СПОСОБ НАСЫЩЕНИЯ ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ АНТИБИОТИКАМИ Российский патент 2008 года по МПК A61K33/14 A61K35/14 A61M1/38 A61P43/00 A61K31/542 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и трансфузиологии, может быть использовано для направленного транспорта антибиотиков к очагу воспалительной реакции.

Существует методика насыщения эритроцитов ферментами и бронхоактивными препаратами, заключающаяся в следующем. К объему эритроцитов добавляется 2-20 объемов раствора лекарственного средства. При этом тоничность полученной взвеси восстанавливается добавлением гипертонического буфера. Смесь центрифугируют, супернатант удаляют, оставшиеся эритроциты отмывают изотоническим буферным раствором. Эритроциты, полученные после такой обработки, называют «белые тени» (Iher, G. M., Glew, R. M., and Schnure, F. W. 1973. Enzyme loading of erythrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2663-2666; Ihler. G. M., and Tsang, H. C. W. 1987. Hypotonic hemolysis methods for entrapment of agents in resealed erythrocytes. Methods Enzymol. (series) 149:221-229).

Недостатками данной методики являются низкий уровень насыщения эритроцитов лекарственным препаратом. Кроме того, эритроциты после такой обработки теряют гемоглобин, значительно укорачивается продолжительность жизни эритроцитов после их реинфузии.

Известна методика насыщения эритроцитов ферментами и липидами, впервые описанная Klibansky в 1959 году. Для этой цели в диализат помещали 1 объем эритроцитов и 10-20 объемов гипотонического буфера. Спустя 2 часа или добавляли гипертонический буфер, или эритроциты помещали в изотонический раствор. При этом препарат, необходимый для насыщения эритроцитов, помещали изначально в диализат или спустя 2 часа перед восстановлением тоничности раствора.

Недостатками данной методики также являются низкий уровень насыщения эритроцитов лекарственным препаратом. Эритроциты после такой обработки теряют гемоглобин, значительно укорачивается продолжительность жизни эритроцитов после их реинфузии (Klibansky, С.1959. Ph.D. Thesis, Hebrew University, Jerusalem, Israel. Dale, G. L., Villacorte, D. G., and Beutler, E. 1977. High yield entrapment of protein into erythrocytes. Blochem. Med. 18:220-225).

Существует методика, в ходе которой используется аппаратура стандартного гемодиализа для процедуры экстракорпорального насыщения эритроцитов лекарственными препаратами. Описанный метод применялся для направленного транспорта ферментов, аминогликозидов, интерлейкина, иммуноглобулина-G. В ходе данного метода были получены так называемые розовые тени - жизнеспособные клетки, которые при их реинфузии сохраняют продолжительность жизни. В результате данной обработки эритроцитов увеличилась степень насыщения эритроцитов лекарственным препаратом.

Недостатками методики являются: длительное время для проведения метода, необходимость специального оборудования (Ropars, С, Nicolau, С, and Chassaigne, M. 1982. French Patent No. 82. 11749; 1983. European Patent No. 83. 401364-1.; Jrade, M., Ropars, C, Van Vooren, C, and Chassaigne, M. 1987. Technical aspects of human red blood cell carriers methodology. Adv. Biosci. (series) 67:223-232).

Известна осмотическая пульс-методика. В данном случае на всем протяжении насыщения эритроцитов лекарственными препаратами используется изотонический раствор. Авторы предложили применение диметилсульфоксида для изменения градиента концентрации внутри клетки во внеклеточной среде. В результате открываются каналы на мембране эритроцита и лекарственный препарат попадает внутрь клеток.

Недостатком данного метода является то, что в ходе работы не освещены изменения концентрации лекарственного препарата внутри и вне эритроцитов (Franco. R., Barker. R., and Weiner. M. 1987. The nature and kinetics of redcell membrane changes during the osmotic pulse method of incorporating xenobiotics into viable red cells. Adv. Biosci. (series) 67:63-72).

Существует методика химического воздействия на мембрану эритроцитов. В ходе данного метода авторы насыщали эритроциты полиеновым антибиотиком-амфоторицином В. Для воздействия на мембрану эритроцитов использовались изотонические растворы химических веществ: мочевины, этилен гликоля, нашатырного спирта и галотана.

Недостатком данного метода являются необратимые деструктивные изменения в мембране эритроцитов, что делает этот метод не применимым в клинических исследованиях (Deuticke, В., Kim, M., and Zolinev, C. 1973. The influence of amphotericin-B on the permeability of mammalian erythrocytes to nonelectrolytes, anions and cations. Biochim. Blophys. Ada 318:345-359).

Известна методика с применением электрического тока. Методика основывается на том, что при воздействии на эритроциты электрического импульса увеличивается проницаемость мембран. Авторы определили оптимальную силу тока, время воздействия на эритроциты. Преимущества метода заключаются в повышении степени насыщения эритроцитов лекарственным препаратом (до 35%). Кроме того, в данном методе эритроциты находятся в изотоническом растворе, следовательно, их жизнеспособность сохраняется. Метод применялся для направленного транспорта сахарозы, уреазы и фрагментов ДНК (Zimmnermann, U. 1973. Jahresbericht der kernforschungsanlage Julich GmbH, Nuclear Research Center Julich, 55-58; Zimmermann, U. 1983. Cellular drug-carrier systems and their possible targeting. In Targeted Drugs, ed. E. P. Goldberg, 153-20; Kruse, C. A., James, G. Т., Freehauf, C. L., and Williams, C. M. 1987. Methotrexate loaded erythrocytes carriers; Optimization their formation, their characterization, and their pharmacological efficiency in treating hepatoma 129 ascites tumors in mice. Adv. Biosci. (series) 67:137-144).

Недостатки заключаются в необходимости специальной аппаратуры и технической сложности проведения методики.

Существует несколько методик экстракорпорального насыщения форменных элементов крови антибиотиками:

Известна методика ЭКАБТ (экстракорпоральной антибиотикотерапии), применяемая при гнойно-деструктивных заболеваниях легких и средостения. Объем забираемой крови составляет 450-500 мл. После соответствующей обработки (центрифугирование, добавление антибиотика, инкубация взвеси с АТФ, разбавление изотоническим раствором) взвесь вводили внутривенно пациентам через день, в среднем по 4-5 сеансов на курс лечения. (Экстракорпоральная антибактериальная терапия у больных с гнойно-деструктивными заболеваниями легких и средостения. Костюченко А.Л., Бельских А.Н., Тулупов А.Н. Интенсивная терапия послеоперационной раневой инфекции и сепсиса.- СПб.: Фолиант, 2000. - С.176-177).

Недостатком данного метода является то, что для выполнения его условий необходим забор большого объема крови (450-500 мл), что в случае тяжелого исходного состояния больного не представляется возможным.

Известна методика применения направленного транспорта антибиотиков (НТА) в комплексном лечении больных с гнойно-воспалительными заболеваниями почек. Методика НТА заключалась в следующем: больному проводили аппаратный (PCS - 2) или ручной цитаферез, при этом средний объем тромболейковзвеси составил 280±40 мл. На следующем этапе в клеточную массу (КМ) вводилась разовая доза антибиотика (с учетом чувствительности микроорганизмов) и АТФ. В последующем с целью повышение фиксации антибиотика и стимуляции фагоцитарной активности КМ инкубировали при Т 37°С в лучах гелий-неонового лазера с длиной волны 633 нм в течение 15-20 минут. Аутоцитовзвесь реинфузировали пациенту. Курс лечения составил от 1 до 4 операций в зависимости от тяжести заболевания, состояния больного и клинико-лабораторных данных. Результаты: У 82 (84,5%) больных основной группы была отмечена положительная динамика клинического состояния на 2-3 сутки после одного-двух сеансов НТА. (Абу Идда А.Ш. Лечение больных с гнойно-воспалительными заболеваниями почек путем применения направленного транспорта антибактериальных препаратов в аутологичных лейкоцитах / Абу Идда А.Ш., Горелов С.И., Каган О.Ф. // Медицинский научный и учебно-методический журнал. - 2005. - №27. - С.82-90).

Недостатком данного метода является то, что для центрифугирования такого объема крови необходимо специальное оборудование и стерильные емкости для тромболейковзвеси. Кроме того, для выполнения условий метода необходимо наличие гелий-неонового лазера, что не всегда выполнимо. К недостаткам метода относится также необходимость забора большого объема крови (для получения тромболейковзвеси объемом 280±40 мл), что в случае тяжелого исходного состояния больного не представляется возможным.

Известна методика введения антибиотиков в клеточной взвеси крови при плазмаферезе в лечении острых абсцессов легких, осложненных пиопневмотораксом. Эксфузия крови проводится в объеме 500-1500 мл. После плазмоэкстракции добавляли антибиотик и АТФ, кровь реинфузировали. Введение антибиотиков повторяется каждые 24-48 часов. (Ержанов О.Н. Введение антибиотиков в клеточной взвеси крови при плазмаферезе в лечении острых абсцессов легких, осложненных пиопневмотораксом / О.Н.Ержанов, Д.А.Швецов, Б.А.Даниярова // Тр. 3-го Рос.нац. конгресса «Человек и лекарство» - М., 1996. - C.116).

Недостатком данного метода является необходимость забора крови в объеме 500-1500 мл, что в случае тяжелого исходного состояния больного не представляется возможным.

Известна также методика направленного транспорта антибиотиков с клеточной взвесью из малых объемов крови: в шприц объемом 20 мл с 2500 ЕД (0,5 мл) гепарина и 1 мл полиглюкина набирали из вены 20 мл крови (полиглюкин ускоряет осаждение форменных элементов крови). Взвесь отстаивается непосредственно в шприце, в штативе канюлей кверху в течение 1 ч, после чего отстоявшуюся у иглы плазму выдавливают поршнем, и в шприц с клеточной массой набирают антибиотик в разовой среднетерапевтической дозе, растворенный в 1 мл стерильного физиологического раствора (ф.р.). Периодически встряхивая шприц, создают однородную гомогенную массу взвеси клеток крови с антибиотиком, которую затем инкубируют в термостате при температуре 36-37°С в течение 30 мин, после чего доводят объем крови в шприце стерильным ф.р. до 20 мл и вводят внутривенно. (Направленный транспорт антибиотиков при лечении больных диабетической гнойной остеоартропатией. С.В.Лохвицкий, Ш.А.Ержанова, М.И.Балаболкин, И.М.Сарафанова. Кафедра хирургических болезней №2 Карагандинской медицинской академии, ЭНЦ РАМН, Москва).

Недостатком данного метода является то, что объем 20 мл крови является недостаточным для насыщения антибиотиком.

Целью изобретения является разработка эффективного, доступного и экономически выгодного способа повышения концентрации антибиотиков в форменных элементах крови для антибиотикотерапии методом направленного транспорта.

Техническим результатом изобретения является упрощение методики насыщения форменных элементов крови антибиотиками, повышение концентрации антибиотика внутри форменных элементов крови, высокая терапевтическая эффективность, укорочение срока нормализации состояния больных, экономическая доступность.

Технический результат достигается использованием авторского способа насыщения форменных элементов крови антибиотиком, подтвержденного в эксперименте in vitro.

Экспериментальная доказательная база:

Экспериментальные исследования проводились с использованием выделенных путем центрифугирования донорской крови форменных элементов, к которым добавлялся раствор одного из антибиотиков: цефотаксим (группа цефалоспоринов) и ципринол (группа фторхинолонов).

Было проведено две серии исследований. Первая серия включала экспериментальные исследования с цефотаксимом, при этом 1 г цефотаксима растворяли в 3 мл 0,9% раствора NaCl. В первую пробирку добавляли 300 мкл раствора антибиотика и 100 мкл 0,9% раствора NaCl. Во вторую пробирку - 300 мкл раствора антибиотика и 100 мкл АТФ. В третью пробирку - 300 мкл раствора антибиотика, растворенного в 0,9% растворе NaCl с добавлением KCl 5% (из расчета: на 400 мл 0,9% раствора NaCl - 10 мл KCl 5%) и 100 мкл 0,9% раствора NaCl.

Вторая серия включала экспериментальные исследования с ципринолом, при этом ципринол разводили в 0,9% растворе NaCl в соотношении 1:3.

В 3 пробирки помещали по 1,5 мл форменных элементов крови, полученных в результате отстаивания донорской крови в пробирке с последующим удалением наодосадочной плазмы. В первую пробирку добавляли 1,5 мл раствора антибиотика и 100 мкл 0,9% раствора NaCl. Во вторую пробирку - 1,5 мл раствора антибиотика и 100 мкл АТФ. В третью пробирку - 1,5 мл раствора антибиотика, растворенного в 0,9% растворе NaCl с добавлением KCl 5% (из расчета: на 400 мл 0,9% раствора NaCl - 10 мл KCl 5%) и 100 мкл 0,9% раствора NaCl.

Далее условия эксперимента были одинаковыми в обеих сериях опытов. Взвесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин. Затем центрифугируют в течение 10 минут при скорости 1500 об/мин и отделяют супернатант от клеток. К клеточной массе добавляют дистиллированную воду, тем самым разрушают клетки крови. Затем на спектрофотометре определяют оптическую плотность надосадочной жидкости (супернатанта) и разрушенных форменных элементов. По составленным калибровочным кривым определяется концентрация антибиотика в зависимости от оптической плотности раствора.

Результаты исследования показали, что в обеих сериях (с цефотаксимом и ципринолом) антибиотик в первой пробирке (добавлен 0,9% раствор NaCl) распределился следующим образом: 60% в супернатанте и 40% в форменных элементах. Во второй пробирке (добавлена АТФ) результаты аналогичные. В третьей пробирке (добавлен 0,9% раствор NaCl и 5% раствор KCl) 60% антибиотика находится в форменных элементах, 40% - в супернатанте. Таким образом, добавление в инкубационную среду KCl повышает степень насыщения форменных элементов крови антибиотиком.

Клиническая доказательная база:

Результаты экспериментальной части позволили применять данный способ насыщения клеток крови антибиотиком в направленном транспорте. Предложенный способ заключается в следующем. В шприц набирают из вены кровь, при этом добавляют антикоагулянт и препарат из группы плазмозамещающих растворов на основе декстрана. Взвесь отстаивается непосредственно в шприце, в штативе канюлей кверху. Затем отстоявшуюся у иглы плазму выдавливают поршнем. В шприц с клеточной массой набирают антибиотик в разовой среднетерапевтической дозе. При этом антибиотик растворяют в 0,9% растворе NaCl и 5% растворе KCl. Этот раствор готовят заранее: на 100 мл 0,9% NaCl приходится 2-5 мл 5% KCl. Возможно использование раствора KCl другой концентрации (в зависимости от количества 0,9% раствора NaCl). Полученную взвесь перемешивают и инкубируют в термостате при температуре выше 36,6°С. После этого доводят объем крови в шприце стерильным 0,9% раствором NaCl до первоначального объема и вводят внутривенно.

Эффективность предложенного способа оценена нами при остром гнойном пиелонефрите при введении в премедикации, послеоперационном периоде. Кратность введения соответствовала таковой при традиционном внутривенном введении антибиотиков.

Нами обследовано 26 пациентов с острым гнойным пиелонефритом. Контрольную группу составили пациенты, которым проводилась антибактериальная терапия путем традиционных внутривенных инфузий. Основную группу составили пациенты, которым проводилась антибактериальная терапия с применение метода направленного транспорта, описанная выше.

Результатами лечения стали: увеличение процентного содержания лимфоцитов, сегментоядерных гранулоцитов, уменьшение СОЭ, снижение содержания моноцитов, эозинофилов, палочкоядерных гранулоцитов, что косвенно свидетельствует об устранении воспалительных проявлений. В анализах мочи отмечено значительное снижение количества лейкоцитов мочи и снижение количества активных лейкоцитов. Кроме того, сократился период гипертермии после операции, уменьшилась частота осложнений в послеоперационном периоде, степень интоксикации, а также сократился средний койко-день.

Пример: больной К. Дата рождения: 20.08.1957 г. Поступил в отделение урологии №1 28.02.2006 г. с жалобами на сильные боли в левой поясничной области, повышение температуры тела 38,5°С. Анамнез заболевания: 20 дней назад появились боли в левой поясничной области. Последние 3 дня Т=38,0°С, с ознобами. При осмотре бимануальная пальпация области почек резко болезненная слева.

Лабораторные показатели при поступлении в стационар были следующими:

Общий анализ крови: гемоглобин - 130 г/л, эритроциты - 3,91×10⁹/л, цветной показатель - 0,95, лейкоциты - 8,2×10⁹/л, нейтрофилы палочкоядерные - 7, сегментоядерные - 75, эозинофилы - 1, лимфоциты - 15, моноциты - 2, СОЭ - 53 мм/час.

Биохимический анализ крови: глюкоза - 5,3 ммоль/л, АсАт - 74,5 нмоль/сек л, АлАт - 127,1 нмоль/сек л, мочевина - 4,8 ммоль/л, креатинин - 0,089 мкмоль/л, общий белок - 60,4 г/л.

Свертывающая система крови: АЧТВ - 40 сек, гематокрит - 0,44, тромбиновое время - 15 сек, протромбиновый индекс - 100%, фибриноген - 5,2 г/л.

Общий анализ мочи: соломенно-желтая, кислая, белок - 0,99, плотность - 1015, лейкоциты - 18-20 в поле зрения, эритроциты - 15-20 в поле зрения

При бактериологическом исследовании мочи роста микрофлоры не выявлено.

УЗИ: правая почка 120×48 мм, паренхима 17 мм. Левая почка 137×76 мм, паренхима 45 мм. В области верхнего полюса правой почки эхонегативные образования 34×23 мм, 22×17 мм. В чашечке верхнего сегмента эхопозитивное включение 3-4 мм. В области верхнего сегмента левой почки эхонегативное образование 40×32 мм, в верхнем полюсе 22×17 мм (кисты). По латеральному контуру левой почки гипоэхогенное образование 110×57 мм (очаговое образование). Паранефрий слева диффузно эхонеоднородный. Заключение: признаки диффузно-очаговых изменений левой почки. Кисты почек.

Экскреторная урография: хронический пиелонефрит. Функция почек сохранена.

Компьютерная томография: признаки паранефрита, формирующийся абсцесс левой почки.

Диагноз: нагноившиеся кисты левой почки. Острый гнойно-деструктивный пиелонефрит слева (карбункул левой почки). Паранефрит слева. Кисты правой почки.

Перед операцией 1.03.2006 г.больному в премедикации методом направленного транспорта введено 2 г цефотаксима.

Вид и дата оперативного лечения: 1.03.2006 - нефростомия, декапсуляция левой почки. Вскрытие карбункулов и нагноившихся кист левой почки.

В послеоперационном периоде больному назначена дезинтоксикационная, противовоспалительная и антибактериальная терапия. Антибактериальная терапия проводилась методом направленного транспорта с применением антибиотика цефотаксима в дозировке 2 г, кратностью введения 3 раза в день в течение 5 дней.

Лабораторные показатели от 5.03.2006 г.:

Общий анализ крови: гемоглобин - 132 г/л, эритроциты - 3,81×10¹²/л, цветной показатель - 0,95, лейкоциты - 5,6×10⁹/л, нейтрофилы палочкоядерные - 4, сегментоядерные - 76, эозинофилы - 2, лимфоциты - 18, моноциты - 2, СОЭ - 8 мм/час.

Биохимический анализ крови: глюкоза - 5,2 ммоль/л, АсАт - 76 нмоль/сек. л, АлАт - 152 нмоль/сек. л, мочевина - 4,7 ммоль/л, креатинин - 0,056 мкмоль/л, общий белок - 70 г/л.

Свертывающая система крови: АЧТВ - 37 сек., гематокрит - 0,38, тромбиновое время - 15 сек., протромбиновый индекс - 95%, фибриноген - 5,2 г/л.

Общий анализ мочи: соломенно-желтая, кислая, белок - 0,06, плотность - 1012, лейкоциты - 4-6 в поле зрения, эритроциты - 0-1 в поле зрения.

При бактериологическом исследовании мочи роста микрофлоры не выявлено.

Послеоперационный период протекал без осложнений. На пятый день послеоперационного периода цефотаксим отменен, назначены таблетки ципрофлоксацина в дозировке 500 мг 2 раза в день, внутрь. Рана зажила первичным натяжением, на 8 день швы сняты. 10.03.2006 г. в удовлетворительном состоянии больной выписан из стационара.

Приведенные материалы позволяют заключить, что метод обладает высокой терапевтической эффективностью, обусловленной созданием высоких, длительно сохраняющихся концентраций антибиотика в очаге воспаления, замедленным высвобождением препарата из клеток в сосудистом русле. Наша разработка позволяет упростить методику насыщения форменных элементов крови антибиотиками, повысить концентрацию антибиотика внутри форменных элементов крови, сократить срок нормализации состояния больных.

Изобретение относится к медицине. Антибиотик в разовой среднетерапевтической дозе растворяют в 0,9% растворе NaCl и 5% растворе KCl, причем на 100 мл 0,9% NaCl приходится 2-5 мл 5% KCl. Осуществляют забор крови в шприц и ее отстаивание непосредственно в шприце. Выдавливают поршнем отстоявшуюся плазму. В шприц с клеточной массой набирают полученный раствор антибиотика. Полученную взвесь перемешивают и инкубируют в термостате при температуре выше 36,6°С. Доводят объем крови в шприце стерильным 0,9% раствором NaCl до первоначального. Способ повышает концентрацию антибиотика в форменных элементах крови.

Способ насыщения форменных элементов антибиотиками in vitro, заключающийся в отстаивании донорской крови непосредственно в шприце, выдавливании поршнем отстоявшейся у иглы плазмы и наборе антибиотика в разовой среднетерапевтической дозе в шприц с клеточной массой, отличающийся тем, что антибиотик должен быть предварительно растворен в 0,9% растворе NaCl и 5% растворе KCl из расчета: на 100 мл 0,9% NaCl приходится 2-5 мл 5% KCl; взвесь перемешивают и инкубируют в термостате при температуре выше 36,6°С, доводят объем крови в шприце стерильным 0,9% раствором NaCl до первоначального.