СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ Российский патент 2002 года по МПК A61K33/38 A61P41/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, ветеринарии, микробиологии и может быть использовано, например, в хирургии и в сельском хозяйстве при лечении, например, гнойных хирургических инфекций и их осложнений, вызванных микрофлорой, обладающей гемолитической активностью.

Актуальность вопроса обусловлена тем, что в настоящее время не существует препаратов, обладающих антигемолитической активностью и применяемых в практической медицине, в то время как, например, α-гемолизин является основным фактором патогенности E.coli. Продуцирующие гемолизин штаммы часто выделяются от больных инфекциями мочевого пузыря, бактериемией, септицемией, менингитами и почти не обнаруживаются в нормальной фекальной флоре человека (2).

Способность многих штаммов кишечной палочки вызывать гемолиз эритроцитов человека и животных связана с наличием в клетках E.coli генов α-гемолизина, кодирующих белковый токсин массой 107 кД. Указанный токсин способен не только лизировать эритроциты, но и, повреждая клеточные мембраны, оказывать цитопатическое действие на клетки почечного эпителия, нейроны, лейкоциты, фибробласты, моноциты (1, 2, 5).

Гемолизин является наиболее интенсивно изучаемым токсином (3, 7). Но до сих пор остаются мало изученными и разработанными способы снижения гемолитической активности и нейтрализации патологического действия этого токсина.

Для ряда других гемолизинов установлены вещества, ингибирующие их действие и вызывающие предотвращение гемолитического эффекта. Так, лецитин ингибирует действие гемолизинов стрептококков групп А и В (4), а активность стафилококкового α-токсина и b-лизина резко уменьшается низкими концентрациями фосфатидилхолина. Стафилококковый дельта-токсин не проявляет гемолитических свойств в присутствии естественных фосфолипидов (9). По мнению О.В. Цыгановой механизм подавления фосфолипидами гемолизинов заключается в нарушении взаимодействия токсинов с мембраной эритроцитов (8). Одним из активных ингибиторов гемолиза является холестерин, инактивирующий гемолизин чумной палочки, О₂-лабильных гемолизинов (9). Ряд веществ предотвращает процессы фиксации гемолизинов стафилококков на клетках-мишенях - это конковалин А, танин (предотвращающий связывание α-токсина стафилококка); ганглиозиды Gti и Gdta.

Что касается α-гемолизина E.coli, то ингибирующим действием на гемолиз под влиянием этого токсина обладает ЭДТА и некоторые местные анестетики (10). Эти вещества не могут широко использоваться в клинике для блокирования гемолитических реакций, т.к. обладают рядом побочных эффектов и не являются средствами лечения бактериальных инфекций (6).

В связи с изложенным выявление веществ, препятствующих развитию гемолитических реакций, не только позволит разрабатывать способы борьбы с гемолитическими штаммами, но и приведет к пониманию химической природы, механизмов действия и взаимодействия токсинов с клетками.

Известен способ подавления гемолитической активности кишечной палочки путем использования электролитического раствора гипохлорита натрия (Э.А. Петросян и др. "Влияние электрохимического окисления на некоторые свойства кишечной палочки". Респ. сб. научн. тр. "Острые кишечные инфекции", Л., 1988, вып. 12, стр. 57-59). Указанный способ принят нами за прототип. Данный способ характеризуется тем, что после обработки электролитическим раствором гипохлорита натрия кишечная палочка теряет способность вызывать гемолиз эритроцитов. Однако к недостаткам способа относится то, что сам гипохлорит натрия может вызывать гемолиз эритроцитов.

Настоящее изобретение позволяет избежать нежелательных побочных эффектов, присущих другим препаратам, и повысить эффективность воздействия на гемолитическую активность кишечной палочки за счет использования электролитических растворов серебра с концентрацией серебра 0,5-5,0 мг/л.

Задачами изобретения являются: предложение препарата, подавляющего активность α-гемолизина, являющегося основным фактором патогенности кишечной палочки и тем самым обеспечивающего снижение количества осложнений, уменьшение тяжести течения и сроков лечения гнойных хирургических процессов, вызванных E.Coli.

Сущность изобретения заключается в подавлении гемолитической активности патогенных штаммов E.Coli при введении электролитических растворов серебра с концентрацией серебра 0,5-5,0 мг/л. Воздействие может быть осуществлено как в комплексе с другими медикаментозными препаратами, так и самостоятельным введением электролитического раствора серебра. Продолжительность курса лечения определяется клинической картиной заболевания и может колебаться от 2 до 9 дней. Учитывая безвредность данного препарата (12), по показаниям курс лечения может быть продолжен.

Способ осуществляют следующим образом.

Путем бактериологического исследования определяют наличие E.coli, обладающей гемолитическими свойствами. Электролитический раствор серебра в концентрации 0,5-5,0 мг/л назначают внутривенно один раз в сутки и (или) путем орошения раны два раза в сутки на фоне применения антибиотика. При внутривенном введении электролитическое серебро вводят на физиологическом растворе в объеме 500 мл.

Для доказательства достоверности снижения гемолитической активности микрофлоры использовали штаммы кишечной палочки, обладающие плазмидой гемолиза. В настоящей работе была использована плазмида pRD l/13,1 MD/, содержащая гемолитический детерминант природной плазмиды pSF200 Hly 212, клонированный в векторе pBR325 (5,11). Она имела в 8-10 раз большую гемолитическую активность, чем природный исходный штамм. Плазмида pRDI была введена в штамм Е.соli DH1 (F,rec Al and Al, gyr A96, thi-1, hsd 17 (rc-, mc+), sup E 44, rec A 1?, λ-) (10) методом трансформации. Для выращивания штамма использовали мясопептонный бульон и мясопептонный агар, среду М9.

Определение гемолитической активности осуществлялось следующим образом.

1. Приготовление эритроцитарной взвеси:
Нитратную кроличью кровь троекратно отмывают в изотоническом растворе NaCl. Взвесь эритроцитов вносят в буфер для эритроцитов: 10 мМ трис НСl 7,5 10 мМ CaCl 0,9% NaCl до концентрации 1%.

2. Ночную культуру штамма pRD1 в МПБ подращивают до экспоненциальной фазы роста (OD 540=0,5).

3. Клетки культуры осаждают в центрифуге при 3 тыс. • 15 мин, а надосадочную жидкость, содержащую α-гемолизин, исследуют методом разведений на гемолитическую активность.

4. Надосадочную жидкость культуры pRD1/DH1 разводят в двукратных разведениях в бульоне, затем добавляют 1% эритроцитарную взвесь. Смесь инкубируют 1 час при 37^oС на водяной бане. Контролем служили пробирки с эритроцитарной взвесью без надосадочной жидкости (К) и 1/2 V эритроцитарной взвеси также без надосадочной жидкости (К 50).

5. Измерение клеточной плотности оставшихся эритроцитов проводят спектрофотометром (ОД-620 нм)(5, 7).

6. Для определения влияния серебра на гемолитическую активность в систему дополнительно вводят электролитический раствор серебра в концентрации 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 мг/л.

Результаты опытов при использовании электролитического раствора серебра с концентрацией 0,5 мг/л приведены в таблице 1.

Гемолитическую активность проб выражали произвольной гемолитической единицей (HU), которую определяли как последнее разведение, в котором наблюдается 50% лизис эритроцитов (11).

Как видно из таблицы, активность надосадочной жидкости в присутствии электролитических растворов серебра (исходная концентрация - 0,5 мг/л), выраженная в НИ, равна - 8 HU и отличается от контроля, где гемолитическая активность равна 128-256 HU. Следовательно, наблюдается резкое уменьшение способности α-гемолизина E.coli лизировать эритроциты в присутствии ионов Ag⁺⁺. В таблице 2 приведены результаты изменения гемолитической активности патогенных штаммов кишечной палочки под влиянием различных концентраций электролитических растворов серебра: 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 мг/л.

Из этого можно сделать вывод, что электролитический раствор серебра является веществом, способным предотвращать лизис эритроцитов патогенными E. coli, несущими гемолитическую детерминанту. Механизм этого действия не известен, но, возможно, электролитический раствор серебра, имея положительный заряд, меняет конформацию активного центра α-гемолизина, что препятствует взаимодействию токсина с мембраной клетки-мишени и образованию каналов. Нельзя исключить и влияния препарата на мембрану эритроцитов, приводящего к измерению заряда поверхностных структур, участвующих в рецепции токсина.

НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА α-ГЕМОЛИЗИНА ЭЛЕКТРОЛИТИЧЕСКИМ РАСТВОРОМ СЕРЕБРА
Опыты проводили на мышах весом 20-30 г. Использовали две группы животных по 15 особей в каждой.

I СЕРИЯ. 5-и мышам вводили надосадочную жидкость культуры PRDI (ОН1) на глюкозоминеральной среде Mg (состав в граммах NH₄Cl - 1,0; NaCl - 0,5; NaHPO - 6,0; KHPO - 3,0; MgSO - 0,2; глюкоза 4,0; дистиллированная вода до 1000; рН - 7,2) - в количестве 500 микролитров внутрибрюшинно.

II СЕРИЯ. Вводили последовательно 500 микролитров надосадочной жидкости и 35 микролитров электролитического раствора серебра с концентрацией 0,5 мг/л).

III СЕРИЯ. 500 микролитров среды М9+35 микролитров NaCl.

Результаты опытов приведены в таблице 3.

Как видно из таблицы 2, электролитический раствор серебра вызывал повышение выживаемости мышей, которым предварительно внутрибрюшинно вводили надосадочную жидкость, содержащую α-гемолизин. Это свидетельствует о том, что электролитические растворы серебра обладают антигемолической активностью и могут применяться для лечения инфекций, вызванных гемолитическими штаммами кишечной палочки.

Способ апробирован в клинических условиях на 5 больных. При этом в одном случае электролитические растворы серебра вводились одновременно внутривенно и производилось промывание брюшной полости.

Пример 1. Больному 62 лет по поводу опухолевого процесса произведена субтотальная проксимальная резекция желудка и резекция хвоста поджелудочной железы. Послеоперационный период осложнился развитием несостоятельности швов двенадцатиперстной кишки, перитонитом, формированием абсцесса брюшной полости и развитием септического состояния. Антибиотикотерапия, включая пенициллин, ампициллин, кефзол, цепорин, не принесла эффекта. Бактериологическое исследование отделяемого брюшной полости выявило E.coli, обладающую гемолитическими свойствами и не чувствительную к антибиотикам. По жизненным показаниям назначено внутривенное введение 500 мл электролитического раствора серебра на физиологическом растворе (концентрация 5 мг/л) на фоне применения 12 млн. ед. пенициллина в сутки. В течение двух суток температура нормализовалась. Введение электролитического раствора серебра продолжалось 9 суток. К 12 дню состояние больного стало удовлетворительным.

Пример 2. У больного 65 лет, страдающего диабетом, после операции ампутации голени в верхней трети, произведенной по поводу гангрены, развилось нагноение раны и септическое состояние. Посев показал наличие в ране гемолитического штамма кишечной палочки. Применение антибиотиков не дало положительного эффекта. Назначено внутривенное введение 500 мл электролитического раствора серебра на физиологическом растворе (концентрация 0,5 мг/л). В течение 3 суток температура нормализовалась. Введение электролитического раствора серебра продолжалось в течение 2 дней. Одновременно 2 раза в сутки осуществляли орошение раны электролизным раствором серебра. Состояние больного стабилизировалось. Рана очистилась и в последующем пациент был выписан в удовлетворительном состоянии.

Новым в способе является то, что использование электролитических растворов серебра позволяет получить неожиданно высокий положительный эффект за счет сочетанного использования антибиотиков и электролитических растворов серебра или как самостоятельного препарата.

Изобретательским уровнем в заявке можно считать обнаружение неописанной прежде способности электролизного серебра в концентрации 0,5-5,0 мг/л подавлять гемолитическую активность бактерий и предлагаемый в связи с этим способ применения растворов электролизного серебра, позволяющий одновременно использовать антимикробные и антигемолитические свойства электролизного серебра. Серийное использование в медицине не вызывает сомнения, поэтому, по мнению авторов, не требует дополнительных разъяснений.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно воздействовать на микрофлору, обладающую гемолитической активностью, приводящей к значительному утяжелению течения основного процесса. Способ при использовании в практическом здравоохранении позволяет нейтрализовать патологические реакции при взаимодействии Н1у+ штаммов E. Coli с организмом больного, применить доступное дешевое и эффективное вещество, ингибирующее действие гемолизина. Способ позволяет устранить возможные осложнения и значительно сократить сроки лечения.

ЛИТЕРАТУРА
1. Hugnes C.D. Muller, J. Hacher and W. Loebel, 1982, Genetic and pathogenetic role Escherichie coli hemolysin. Toxican 20, p. 247-257.

2. H. W. Smith, H.B. Huggins. The toxic role of Alphahaemolisin in the pathogenesis of experimental E. coli infection in mice. J. of Gen Microb. 1985, 131, p. 395-403.

3. J. Hacher, H. Hof, L. Emody and Loebel. Influence of cloned Escherichia coli haemolisin henes, S. fimbria and serum resistance on pathogenicity in ditterent animal models. Microbiol. Patogenesis, 1986, N 1, p. 1533-1547.

4. Bornside Cr., Bois P.J., Coch J. Hemoglobin and E. coli, a letal intraperitoneal complination. J. Bacteriol. 1968, N 5, p. 1567-1571.

5. Rault M., M. Stuning and W. Konig. Metabolism of leucotrienes by 1-glutamyltranspeptidase and dipepsidase from human polimorphonu clear granulocites. Immunology, 1985, N 55, p. 135-137.

6. S. Brakdi, N. Mackman I-M. Nicand. Holland J.В., Escherichia coli Hemolysin may damage target cell membranes by generating transmembrane pores intect and immunity. 1986, N 1, V. 52, р. 63-69.

7. Mackman N. Holland J.B. Secretion of a 107 dalton polypeptide into the medium from a haemolytise E. coli К 12 strain Mol Gen Jenet. 1984, 193, p. 312-315.

8. О.И. Цыганова. Бактериальные гемолизины и их связь с вирулентностью. Ставрополь. М. М. 1982.

9. Л. В. Романова, Б.И. Мишанькин, А.Н. Кравцов. Молекулярное клонирование и экспрессия Hly-генов E. coli. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология, 1984, 2, 34 с.

10. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984 г.

11. Кульский Л.А. Серебряная вода. Киев. "Наукова думка", 1987 г.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для подавления гемолитической активности патогенных штаммов кишечной палочки. Больному вводят электролитический раствор серебра в концентрации 0,5-5,0 мг/л в течение 2-9 сут. Используют раствор как самостоятельно, так и одновременно с антибиотиками. Способ позволяет нейтрализовать действие гемолизина патогенных штаммов кишечной палочки. Это повышает эффективность лечения больных. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ подавления гемолитической активности патогенных штаммов кишечной палочки, включающий использование электролитического раствора, отличающийся тем, что больному вводят электролитический раствор серебра в концентрации 0,5-5,0 мг/л. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что электролитический раствор серебра вводят одновременно с антибиотиками. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что электролитический раствор серебра вводят в течение 2-9 сут.