СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА Российский патент 2008 года по МПК A61B5/16 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии.

Цель изобретения - определение состояния клеточного иммунитета при помощи шкалы тревоги Тейлора и Сарассона для оптимизации диагностики и слежения за течением опухолевого процесса у больных раком мочевого пузыря.

Актуальность изобретения становится очевидной, если учесть, что для мониторинга заболеваний, связанных с изменением иммунологического статуса, в том числе злокачественных новообразований, используются такие сложные и дорогие методики, как тест спонтанного розеткообразования и (или) определение уровня неоптерина в сыворотке крови человека.

В 1981 году Всемирная организация здравоохранения опубликовала Меморандум по правильному и неправильному применению широко используемых методов клинической иммунологии. В соответствие с Меморандумом определение количества В- и Т-клеток абсолютно необходимо для диагностики и слежения первичных иммунодефицитов и полезно для исследования вторичных иммунодефицитов (Петров Р.В., 1987).

Определение уровня неоптерина в сыворотке крови человека является новым полезным методом для мониторинга заболеваний, связанных с активацией клеточного иммунитета, в том числе злокачественных новообразований (Westermann J. с соавт., 2000; Smith D. с соавт., 2003).

В качестве прототипа авторы предлагают иммуноферментный метод количественного определения неоптерина в сыворотке крови (Westermann J. с соавт., 2000; Smith D. с соавт., 2003).

Принцип метода конкурентного иммуноферментного анализа с использованием тест-набора Neopterin ELISA (IBL, Hamburg) заключается в том, что антиген, конъюгированный с пероксидазой, и неконъюгированный антиген конкурируют между собой за ограниченное число мест связывания при взаимодействии с антителами кролика к неоптерину человека. Комплекс пероксидаза - конъюгированный антиген - антитело связывается с поверхностью лунок на стрипе для микротитрования, покрытых антителами козы с антителами кролика. Несвязавшийся антиген удаляется из лунок на стадии промывания. После проведения ферментативной реакции со специфическим субстратом в лунках измеряют поглощение при 450 нм. Количество комплексов, связавшихся с поверхностью микролунок, и оптическая плотность обратно пропорциональны концентрации неоптерина в исследуемом образце. Количественное определение проводят путем сравнения ферментативной активности в исследуемом образце с кривой, полученной при анализе стандартов с известными концентрациями.

Процедура анализа состоит из 10 пунктов:

1. Вносят в соответствующие лунки по 10 мкл стандартов, контролей и исследуемых образцов пациента.

2. Вносят в каждую лунку по 10 мкл свежеприготовленного ферментного конъюгата (1:201).

3. Вносят по 50 мкл антисыворотки к неоптерину в каждую лунку.

4. Закрывают планшет черной адгезивной пленкой. Инкубируют в течение 90 минут при комнатной температуре (18-25°С) на шейкере (500 об/мин) в темноте.

5. Снимают адгезивную пленку, удаляют раствор из лунок, промывают лунки микропланшета 3 раза по 250 мкл разведенного буфера для промывок. Удаляют остатки буфера, перевернув микропланшет и постучав им по фильтровальной бумаге.

6. При добавлении субстрата и стоп-раствора, если возможно, используют 8-канальную пипетку.

7. Вносят в каждую лунку по 200 мкл свежеприготовленного раствора ТМВ субстрата.

8. Инкубируют микропланшет в течение 10 минут при комнатной температуре (18-25°С).

9. Останавливают реакцию добавлением во все лунки 100 мкл ТМВ стоп-реагента. Перемешивают содержимое лунок, аккуратно встряхивая микропланшет.

10. Измеряют в лунках оптическую плотность при 450 нм (длина волны сравнения 600-650 нм) с помощью фотометра для микропланшетов (в течение 15 минут после остановки реакции).

Подсчет результатов проводится после получения калибровочной кривой.

Ожидаемые значения. Обычно в сыворотке крови здорового человека содержится <2 нг/мл неоптерина. Рост показателя при онкологических заболеваниях отмечается при прогрессировании опухолевого процесса и рассматривается в мировой литературе как маркер активации клеточного иммунитета (Свиридов Е.А., Телегина Т.А., 2005; Wirleitner В., Schroeckandel К., 2005).

К недостаткам исследования клеточного иммунитета с помощью иммуноферментного метода количественного определения неоптерина в сыворотке крови можно отнести: 1) высокую стоимость иммуноферментного набора Neopterin ELISA (IBL, Hamburg); 2) достаточно сложную процедуру анализа; 3) большие затраты времени.

Авторы предлагают способ определения прогрессирования течения опухолевого процесса с помощью шкалы тревоги Тейлора и Сарассона в модификации Н.Имидадзе (Наракидзе В.Г., 1975). Каждый пункт шкалы пишется на отдельной карточке (всего 50). Дается задание выбрать те карточки, содержание которых, по мнению испытуемого, его характеризует. Коэффициент равен числу карточек, избранных испытуемым (1 карточка - 1 балл). Чем выше коэффициент, тем выше уровень тревожности.

40-50 баллов - очень высокий уровень тревожности,

25-40 баллов - высокий уровень,

15-25 баллов - средний с тенденцией к высокому,

5-15 баллов - средний с тенденцией к низкому,

0-5 баллов - низкий уровень тревожности.

Следует отметить, что количество баллов, соответствующее высокому и очень высокому уровню тревожности, встречается крайне редко.

Авторами обследовано 40 больных раком мочевого пузыря в возрасте от 51 до 71 года, которым определялся уровень неоптерина сыворотки крови и уровень тревожности с помощью шкалы Тейлора и Сарассона. Установлено, что у 16 больных, имеющих нормальный уровень неоптерина (2 нг/мл и менее), уровень тревожности равнялся 7,0±1,9 баллов. У 24 пациентов с повышенным содержанием неоптерина в сыворотке крови (>2 нг/мл), свидетельствующим о высокой степени напряженности клеточного иммунитета, уровень тревожности составил 16,1±3,9 баллов, что достоверно больше, чем у больных первой группы (Р<0,05). Следовательно, уровень тревожности от 12,2 до 20 баллов шкалы Тейлора и Сарассона является признаком активации клеточного иммунитета при прогрессировании опухолевого процесса.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в следующем:

1) Способ не требует приобретения дорого оборудования.

2) Метод является технически простым и не требует значительных усилий для его освоения.

3) Предложенный способ определния состояния клеточного иммунитета требует минимальных затрат времени (<5 минут) и поэтому применим в амбулаторных условиях.

Клинические примеры

Больной К., 67 лет. Диагноз: рак мочевого пузыря. Уровень тревожности по шкале Тейлора и Сарассона равняется 8 баллам. Содержание неоптерина в сыворотке крови 1,69 нг/мл, что соответствует норме (<2 нг/мл). Больной прооперирован: трансуретральная резекция мочевого пузыря. Наблюдение больного в течение 1 года показало - без рецидивов и метастазов.

Больной Н., 65 лет. Диагноз: рак мочевого пузыря. Уровень тревожности по шкале Тейлора и Сарассона равен 20 баллам. Содержание неоптерина в сыворотке крови 35,26 нг/мл, что значительно выше нормы, свидетельствует об активности клеточного иммунитета и позволяет сделать предположение о прогрессировании опухолевого процесса. Действительно, при дальнейшем обследовании у больного выявлены метастазы в печень.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. По шкале Тейлора и Сарассона определяют уровень тревожности. При уровне тревожности от 12,2 до 20 баллов диагностируют прогрессирование опухолевого процесса. Способ позволяет упростить определение прогрессирования течения опухолевого процесса.

Способ определения прогрессирования течения опухолевого процесса, отличающийся тем, что по шкале Тейлора и Сарассона определяют уровень тревожности и при уровне тревожности от 12,2 до 20 баллов диагностируют прогрессирование опухолевого процесса.