Способ получения иммуносорбента Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в час ииэсти к иммунохимии, и может быть использовано для выделения с помощью аффинной хроматографии иммуноглобулина G, а также FC-фрагментов и иммунных комплексов из крови и других биологических жидкостей.

Основными характеристиками иммуно- сорбента являются его сорбционная емкость по иммуноглобулину G, устойчивость X воздействию микроорганизмов и ферментов, стабильность в процессе многократного использования.

Цель изобретения - повышение сорбци- онной емкости иммуносорбента по иммуноглобулину G.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммуносорбента путем активации носителя, промывки его буферными растворами, ковалентного связывания белка А из Staphylococcus аигецз с активированным носителем и промывки полученного иммуносорбента буферными растоо рами, в качестве носителя используют аминопропилсилохром, который активируют глутаровым альдегидом при концентрации 12-13%, а ковалентное свя- зывание белка А с активированным носителем проводят при концентрации его 3-6 мг/мл с последующей обработкой иммунэ- сорбента и.эвестными приемами.

Предлагаемый способ выполняется сле- ду1са1и 1 образом и включает в себя несколько jTanoB,

1. Промывка аминопрспилсилохрома 1,0 М раствором NaCI и дистиллированной подои.

. Активация аминопропипсилохрома (производство Олаймского завода химреак- 1ивов) глутаровым альдегидом при концентрации i2-13% Бтечение2ч при комнатной температуре и рН 8,0.

3.Промыака активированного аминоп- ропилсипохрома дистиллированной водой и 0,1 М К-фосфатным буфером, рН 8,0.

4.Ковалентное связывание белка А г. активированным аминопропилсилохромом с концентрацией белка А в реакционной смеси З-б мг/мл в течение 16-20 ч при комнатной температуре и рН 8,0.

5.Промывка иммуносорбеита 1 М раствором NaCI и 0,1 М К-фосфатным буфером, рЧ 7.0.

5 Восстановление свободных альдегидных грурп и стабилизация связи между белком А и силохромом обработкой иммуносорбента 0,1 М раствором NaBH) в течение 30 мин при 2-4 С и рН 7,0.

7. Промывка иммуносорбента последовательно растворами 1,0 М NaCI, 0,1 М Кфосфатного буфера, рН 7,0, 0.1 М уксусной кислоты, рН 3,0, и 0,1 М К-фосфатного буфера, рН 7,0.

Полученный иммуносорбент имеет сор5 бционную емкость по иммуноглобулину G 23-32 мг/мл и может быть использован не менее 20 раз для выделения иммуноглобулинов без существенного изменения его емкости.

0 Пример 1. Активация аминопропил- силохрома глутаровым альдегидом.

10 г аминопропилсилохрома последовательно промывают 1,0, М раствором NaCI и дистиллированной аодой, а затем вносят а

5 100 мл 12,5%-ного раствора глутарового альдегида, приготовленного в 0,075 М К- фосфатном буфере, рН 8,0. Реакционную смесь инкубируют на качалке в течение 2 ч при комнатной температуре. Активирован0 ный аминопропилсилохром промывают дистиллированной водой для удаления глутарового альдегида, а затем 0,1 М К-фосфатным буфером, рН 8,0.

2. Иммобилизация белка А.

510 г активированного аминопропилсилохрома вносят в 100 мл 0,1 М К-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего белок А с концентрацией 4,5 мг/мл, и смесь инкубируют на качалке при комнатной температуре в

0 течение 17 ч. Иммуносорбент промывают 1,0 М раствором NaCI и 0,1 М К-фосфатным буфером, а затем восстанавливают свободные альдегидные группы путем инкубации иммуносорбента 0,1 М раствором NaBH,

5 приготовленным на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,0, в течение 30 мин при 2-4°С. Иммуносорбент промывают последовательно растворами 1,0 М NaCI, О 1 М К-фосфатного буфера, рИ 7,0.0,1 М уксусной кислоты,

0 рН 3.0, и 0,1 М К-фосфатного буфера, рН 7,0. Емкость полученного иммуносорбента по связыванию иммуноглобулина G из свиной сыворотки составила 24,8 мг/г. Иммуноглобулин G был гомогенен при диск-злектрофо45 резе в 7,5%-ном полиакриламидном геле.

Пример 2. 1, Активацию аминопропилсилохрома проводят согласно примеру 1 при концентрации глутарового альдегида 50 13,0% в реакционной смеси.

2. Иммобилизацию белка А на аминоп- ропилсилохроме проводят согласно примеру 1 при концентрации белка А в реакционной смеси 6,0 мг/л. Емкость имму- 55 нссорбента по свиному иммуноглобулину G составила 31,7 мг/г. Иммуноглобулин G был гомогенен при дискзлектрофорезе в 7,5%- ном полиакриламидном геле.

Примерз. 1. Активацию аминопропилсилохрома проводят согласно примеру 1

/

при концентрации глутарового альдегида 12.0% в реакционной смеси.

2. Иммунобилизацию белка А на ами- нопропилсилохроме проводят согласно примеру 1 при концентрации белка А в ре- акционной смеси 3,0 мг/мл. Емкость имму- носорбента по свиному иммуноглобулину G составила 23,3 мг/г. Иммуноглобулин G был гомогенен при диск-электрофорезе в 7,5%- ном полиакриламидном геле.

Преимуществами способа являются: упрощение процесса за счет исключения из него дефицитного носителя - карбо1 Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОР БЕНТА. включающий активацию носителя активирующим агентом, промывку буферными растворами, ковалентное связыва- ние белка А из Staphylococcus aureus с j ним с последующей обработкой и промывкой иммуносорбента. отличающийся тем.

нилдиимидазольного производного силика- геля;

повышение емкости иммуносорбеита в 30-40 раз:

расширение возможности использования иммуносорбента для крупномасштабного выделения иммуноглобулинов и повышения выхода иммуноглобулинов с низкой аффинностью к белку А.

(56) Phnilps Т.М. at а1. J. of Chromatography, 1985. V. 327. p. 213-219.

что, с мелью повышения емкости иммуносорбента, в качестве носителя используют аминопропилсилохром. активацию его осуществляют глутаровым альдегидом в концентрации 12.0 - 13.0%. а ковалентное связывание проводят при концентрации; белка А в реакционной смеси 3.0 - 6.0 мг/мл.

Изобретение относится к медицине, в чааности к иммумохимик и может быть иаюльэовано для выделе мя с помощью аффимюй хроматографии иммуноглобутмна G, а также FC-фрагментов и иммунных комплексов из крови и других биолсгичес- кихжидкоаей. С целью повышения емкоаи имму- носорбента по связыванию иммуноглобулина G аминопропилсилохром активируют 12.0 13,0%-ным раствором глутарового альдегида, ко- валентио связывают с ним бело А из Startiykxxxxus aureus при концентрации последнего в реакционной смеси 3.0 - 6,0 мг/мл с последующей обработкой и промывкой иммуносорбента извеаными способами В результате получают иммуносорбент с емкоаью по иммуноглобулину 23 - 32 мг/г сорбента который может быть использован для выделения иммуноглобулинов не менее 20 раз1