буфер BR (рН 4,5). После промывания тем же раствором GLP-1(7-36)NH₂ элюировали раствором А (20 мМ буфер BR (рН 6,0)/20 мМ NaCl/0,3% Tween 80) и раствором В (20 мМ буфер BR (рН 7,5)/20 мМ NaCl/0,3% Tween 80), в то время как доля раствора В в элюенте линейно изменялась от 50% до 100% с получением линейного градиента.

Полученную фракцию с чистотой 98% или выше разбавляли UF водой до концентрации GLP-1(7-36)NH₂ 6 мг/мл и загружали на колонку Prep C18 (внутренний диаметр 90 мм × 240 мм) (Waters), уравновешенную 20 мМ ацетатом натрия (рН 4,5). После промывания 10% раствором ацетонитрила, содержащим 20 мМ ацетата натрия (рН 4,5) и 0,2% уксусной кислоты, GLP-1(7-36)NH₂ элюировали 30% раствором ацетонитрила, содержащим 2% уксусной кислоты, с получением раствора (2,5 л), содержавшего 27 г GLP-1(7-36)NH₂. В испарителе ацетонитрил удаляли из элюата, а концентрацию GLP-1(7-36)NH₂ доводили до 10 мг/мл водой для инъекций. Раствор затем подвергали лиофильной сушке в аппарате для лиофильной сушки RL-903BS (Kyowa Vacuum Engineering Co., Ltd.) с получением 22 г лиофилизированного продукта GLP-1(7-36)NH₂.

Полученный продукт имел следующую молекулярную массу и аминокислотный состав и был, таким образом, идентифицирован как GLP-1(7-36)NH₂. ESI-MS: 3297,4 (теоретическая величина: 3297,68). Аминокислотный состав Leu standard после гидролиза 6 н. хлористоводородной кислотой: Asp: 1,0 (1), Thr: 2,0 (2), Ser: 2,7 (3), Glu: 4,0 (4), Gly: 3,0 (3), Ala: 4,1 (4), Val: 2,0 (2), Ile: 1,0 (1), Leu: 2,0, Tyr: 1,0 (1), Phe: 2,1 (2), Lys: 2,0 (2), His: 1,0 (1), Arg: 1,0 (1).

Ссылочный пример 2: Тест на назальную абсорбируемость раствора фармацевтической композиции GLP-1(7-36)NH₂ с использованием крыс

Приблизительно 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, полученного в ссылочном примере 1, 180 мг сахарозы, 8 мг безводной лимонной кислоты и 0,2 мг хлорида бензалкония растворяли в 2 мл воды с получением тест-раствора с концентрацией 5 мг/мл по результатам ВЭЖХ с обращенной фазой. Самцов крыс SD в возрасте 7-9 недель и с весом тела около 250 г (Crj: CD, Charles River Japan Inc.) содержали в металлической клетке с циклом день/ночь по 12 часов, при поддержании температуры на уровне 22±5°С и влажности от 30 до 70%. Крысы имели свободный доступ к твердому корму и водопроводной воде и голодали в течение 24 часов перед испытанием (3 животных на группу).

Для назального введения под наркозом пентобарбиталом в бедренную артерию помещали катетер и 5 мкл тест-раствора вводили в левую носовую полость с помощью мерной пипетки (приблизительно 100 мкг/кг). Кровь отбирали в пробирку, содержащую антикоагулянт и ингибитор ферментов, через 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60 и 90 минут после введения и центрифугировали для получения плазмы. Концентрацию GLP-1(7-36)NH₂ в плазме измеряли посредством RIA с использованием антитела против GLP-1(7-36)NH₂. Для подкожного введения тест-раствор для подкожного введения (приблизительно 15 мкг/мл) вводили под кожу на спине крысы с помощью шприца в дозе 1 мл/кг. Концентрацию GLP-1(7-36)NH₂ в плазме измеряли таким же способом, как при назальном введении. Результаты показаны в таблице 1 ниже.

Таблица 1
Назальное всасывание раствора фармацевтической композиции GLP-1(7-36)NH₂ (у крыс)Путь введенияДоза (мкг/кг)Cmax (нг/мл)AUC (нг·ч/мл)Биодоступность (%)Назальный97±14,70±3,282,47±1,4411,2±6,5Подкожный156,68±0,863,82±0,58(100)Среднее ± СО (n=3)

Как можно видеть из представленных выше результатов, биодоступность составляла 11,2±6,5% (среднее ± СО, n=3), что указывает на эффективное всасывание GLP-1(7-36)NH₂ со слизистой оболочки носовой полости.

Ссылочный пример 3: Стабильность раствора фармацевтической композиции с GLP-1(7-36)NH₂

Тест-раствор GLP-1(7-36)NH₂, приготовленный в ссылочном примере 2, хранили при 25°С и 40°С.

Результаты показаны в таблице 2 ниже. Как можно видеть из представленных результатов, образование малых частиц наблюдалось через одну неделю при каждом из температурных режимов.

Таблица 2
Стабильность водного раствора GLP-1(7-36)NH₂ в 0,4% уксусной кислотеВремяОценка25°С40°СИсходноОставшаяся доля(100)(100)Внешний видПрозрачный и бесцветныйПрозрачный и бесцветныйрН2,802,80Неделя 1Оставшаяся доля94,285,4Внешний видОбразование мелкозернистых частицОбразование мелкозернистых частицрН2,782,78Неделя 2Оставшаяся доля88,577,3Внешний видОбразование мелкозернистых частицЖелатинизированныйрН2,782,71Концентрация пептида: 5 мг/мл
0,4% безводная лимонная кислота
9% сахароза
0,01% хлорид бензалкония

Несмотря на то что результаты ссылочного примера 2 показывают, что раствор фармацевтической композиции, содержащей GLP-1(7-36)NH₂, обладает способностью назального всасывания у крыс, физико-химическая стабильность раствора является низкой, когда раствор имеет рН около 2,7. Соответственно, раствор фармацевтической композиции является непригодным, когда он имеет указанную величину рН.

Ссылочный пример 4: Стабильность раствора GLP-1(7-36)NH₂

1000 мл раствора А готовили добавлением дистиллированной воды к смеси 3,92 г фосфорной кислоты, 2,40 г уксусной кислоты, 14,91 г хлорида калия и 2,47 г борной кислоты, а 1000 мл раствора В готовили добавлением воды к 8,0 г гидроксида натрия. Раствор В по каплям добавляли к раствору А для получения 100 мл буферных растворов (буфер Britton Robinson (BR)) с соответственными значениями рН 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 и 9,0.

Тем временем приблизительно 300 мг GLP-1(7-36)NH₂, приготовленного в ссылочном примере 1, растворяли в 30 мл дистиллированной воды. Раствор (10 мг/мл) разделяли на 2,0 мл аликвоты и буферы BR и 0,1 М хлористоводородную кислоту индивидуально добавляли к аликвотам с получением 20 мл тест-растворов. Образцы затем хранили в термостате при 40°С в течение 1, 4 и 7 дней, наблюдали за внешним видов образцов и определяли оставшиеся доли GLP-1(7-36)NH₂. Результаты показаны в таблице 3 ниже.

Таблица 3
Стабильность водного раствора GLP-1(7-36)NH₂ при различных значениях рН pH1,22,03,04,05,06,07,09,0ИсходноОставшаяся доля100100100100100100100100Внешний видС.С.С.С.С.С.С.С.С.С.С.С.С.С.С.С.День 1Оставшаяся доля61,74,933,899,498,527,465,295,9Внешний видР.Р.Р.Р.Р.Р.С.С.С.С.Р.Р.Р.Р.С.С.День 2Оставшаяся доля23,12,50,997,444,026,054,184,3Внешний видР.Р.Р.Р.Р.Р.С.С.Р.Р.Р.Р.Р.Р.С.С.День 7Оставшаяся доля24,43,40,329,434,426,452,075,6Внешний видР.Р.Р.Р.Р.Р.Р.Р.Р.Р.Р.Р.Р.Р.С.С.С.С.: прозрачный и бесцветный
Р.Р.: частично осажденный
Концентрация пептида: 1 мг/мл
Температура: 40°С
рН 1,2: 0,1 М хлористоводородная кислота
рН 2,0 ˜ рН 9,0: буфер Briton-Robinson (мк=0,2)
Оставшаяся доля: доля, собранная из надосадочной жидкости

Как показано в таблице 3, осадки образовывались спустя один день в образцах с рН 1,2, 2,0, 3,0, 6,0 и 7,0, спустя 4 дня - в образце с рН 5,0 и спустя 7 дней - в образце с рН 4,0. В то время как в образце с рН 9,0 осадки не образовывались, оставшаяся доля GLP-1(7-36)NH₂ уменьшалась до 75,6% спустя семь дней. Таким образом, было показано, что GLP-1(7-36)NH₂ демонстрирует относительно низкую стабильность в любом из кислых, нейтральных или основных растворов и, следовательно, не подходит для использования в растворах фармацевтической композиции.

С учетом данной точки зрения, на абсорбируемость испытывали порошкообразные препараты композиции для назального введения, альтернативу фармацевтической композиции в виде раствора.

Пример 1: Тест на абсорбируемость порошкообразного препарата для назального введения с использованием собак

Композиции для назального всасывания готовили добавлением различных добавок, как описано в следующих примерах приготовления с 1 по 9, к смеси GLP-1(7-36)NH₂, полученного в ссылочном примере 1, и мелкозернистого порошка карбоната кальция со средним размером частиц 50 мкм в качестве носителя.

В качестве контроля готовили один образец композиции для назального введения, не содержащий добавки.

Использовали 3 собак породы бигль, с весом тела около 10 кг каждая, и фармацевтические композиции для назального всасывания, описанные в примерах приготовления с 1 по 9, назально вводили с помощью ингалятора для порошков. Концентрацию GLP-1(7-36)NH₂ в плазме измеряли через 0, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90 и 120 минут после введения. В качестве контроля вводили мелкозернистый порошок GLP-1(7-36)NH₂ с использованием носителя карбоната кальция, не содержащий добавки. Концентрации GLP-1(7-36)NH₂ в плазме измеряли посредством RIA с использованием антитела против GLP-1(7-36)NH₂. Биодоступность рассчитывали сравнением площади под кривой (AUC) после назального введения с AUC после подкожного введения GLP-1(7-36)NH₂ в физиологическом растворе. Результаты показаны в таблице 4 ниже.

Таблица 4
Оценка назального препарата на собакахДобавкиДоза (мкг/кг)Cmax (нг/мл)Tmax (мин)Т_1/2 (часы)AUC_0--∞ (нг·ч/мл)Биодоступность (%)Без добавки ¹⁾83,9±3,92,65±1,726,7±2,90,43±0,461,09±0,224,3±1,01% порошок Domyo-ji58,7±2,32,53±0,7316,7±5,80,59±0,362,35±1,6613,4±10,10,1% кукурузный крахмал74,6±7,53,87±1,2211,7±7,60,58±0,412,62±1,0111,4±3,91% кукурузный крахмал58,4±2,82,78±1,9910,0±0,00,48±0,302,47±2,2013,7±11,80,1% прежелатинизированный картофельный крахмал неклейкого рисового типа80,1±3,22,26±0,0713,5±5,80,59±0,402,28±1,129,5±5,01% прежелатинизированный картофельный крахмал неклейкого рисового типа52,3±5,72,64±0,8513,3±0,00,33±0,191,40±0,638,8±4,11% повидон52,9±2,41,96±1,1310,0±0,00,24±0,070,91±0,465,6±2,71% пектин53,3±2,82,57±1,0716,7±11,50,44±0,281,05±0,536,6±3,51% частично прежелатинизированный кукурузный крахмал неклейкого рисового типа49,7±4,31,98±1,6716,7±11,50,44±0,131,24±0,918,3±6,2Подкожное введение5020,35±3,4815,0±0,00,39±0,205,15±5,131001) носитель карбонат кальция
Среднее ± СО (n=3)

Как можно видеть из приведенных выше результатов, биодоступность не содержащей добавки фармацевтической композиции составляла приблизительно 4%, в то время как введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению улучшало всасывание GLP-1(7-36)NH₂ и обеспечивало повышенную биодоступность приблизительно от 6% до 14%.

Пример приготовления 1: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей порошок Domyo-ji (1,0%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 31 мг порошка Domyo-ji. Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 2,92 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (29 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,83 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 226 мг) порошкообразного образца, содержащим 690 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 2: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей кукурузный крахмал (0,1%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 3,5 мг кукурузного крахмала (фармакопея Японии: средний размер частиц = 13,3 мкм). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 2,96 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (28 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,75 г порошкообразного образца. Количеством (приблизительно 297 мг) порошкообразного образца, содержащим 1000 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 3: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей кукурузный крахмал (1,0%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 32 мг кукурузного крахмала (фармакопея Японии: средний размер частиц = 13,3 мкм). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 2,93 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (29 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,89 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 213 мг) порошкообразного образца, содержащим 678 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 4: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей прежелатинизированный картофельный крахмал неклейкого рисового типа (0,1%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 3,2 мг прежелатинизированного картофельного крахмала неклейкого рисового типа (AMYCOL HF, NIPPON STARCH CHEMICAL Co., Ltd.). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 2,96 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (28 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,75 г порошкообразного образца. Количеством (приблизительно 297 мг) порошкообразного образца, содержащим 1000 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 5: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей прежелатинизированный картофельный крахмал неклейкого рисового типа (1,0%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 30 мг прежелатинизированного картофельного крахмала неклейкого рисового типа (AMYCOL HF, NIPPON STARCH CHEMICAL Co., Ltd.). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 2,92 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (27 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,77 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 217 мг) порошкообразного образца, содержащим 661 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 6: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей повидон (1,0%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 32 мг повидона К30 (японские стандарты фармацевтических добавок). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 2,93 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (29 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,84 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 211 мг) порошкообразного образца, содержащим 642 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 7: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей пектин (1,0%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 31 мг пектина (USP). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 2,93 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (29 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,88 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 210 мг) порошкообразного образца, содержащим 644 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 8: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей прежелатинизированный кукурузный крахмал неклейкого рисового типа (1,0%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 31 мг прежелатинизированного кукурузного крахмала неклейкого рисового типа (PCS, ASAHI KASEI Co., Ltd). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 2,92 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (28 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,88 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 211 мг) порошкообразного образца, содержащим 646 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 9: Приготовление фармацевтической композиции, не содержащей добавки

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30 мг GLP-1(7-36)NH₂, помещали в химический стакан и постепенно добавляли 8,88 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (87 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 8,76 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 300 мг) порошкообразного образца, содержащим 937 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример 2: Тест на абсорбируемость порошкообразного препарата для назального введения с использованием обезьян cynomolgus (тест-1)

GLP-1(7-36)NH₂, полученный в ссылочном примере 1, использовали в качестве биологически активного полипептида, а в качестве носителя использовали мелкозернистый порошок карбоната кальция или алюминиевой соли сульфата сахарозы (сукралфата) со средним размером частиц 51,9 мкм. Согласно процедурам, описанным в примерах приготовления с 10 по 18, готовили различные фармацевтические композиции для назального всасывания, которые содержали различные добавки, закрепленные на носителе. Дозу GLP-1(7-36)NH₂ подбирали таким образом, чтобы за один раз животному вводилось приблизительно 100 мкг GLP-1(7-36)NH₂. Каждую добавку добавляли в фармацевтическую композицию в количествах 0,5%, 1,0%, 10% и 50% по отношению к общей массе препарата. В качестве контролей готовили две не содержащие добавки композиции, одну, содержавшую карбонат кальция и GLP-1(7-36)NH₂, и другую, содержавшую сукралфат и GLP-1(7-36)NH₂.

Используя назальный ингалятор производства UNISIA JECS Co., Ltd., композиции примеров приготовления с 10 по 18 индивидуально вводили обезьянам cynomolgus, каждая весом приблизительно 3 кг, в носовые полости, и концентрации GLP-1(7-36)NH₂ в плазме измеряли посредством RIA и, частично, ELISA через 0, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90 и 120 минут после введения. Биодоступность определяли сравнением AUC после назального введения с AUC после подкожного введения.

Фиг.1, 2 и 3 показывают кривые зависимости от времени концентрации в плазме GLP-1(7-36)NH₂ после подкожного введения GLP-1(7-36)NH₂ в физиологическом растворе и после интраназального введения двух не содержащих добавку композиций соответственно. Фиг.4 показывает кривые зависимости от времени концентрации в плазме GLP-1(7-36)NH₂ после интраназального введения соответствующих назальных композиций, содержавших 1% порошка Domyo-ji, 0,5% кукурузного крахмала или 0,5% прежелатинизированного картофельного крахмала неклейкого рисового типа.

Оценки концентраций в плазме GLP-1(7-36)NH₂ по RIA и, частично, по ELISA, показаны в таблицах 5 и 6 соответственно.

Таблица 5
Оценка назального препарата GLP-1(7-36)NH₂ на обезьянах cynomolgus (RIA)ДобавкиДоза (мкг/кг)Cmax (нг/мл)Tmax (мин)Т_1/2 (часы)AUC_0--∞ (нг·ч/мл)Биодоступность (%)Без добавки ¹⁾22±20,19±0,1620,0±14,1-⁴⁾0,19±0,063,1±3,5Без добавки ²⁾24±20,09±0,0810,0±0,0-⁴⁾0,02±0,020,3±0,31% порошок Domyo-ji36±24,51±0,718,3±2,90,74±0,532,05±0,6723,1±7,30,5% кукурузный крахмал37±63,05±0,938,3±2,90,85±0,233,25±0,9534,7±5,30,5% прежелатинизированный картофельный крахмал неклейкого рисового типа35±40,93±0,4011,7±7,60,76±0,331,18±0,924,1±11,310% НРС ³⁾36±51,71±0,1010,0±0,00,74±0,261,28±0,2514,3±1,3Подкожное введение136,37±2,5410,0±0,000,50±0,003,23±0,5(100)Среднее ± СО (n=3)
1) карбонат кальция (пример приготовления 10)
2) сукралфат (пример приготовления 11)
3) перемешивание с водой (пример приготовления 16)
4) "-" указывает, что концентрация в плазме была слишком низкой для расчета.

Таблица 6
Оценка назального препарата GLP-1(7-36)NH₂ на обезьянах cynomolgus (ELISA)ДобавкиДоза (мкг/кг)Cmax (нг/мл)Tmax (мин)Т_1/2 (часы)AUC_0-∞ (нг·ч/мл)10% НРС ⁵⁾35±80,64±0,2916,7±11,51,54±0,780,80±0,2210% НРС ³⁾36±51,11±0,5510,0±0,00,84±0,100,85±0,1910% НРС ⁶⁾34±20,49±0,0210,0±0,00,74±0,190,41±0,0650% НРС ⁷⁾36±40,27±0,0910,0±0,01,96±0,240,53±0,231% порошок Domyo-ji36±21,42±0,125,0±0,00,61±0,430,70±0,283) перемешивание с водой (пример приготовления 16)
5) порошкообразная смесь (пример приготовления 15)
6) перемешивание с этанолом (пример приготовления 17)
7) перемешивание с водой (пример приготовления 18)

Как следует из таблиц 5 и 6 выше, каждая из двух не содержавших добавки композиций показала низкое назальное всасывание GLP-1(7-36)NH₂ приблизительно от 0,3 до 3,1%, в то время как каждая из фармацевтических композиций по настоящему изобретению достоверно облегчала всасывание GLP-1(7-36)NH₂ слизистой оболочкой носовой полости.

Пример приготовления 10: Приготовление фармацевтической композиции, не содержащей добавки

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30 мг GLP-1(7-36)NH₂, помещали в химический стакан и постепенно добавляли 8,87 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (84 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 8,20 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 30 мг) порошкообразного образца, содержащим 100 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 11: Приготовление фармацевтической композиции, не содержащей добавки

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30 мг GLP-1(7-36)NH₂, помещали в химический стакан и постепенно добавляли 8,87 г сукралфата. После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (84 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 8,03 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 30 мг) порошкообразного образца, содержащим 100 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 12: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей порошок Domyo-ji (1,0%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 89 мг порошка Domyo-ji. Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 8,78 г карбоната кальция. После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (84 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 8,11 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 30 мг) порошкообразного образца, содержащим 100 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 13: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей кукурузный крахмал (0,5%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 45 мг кукурузного крахмала (фармакопея Японии: средний размер частиц = 13,3 мкм). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 8,83 г карбоната кальция (средний размер частиц = 50 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (88 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 8,46 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 30 мг) порошкообразного образца, содержащим 98 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 14: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей прежелатинизированный картофельный крахмал неклейкого рисового типа (0,5%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с 45 мг прежелатинизированного картофельного крахмала неклейкого рисового типа (AMYCOL HF, NIPPON STARCH CHEMICAL Co., Ltd.). Порошкообразную смесь помещали в химический стакан и постепенно добавляли 8,83 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (89 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 8,47 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 30 мг) порошкообразного образца, содержащим 101 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 15: Приготовление фармацевтической композиции (порошкообразной смеси), содержащей гидроксипропилцеллюлозу (НРС, 10%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, растирали с 300 мг НРС (фармакопея Японии), с получением порошкообразной смеси. Порошкообразную смесь сходным образом растирали с 2,69 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм) до однородности. Смесь затем пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (28 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,76 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и количеством (приблизительно 30 мг) порошкообразного образца, содержащим 100 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 16: Приготовление фармацевтической композиции (смесь, перемешиваемая с водой), содержащей НРС (10%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, растирали с 300 мг НРС (фармакопея Японии) с получением порошкообразной смеси. Порошкообразную смесь сходным образом растирали с 2,69 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм) до однородности. Затем к смеси добавляли очищенную воду для формирования из нее пасты. Пасту тщательно перемешивали и высушивали в эксикаторе в течение ночи при пониженном давлении. Высушенную смесь затем пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (28 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,70 г порошкообразного образца. Измеряли содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце и приблизительно количеством 30 мг порошкообразного образца, содержащим 100 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 17: Приготовление фармацевтической композиции (смесь, перемешиваемая с этанолом), содержащей НРС (10%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, растирали с 300 мг НРС (фармакопея Японии) с получением порошкообразной смеси. Порошкообразную смесь сходным образом растирали с 2,69 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм) до однородности. Затем к смеси добавляли этанол для формирования из нее пасты. Пасту перемешивали и высушивали в эксикаторе в течение ночи при пониженном давлении. Высушенную смесь пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (28 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,73 г порошкообразного образца. Измеряли содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце и приблизительно количеством 30 мг порошкообразного образца, содержащим 100 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 18: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей НРС (50%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 10 мг GLP-1(7-36)NH₂, растирали с 1,5 г НРС (фармакопея Японии), с получением порошкообразной смеси. Порошкообразную смесь сходным образом растирали с 1,49 г карбоната кальция (средний размер частиц = 51,9 мкм) до однородности. Затем к смеси добавляли очищенную воду для формирования из нее пасты. Пасту перемешивали и высушивали в эксикаторе в течение ночи при пониженном давлении. Полученный порошок пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (27 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,54 г порошкообразного образца. Измеряли содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце и приблизительно количеством 30 мг порошкообразного образца, содержащим 100 мкг GLP-1(7-36)NH₂, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример 3: Тест на абсорбируемость порошкообразного препарата для назального введения с использованием обезьян cynomolgus (тест-2)

В данном примере заявители изучали назальную абсорбируемость GLP-1(7-36)NH₂ путем введения композиций, содержащих частично прежелатинизированный крахмал, гидроксипропилцеллюлозу-SSL (HPC-SSL), смесь частично прежелатинизированный крахмал/HPC-SSL или кукурузный крахмал (в количестве от 1,0 до 10%) в качестве добавки.

Используя назальный ингалятор производства UNISIA JECS Co., Ltd., композиции примеров приготовления с 19 по 27 индивидуально вводили обезьянам cynomolgus, каждая весом приблизительно от 2 до 4 кг, в носовые полости, и концентрацию GLP-1(7-36)NH₂ в плазме измеряли посредством RIA через 0, 5, 10, 15, 30, 60, 90 и 120 минут после введения. Биодоступность определяли сравнением AUC после назального введения с AUC после подкожного введения.

Результаты показаны в таблице 7 ниже. Как следует из таблицы 7, препараты, содержавшие кукурузный крахмал, в разнообразных пределах от 1,0 до 10%, демонстрировали эффективное улучшение назального всасывания GLP-1(7-36)NH₂ по сравнению с композицией, не содержавшей добавки. Помимо этого, композиция, содержавшая частично прежелатинизированный кукурузный крахмал, который остается частично нерастворимым в воде, также показала эффективную назальную абсорбируемость GLP-1(7-36)NH₂. При использовании плохо растворимой в воде HPC-SSL в качестве добавки в фармацевтических композициях наблюдался эффект некоторого улучшения абсорбции GLP-1(7-36)NH₂. Хотя эффект улучшения абсорбции при комбинированном использовании HPC-SSL и частично прежелатинизированного крахмала не наблюдался, назальная абсорбция GLP-1(7-36)NH₂ была улучшена по сравнению с композицией, не содержавшей добавки.

Таблица 7
Оценка назального препарата GLP-1(7-36)NH₂ на обезьянах cynomolgus (RIA)Добавки (%)Доза (мкг/кг)Cmax (нг/мл)Tmax (мин)Т_1/2 (часы)AUC_0--∞ (нг·ч/мл)Биодоступность (%)Без добавки-88,9±20,01,47±0,7010,3±0,60,45±0,2150,80±21,314,0±1,9Кукурузный крахмал1%100,9±23,22,53±2,3311,0±1,70,37±0,0868,90±53,284,5±2,95%103,56,8710,00,65258,3716,710%111,1±19,93,21±1,1310,0±0,00,49±0,26127,77±41,027,6±1,2HPC (SSL)0,1%101,9±19,63,20±1,8910,3±0,60,34±0,06104,52±56,236,6±2,50,5%93,7±25,62,01±0,4410,0±5,00,57±0,4365,47±15,244,9±1,31%99,1±25,11,51±0,9619,0±10,80,43±0,1262,62±37,665,0±4,4Частично прежелатинизированный кукурузный крахмал1%102,2±8,65,57±1,4712,3±2,50,36±0,28189,82±83,0912,4±5,0Прежелатинизированный кукурузный крахмал/HPC-SSL5%/ 0,1%112,6±31,14,98±2,2310,0±0,00,39±0,10155,71±58,069,1±1,1

Пример приготовления 19: Приготовление не содержащей добавки фармацевтической композиции, содержащей хлорид бензалкония (0,01%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30,6 мг GLP-1(7-36)NH₂, постепенно смешивали с 2,93 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм). После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 30 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,95 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 311 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 20: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей кукурузный крахмал (1,0%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно 2,91 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) смешивали с приблизительно 29 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 29,9 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного перемешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 29 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,88 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 312 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 21: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей кукурузный крахмал (5,0%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно 2,78 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) смешивали с приблизительно 150 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 35 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 29,6 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного перемешивания добавляли раствор, содержавший 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 30 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,89 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 307 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 22: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей кукурузный крахмал (10,0%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно 2,63 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) смешивали с приблизительно 301 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм). После тщательного смешивания добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30,6 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного перемешивания добавляли раствор, содержавший 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 27 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,69 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 341 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 23: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей HPC-SSL (0,1%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно к 2,93 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) добавляли раствор, содержащий приблизительно 3 мг HPC-SSL, а затем добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30,4 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 30 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,94 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 310 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 24: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей HPC-SSL (0,5%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно к 2,92 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) добавляли к раствору, содержащему приблизительно 15 мг HPC-SSL, а затем добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30,5 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 30 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,93 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 312 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 25: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей HPC-SSL (1,0%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно к 2,90 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) добавляли раствор, содержащий приблизительно 30 мг HPC-SSL, а затем добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30,6 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержавший 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 28 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,85 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 322 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 26: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей частично прежелатинизированный кукурузный крахмал (1,0%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно к 2,90 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) добавляли раствор, содержащий приблизительно 30 мг частично прежелатинизированного кукурузного крахмала, а затем добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 37 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30,8 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 29 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,90 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 319 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 27: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей кукурузный крахмал (5,0%), HPC-SSL (0,1%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно 2,78 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) смешивали приблизительно с 151 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм) и смесь тщательно перемешивали. Затем к смеси добавляли раствор, содержащий приблизительно 3 мг HPC-SSL, и очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 36 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 30,3 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 30 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,93 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 30 мг порошкообразного образца, содержащие 310 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример 4: Влияние добавления крахмала на назальную абсорбируемость инкретиновых полипептидов

В данном примере изучали вопрос о том, улучшается ли назальная абсорбируемость кислых инкретиновых гормонов, не являющихся GLP-1(7-36)NH₂, добавлением крахмала, с использованием в качестве показателя понижающее влияние на уровень глюкозы в крови крыс.

Самцам крыс CD (SD) с весом тела 300 г давали наркоз пентобарбиталом. Передний конец наконечника пипетки (GPS-250, RAININ) наполняли 3 мг фармацевтической композиции (содержащей приблизительно 100 мкг полипептида), изготовленной в примере приготовления, описанном ниже, и наконечник присоединяли к шприцу, а затем композицию распыляли в носовую полость крыс вместе с 1 мл воздуха. Затем в хвост крыс внутривенно вводили 0,5 г/кг глюкозы, через 5 минут после назального введения композиции. Образцы крови отбирали из аорты через 15 минут после назального введения композиции (через 10 минут после введения глюкозы). Уровень глюкозы в крови определяли с помощью инструмента для измерения уровня глюкозы в крови (FREESTYLE-KISSEI; Kissei Pharmaceutical Co., Ltd.).

Результаты представлены в таблице 8 ниже. Как можно видеть из приведенных результатов, уровень глюкозы в крови в контрольной группе без введения инкретиновых гормонов составлял 196 мг/дл (средняя величина для 3 крыс). Что касается композиции, содержащей инкретиновые гормоны, уровень глюкозы в крови по сравнению с контрольной группой понижался. Более того, также для случая инкретиновых гормонов, уровень глюкозы в крови понижался, когда в композицию добавляли 5% кукурузного крахмала, по сравнению с композицией без 5% кукурузного крахмала.

Указанные результаты ясно показывают, что возможно, чтобы больше инкретиновых гормонов всасывалось с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, а абсорбируемость инкретиновых гормонов увеличивалась при использовании крахмала в качестве добавки в композицию.

Таблица 8
Понижающее влияние на уровень глюкозы в крови введения инкретиновых гормоновПолипептидКомпозицияСреднееС.О.Контроль-19612GLP-1(7-37)Без добавки17045% кукурузный крахмал14612Эксендин-4Без добавки16665% кукурузный крахмал15112[Val⁸]-GLP-1(7-37)Без добавки168125% кукурузный крахмал14710[Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37)Без добавки18485% кукурузный крахмал15412

Ссылочный пример 5: Синтез [Lys-²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37)

К 5 мг (6,9 ммоль) полимера Cl-Trt(2-Cl), набухающего с метиленхлоридом (30 мл), добавляли раствор в метиленхлориде Fmoc-Glu-OtBu (5,8 г, 13,7 ммоль) и DIPEA (1,5 г, 11,8 ммоль) и смесь осторожно перемешивали в течение 30 минут. Полимер собирали фильтрованием и промывали метиленхлоридом, изопропанолом и метиленхлоридом соответственно. Затем к полученному полимеру добавляли смешанный раствор 20% пиперидина/DMF (30 мл) и смесь осторожно перемешивали в течение 20 минут. Полимер собирали фильтрованием и промывали DMF, изопропанолом и метиленхлоридом соответственно и высушивали. Полученный полимер H-Glu(α-OtBu)-Trt(2-Cl) (6,1 г, 6,9 ммоль) суспендировали в смешанном растворе N-метилпирролидона (NMP)/метиленхлорида (1:1, 30 мл) и к указанной смеси добавляли 3 эквивалента пальмитиновой кислоты (5,3 г, 20,7 ммоль), HOBt (2,8 г, 20,7 ммоль) и водорастворимого дициклогексилкарбодиимида (DCC: 4,0 г, 20,7 ммоль), а затем смесь осторожно перемешивали в течение ночи. Полученный полимер промывали метиленхлоридом, NMP и метиленхлоридом соответственно и высушивали. К полученному полимеру пальмитоил-Glu(α-OtBu)-Trt(2-Cl) (8 г, 6,9 ммоль) добавляли смешанный раствор уксусной кислоты/TFE/метиленхлорида (1:2:7, 20 мл) и смесь осторожно перемешивали в течение 20 минут. Полимер отфильтровывали и промывали 10 мл TFE и фильтрат концентрировали. На полученный остаток действовали гексаном с получением осадка. Полученный остаток перекристаллизовывали из метиленхлорида/гексана с получением 2,0 г (выход: 66%) производного глутаминовой кислоты для введения в боковую цепь Lys по 26 позиции, т.е. пальмитоил-Glu(α-OtBu). ESI-MS: [M+H] 442,3; [M+Na] 462,4 (теоретическая величина: 441,3 [M]).

Затем полимер Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(Trt)-Phe-Thr(Trt)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(4-метилтритил)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(Pmc)-Gly-Arg(Pmc)-Gly-Wang конструировали с помощью методики Fmoc (протокол 0,25 ммоль) с использованием автоматического пептидного синтезатора 433А (ABI Co., Ltd.). На полученный полимер действовали смешанным раствором 1% TFA/5% TIPS/метиленхлорида (30 мл) в течение 30 минут для удаления 4-метилтритильной группы из боковой цепи Lys на позиции 26. Полученный полимер нейтрализовали смешанным раствором 5% DIPEA/метиленхлорида, промывали метиленхлоридом и осуществляли его набухание с помощью NMP (30 мл). Затем набухший полимер взаимодействовал с пальмитоил-Glu(α-OtBu) (441 мг, 1 ммоль) в присутствии HOBt (135 мг, 1 ммоль) и DDC (260 мг, 1 ммоль) в течение 3 часов. На полученный пептидный полимер действовали 20% пиперидином для удаления Fmoc и в дальнейшем действовали смешанным раствором 88% TFA/2% TIPS/5% воды/5% фенола (20 мл) в течение 1 часа. Полимер отфильтровывали и полимер промывали 10 мл TFA, а объединенный фильтрат концентрировали. На остаток действовали эфиром с получением осадка (720 мг). 500 мг полученного сырого пептида растворяли в насыщенном растворе мочевины (200 мл) и очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием С4 (YMC-pack, PROTEIN-RP, 2 см × 25 см) с линейным градиентом от 13% до 60% ацетонитрила/0,1% TFA при скорости потока от 5 до 10 мл/мин. Фракцию, содержавшую желаемый продукт, собирали и лиофилизировали с получением 145 мг желаемого пептида. ESI-MS: 3751 (теоретическая величина: 3751,2). Leu стандартный аминокислотный состав после гидролиза 6 н. хлористоводородной кислотой: Asx: 0,97 (1), Thr: 1,89 (2), Ser: 2,75 (3), Glx: 5,08 (5), Gly: 4,05 (4), Ala: 4,01 (4), Val: 1,93 (2), Ile: 0,99 (1), Leu: 2, Tyr: 0,91 (1), Phe: 1,90 (2), Lys: 1,10 (1), His: 0,90 (1), Arg: 1,92 (2).

Ссылочный пример 6: Синтез GLP-1(7-37)

Полимер Н-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(Trt)-Phe-Thr(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Вос)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pmc)-Wang (1,1 г) конструировали из полимера Fmoc-Arg(Pmc)-Wang в качестве исходного материала с помощью методики Fmoc (протокол 0,25 ммоль) с использованием автоматического пептидного синтезатора 433А (ABI Co., Ltd.). На 600 мг полученного полимера действовали смешанным раствором 88% TFA/2% TIPS/5% воды/5% фенола (20 мл) в течение 1 часа. Полимер отфильтровывали и фильтрат концентрировали, а на остаток действовали эфиром с получением осадка (380 мг). Полученный сырой пептид растворяли в очищенной воде (20 мл) и очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием С4 (YMC-pack, PROTEIN-RP, 2 см × 25 см) с линейным градиентом от 9% до 68% ацетонитрила/0,1% TFA при скорости потока 10 мл/мин. Фракцию, содержащую желаемый продукт, собирали и лиофилизировали с получением 53 мг желаемого пептида. ESI-MS: [M] 3355 (теоретическая величина: 3355,7). Leu стандартный аминокислотный состав после гидролиза 6 н. хлористоводородной кислотой: Asx: 1,00 (1), Thr: 1,99 (2), Ser: 2,79 (3), Glx: 4,10 (4), Gly: 4,01 (4), Ala: 4,02 (4), Val: 1,92 (2), Ile: 0,98 (1), Leu: 2, Tyr: 0,92 (1), Phe: 1,92 (2), Lys: 2,18 (2), His: 0,96 (1), Arg: 0,94 (1).

Ссылочный пример 7: Синтез [Val⁸]GLP-1(7-37)

Полимер Н-His(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Gly-Thr(Trt)-Phe-Thr(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Вос)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pmc)-Wang (1,4 г) конструировали из полимера Fmoc-Arg(Pmc)-Wang в качестве исходного материала с помощью методики Fmoc (протокол 0,25 ммоль) с использованием автоматического пептидного синтезатора 433А (ABI Co., Ltd.). На 0,7 г полученного полимера действовали смешанным раствором 88% TFA/2% TIPS/5% воды/5% фенола (20 мл) в течение 1 часа. Полимер отфильтровывали и фильтрат концентрировали, а на остаток действовали эфиром с получением осадка (327 мг). Полученный сырой пептид растворяли в очищенной воде (50 мл) и очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием С4 (YMC-pack, PROTEIN-RP, 2,5 см × 30 см) с линейным градиентом от 5% до 72% ацетонитрила/0,1% TFA при скорости потока 10 мл/мин. Фракцию, содержащую желаемый продукт, собирали и лиофилизировали с получением 75 мг желаемого пептида. ESI-MS: 3383 (теоретическая величина: 3383,8). Leu стандартный аминокислотный состав после гидролиза 6 н. хлористоводородной кислотой: Asx: 0,99 (1), Thr: 1,98 (2), Ser: 2,80 (3), Glx: 4,10 (4), Gly: 4,01 (4), Ala: 3,03 (3), Val: 2,86 (3), Ile: 0,98 (1), Leu: 2, Tyr: 0,92 (1), Phe: 1,92 (2), Lys: 2,18 (2), His: 0,92 (1), Arg: 0,94 (1).

Ссылочный пример 8: Синтез эксендина-4

Полимер Н-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(Trt)-Phe-Thr(Trt)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pmc)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Wang (1,9 г) из полимера Fmoc-Ser(tBu)-Wang в качестве исходного материала с помощью методики Fmoc (протокол 0,25 ммоль). На 1,9 г полученного полимера действовали смешанным раствором 88% TFA/2% TIPS/5% воды/5% фенола (20 мл) в течение 1 часа. Полимер отфильтровывали и фильтрат концентрировали, а на остаток действовали эфиром с получением осадка (870 мг). Полученный сырой пептид растворяли в очищенной воде (80 мл) и очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием С4 (YMC-pack, PROTEIN-RP, 2,5 см × 30 см) с линейным градиентом от 18% до 72% ацетонитрила/0,1% TFA при скорости потока 10 мл/мин в течение 60 минут. Фракцию, содержащую желаемый продукт, собирали и лиофилизировали с получением 270 мг желаемого пептида. ESI-MS: 4186 (теоретическая величина: 4186,6). Leu стандартный аминокислотный состав после гидролиза 6 н. хлористоводородной кислотой: Asx: 1,99 (2), Thr: 1,97 (2), Ser: 4,77 (5), Glx: 6,06 (6), Gly: 4,97 (5), Ala: 2,02 (2), Val: 0,94 (1), Met: 0,68 (1), Ile: 0,98 (1), Leu: 3, Phe: 1,90 (2), Lys: 2,17 (2), His: 0,98 (1), Arg: 0,92 (1), Pro: 3,96 (4).

Пример приготовления 28: Приготовление фармацевтической композиции для назального всасывания GLP-1(7-37), содержащей кукурузный крахмал (5%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно 269 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) смешивали приблизительно с 15 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм) и смесь тщательно перемешивали. Затем к смеси добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 10,8 мг) порошка GLP-1(7-37), эквивалентное 9,03 мг GLP-1(7-37), смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,03 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 2,2 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 252 мг порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-37) в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 107 мкг GLP-1(7-37), готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 29: Приготовление фармацевтической композиции для назального всасывания GLP-1(7-37), содержащей хлорид бензалкония (0,01%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 10,5 мг) порошка GLP-1(7-37), эквивалентное 8,75 мг GLP-1(7-37), постепенно смешивали приблизительно с 284 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм). После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,03 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду, и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 2,9 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 258 мг порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-37) в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 102 мкг GLP-1(7-37), готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 30: Приготовление фармацевтической композиции для назального всасывания [Val⁸]-GLP-1(7-37), содержащей кукурузный крахмал (5,0%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно 269 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) смешивали приблизительно с 15 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм) и смесь тщательно перемешивали. Затем к смеси добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 13 мг) порошка [Val⁸]-GLP-1(7-37), эквивалентное 9,38 мг [Val⁸]-GLP-1(7-37), смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,03 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 3,1 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 261 мг порошкообразного образца. Содержание [Val⁸]-GLP-1(7-37) в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 108 мкг [Val⁸]-GLP-1(7-37), готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 31: Приготовление фармацевтической композиции для назального всасывания [Val⁸]-GLP-1(7-37), содержащей хлорид бензалкония (0,01%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 13 мг) порошка [Val⁸]-GLP-1(7-37), эквивалентное 9,31 мг [Val⁸]-GLP-1(7-37), постепенно смешивали приблизительно с 284 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм). После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,03 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 2,6 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 252 мг порошкообразного образца. Содержание [Val⁸]-GLP-1(7-37) в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 111 мкг [Val⁸]-GLP-1(7-37), готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 32: Приготовление фармацевтической композиции для назального всасывания эксендина-4, содержащей кукурузный крахмал (5,0%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно 270 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) смешивали приблизительно с 15 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм) и смесь тщательно перемешивали. Затем к смеси добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка эксендина-4, эквивалентное 9,08 мг эксендина-4, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,03 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 3,0 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 255 мг порошкообразного образца. Содержание эксендина-4 в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 107 мкг эксендина-4, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 33: Приготовление фармацевтической композиции для назального всасывания эксендина-4, содержащей хлорид бензалкония (0,01%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка амилина: эксендина-4, эквивалентное 9,0 мг эксендина-4, постепенно смешивали приблизительно с 285 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм). После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,03 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 2,6 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 260 мг порошкообразного образца. Содержание эксендина-4 в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 104 мкг эксендина-4, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 34: Приготовление фармацевтической композиции для назального всасывания [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), содержащей кукурузный крахмал (5,0%) и хлорид бензалкония (0,01%)

Приблизительно 270 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) смешивали приблизительно с 15 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм) и смесь тщательно перемешивали. Затем к смеси добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), эквивалентное 9,23 мг [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,03 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 2,7 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 245 мг порошкообразного образца. Содержание [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37) в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 113 мкг [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 35: Приготовление фармацевтической композиции для назального всасывания [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), содержащей хлорид бензалкония (0,01%)

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 12 мг) порошка [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), эквивалентное 9,08 мг [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), постепенно смешивали приблизительно с 285 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм). После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,03 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в эксикаторе при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 2,4 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 265 мг порошкообразного образца. Содержание [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37) в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 103 мкг [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-GLP-1(7-37), готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример 5: Усиливающий эффект крахмала в качестве добавки на назальную абсорбируемость кислых полипептидов

Данный пример показывает влияние добавления крахмала на усиление назального всасывания человеческого инсулина у обезьян cynomolgus. Человеческий инсулин использовали в качестве одного из примеров кислых полипептидов, отличающихся от инкретинового гормона.

В качестве носителя использовали мелкозернистый порошок карбоната кальция или сульфатированной алюминиевой соли сахарозы (сукралфата) со средним размером частиц 50 мкм. Согласно процедурам, описанным в примерах приготовления с 10 по 18, готовили фармацевтические композиции для назального всасывания, содержащие порошок Domyo-ji (1,0%). Дозу человеческого инсулина подбирали таким образом, чтобы одной обезьяне вводилось приблизительно 25 МЕ (международных единиц)/40 мг композиции. В качестве контролей готовили две не содержащие добавки композиции: одну, содержащую карбонат кальция и человеческий инсулин, и другую, содержащую сукралфат и человеческий инсулин.

Используя назальный ингалятор производства UNISIA JECS Co., Ltd., приблизительно 40 мг композиций примеров приготовления с 36 по 38 индивидуально вводили обезьянам cynomolgus, каждая весом приблизительно 3 кг, в носовые полости. Концентрации инсулина и глюкозы в плазме измеряли посредством гранул II инсулин·RIA (Dinabott Co., Ltd.) и инструмента для измерения уровня глюкозы в крови (FREESTYLE-KISSEI; KISSEI Pharmaceutical Co., Ltd.) через 0, 5, 15, 20, 30, 45, 60, 90 и 120 минут после введения.

Результаты показаны в таблицах 9 и 10 ниже. Как следует из приведенных результатов, всасывание человеческого инсулина и снижение уровня глюкозы в крови наблюдалось после введения композиции, не содержащей добавки. Однако в случае введения композиции, содержащей 1,0% порошка Domyo-ji (частично прежелатинизированного крахмала), наблюдалось повышение всасываемости человеческого инсулина и достоверно низкий уровень глюкозы в крови на ранней стадии.

Таблица 9
Концентрация человеческого инсулина в плазме после введения композиции, содержащей человеческий инсулинКомпозицияВремя после введения (мин)до5101560120Карбонат кальция20,556,0166,5297,047,016,0Карбонат кальция/порошок Domyo-ji (1%)12,0115,5267,5275,056,541,5Сукралфат15,072,5183,0185,044,017,5

Таблица 10
Уровень глюкозы в крови после введения композиции, содержащей человеческий инсулинКомпозицияВремя после введения (мин)до5101560120Карбонат кальция60,088,096,578,5N.D.N.D.Карбонат кальция/порошок Domyo-ji (1%)55,082,573,533,5N.D.N.D.Сукралфат72,574,045,077,020,021,5N.D.: не обнаружено

Пример приготовления 36: Приготовление фармацевтической композиции инсулина/сукралфата

К 120 мг сукралфата добавляли 1 мл препарата человеческого инсулина (Humulin R: Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.) и смесь тщательно перемешивали. Затем смесь высушивали при пониженном давлении в течение ночи и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 1,2 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением порошкообразного образца. 40 мг порошкообразного образца, содержащими приблизительно 25 МЕ человеческого инсулина, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 37: Приготовление фармацевтической композиции инсулина/карбоната кальция

К 120 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) добавляли 1 мл препарата человеческого инсулина (Humulin R: Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.) и смесь тщательно перемешивали. Затем смесь высушивали при пониженном давлении в течение ночи и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 1,2 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением порошкообразного образца. 40 мг порошкообразного образца, содержащими приблизительно 25 МЕ человеческого инсулина, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 38: Приготовление фармацевтической композиции инсулина/карбоната кальция, содержащей порошок Domyo-ji (1,0%)

К 120 мг карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) добавляли суспензию 1 мл препарата человеческого инсулина (Humulin R: Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.) и 1,2 мг порошка Domyo-ji и смесь перемешивали. После перемешивания смесь высушивали при пониженном давлении в течение ночи и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 1,2 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением порошкообразного образца. 40 мг порошкообразного образца, содержащими приблизительно 25 МЕ человеческого инсулина, наполняли капсулы № 2, для приготовления фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример 6: Влияние размера частиц крахмала в качестве добавки в фармацевтическую композицию на назальную абсорбируемость

В данном примере изучали влияние размера частиц крахмала в качестве добавки в фармацевтическую композицию, содержавшую GLP-1(7-36)NH₂, на назальную абсорбируемость, с использованием в качестве показателя понижающее влияние на уровень глюкозы в крови крыс.

В данном примере следующие два различных мелкозернистых порошка крахмалов со средним размером частиц использовали в качестве добавок в фармацевтическую композицию.

Кукурузный крахмал:

Средняя величина интегрированного размера частиц (d50): 13,3 мкм

Центральное распределение: 14 мкм

Пределы распределения: от 5,5 мкм до 30 мкм

Картофельный крахмал:

Средняя величина интегрированного размера частиц (d50): 37,7 мкм

Центральное распределение: 45 мкм

Пределы распределения: от 5,5 мкм до 105 мкм

Крысам CD (SD) с весом тела около 300 г давали наркоз пентобарбиталом. Передний конец наконечника пипетки (GPS-250, RAININ) наполняли 3 мг фармацевтической композиции (содержащей приблизительно 90 мкг полипептида), приготовленного в примере приготовления, описанном ниже, и наконечник присоединяли к шприцу, а затем композицию распыляли в носовую полость крыс вместе с 1 мл воздуха. Затем в хвост крыс внутривенно вводили 0,5 г/кг глюкозы, через 5 минут после назального введения композиции. Образцы крови отбирали из аорты через 15 минут после назального введения композиции (через 10 минут после введения глюкозы). Уровень глюкозы в крови определяли с помощью инструмента для измерения уровня глюкозы в крови (FREESTYLE-KISSEI; Kissei Pharmaceutical Co., Ltd.).

Результаты представлены в таблице 11 ниже. Как можно видеть из результатов, уровень глюкозы в крови в контрольной группе без введения GLP-1(7-36)NH₂ составлял 196 мг/дл (средняя величина для трех крыс). Уровень глюкозы в крови в группах, которым вводили композицию, содержащую GLP-1(7-36)NH₂ без добавки, с 5% кукурузного крахмала и 5% картофельного крахмала, составлял 170 мг/дл, 157 мг/дл и 182 мг/дл соответственно. Указанные уровни глюкозы в крови были ниже, чем в контрольной группе, которой не вводили GLP-1(7-36)NH₂.

Эффект усиления всасывания GLP-1(7-36)NH₂ преимущественно наблюдался в случае группы, в которой использовался кукурузный крахмал с малым размером частиц, по сравнению с группой, в которой использовался картофельный крахмал с большим размером частиц.

Как видно из результатов таблицы 11, предпочтительное назальное всасывание GLP-1(7-36)NH₂ можно наблюдать при использовании носителя с меньшим размером частиц, в то время как доза крахмала с более крупными частицами не показала эффекта усиления всасывания.

Таблица 11
Влияние размера частиц крахмала на активность в отношении снижения уровня глюкозы в крови введением GLP-1(7-36)NH₂ПептидКомпозицияСредняя величинаС.О.Контроль-19612GLP-1(7-36)NH₂Без добавки17005% кукурузный крахмал (13,3 мкм)15785% картофельный крахмал (37,7 мкм)18215

Пример приготовления 39: Приготовление фармацевтической композиции, не содержащей добавки

В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 108 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 90,2 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали приблизительно с 2,86 г карбоната кальция. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 30 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением 2,95 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 92 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 40: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей кукурузный крахмал (5,0%)

Приблизительно к 2,71 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) добавляли приблизительно 150 мг кукурузного крахмала (средний размер частиц = 13,3 мкм) и смесь тщательно перемешивали, а затем добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 107 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 89,2 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 29 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,90 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 92 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

Пример приготовления 41: Приготовление фармацевтической композиции, содержащей картофельный крахмал (5,0%)

Приблизительно к 2,71 г карбоната кальция (средний размер частиц = 53,6 мкм) добавляли приблизительно 150 мг картофельного крахмала (средний размер частиц = 37,7 мкм) и смесь тщательно перемешивали, а затем добавляли очищенную воду и смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и пропускали через сито 180 мкм с получением высушенных продуктов. В качестве пептидного компонента количество (приблизительно 107 мг) порошка GLP-1(7-36)NH₂, эквивалентное 89,5 мг GLP-1(7-36)NH₂, смешивали с высушенными продуктами, полученными выше. После тщательного смешивания добавляли раствор, содержащий 0,3 мг хлорида бензалкония, а затем очищенную воду и полученную смесь перемешивали. После перемешивания смесь сушили в течение ночи в аппарате для лиофильной сушки при пониженном давлении и высушенные продукты пропускали через сито 180 мкм. К просеянной смеси примешивали количество (приблизительно 29 мг) стеарата кальция, эквивалентное 1,0% общей массы, с получением приблизительно 2,88 г порошкообразного образца. Содержание GLP-1(7-36)NH₂ в порошкообразном образце измеряли посредством ВЭЖХ с обращенной фазой и 3 мг порошкообразного образца, содержащие 93 мкг GLP-1(7-36)NH₂, готовили в виде фармацевтической композиции для назального всасывания.

ПРИМЕНИМОСТЬ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Как было изложено, настоящее изобретение относится к новой фармацевтической композиции для назального всасывания, которая содержит биологически активный полипептид, носитель, который является нерастворимым или малорастворимым в воде, и добавку, способную однородно диспергировать и закреплять полипептид на поверхностях носителя. Беспрецедентная фармацевтическая композиция улучшает всасываемость биологически активных полипептидов, в частности кислых биологически активных полипептидов, имеющих изоэлектрическую точку 7 или ниже и, таким образом, низкую стабильность в растворе, которые, в другом случае, трудно вводить посредством любого другого неинъекционного пути введения, включая пероральное введение.

Соответственно, фармацевтическая композиция для назального всасывания по настоящему изобретению делает возможным назальное введение или нанесение на слизистую оболочку носовой полости полипептидов, способствующих секреции инсулина, для которых еще не был разработан жизнеспособный неинъекционный путь введения, в форме порошкообразной композиции. При указанном способе композиция увеличивает биодоступность полипептида и, таким образом, может служить клинически эффективным лекарственным средством. По указанной причине фармацевтическая композиция по настоящему изобретению обладает значимым медицинским действием.

Изобретение относится к лекарственным средствам и касается фармацевтической композиции для назального всасывания, включающей биологически активный кислый полипептид с изоэлектрической точкой 7 или ниже; носитель, который является нерастворимым или слаборастворимым в воде и имеет средний размер частицы 100 мкм или меньше; и добавку для диспергирования и закрепления полипептида на поверхности носителя, который является нерастворимым или слаборастворимым в воде, где средний размер частицы указанной добавки меньше среднего размера носителя и находится в области от 1 мкм до 20 мкм. Композиции по изобретению демонстрируют улучшенную биодоступность биологически активного полипептида. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл.

1. Фармацевтическая композиция для назального всасывания, включающая биологически активный кислый полипептид с изоэлектрической точкой 7 или ниже; носитель, который является нерастворимым или слаборастворимым в воде и имеет средний размер частицы 100 мкм или меньше; и добавку для диспергирования и закрепления полипептида на поверхности носителя, который является нерастворимым или слаборастворимым в воде, где средний размер частицы указанной добавки меньше среднего размера носителя и находится в области от 1 до 20 мкм.2. Фармацевтическая композиция для назального всасывания по п.1, в которой носитель, который является нерастворимым или слаборастворимым в воде, представляет собой соединение поливалентного металла и является карбонатом кальция.3. Фармацевтическая композиция для назального всасывания по п.1 или 2, в которой средний диаметр частицы указанного носителя составляет от 20 до 60 мкм.4. Фармацевтическая композиция для назального всасывания по п.1, в которой биологически активный кислый полипептид представляет собой амид глюкагоноподобного пептида-1(7-36), глюкагоноподобный пептид-1(7-37), [Val⁸]-глюкагоноподобный пептид-1(7-37), [Lys²⁶, ε-NH{γ-Glu(N-α-пальмитоил)}]-CLP-1(7-37), эксендин-4 или инсулин.5. Фармацевтическая композиция для назального всасывания по п.1, в которой добавка представляет собой крахмал, выбранный из группы, состоящей из амилопектина, амилозы или смеси, содержащей амилопектин и амилозу в любом соотношении.6. Фармацевтическая композиция для назального всасывания по п.1, в которой добавка представляет собой рисовую муку, кукурузный крахмал, кукурузный бета-крахмал (неклейкого рисового типа), картофельный крахмал или картофельный бета-крахмал (неклейкого рисового типа).