МУТАНТНЫЙ ШТАММ BURKHOLDERIA CEPACIA KM196, ДЕФЕКТНЫЙ ПО ПРОДУКЦИИ ПОРИНА OpcP1, ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ У ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и генетике и касается получения штамма, обладающего повышенной чувствительностью к антибиотикам различных классов, несущего индуцированную N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (НГ) мутацию в последовательности гена opcP1, ответственного за экспрессию перового белка с молекулярной массой 36 kDa. Штамм предназначен для изучения молекулярно-генетических основ множественной лекарственной резистентности у B.cepacia и филогенетически родственных видов буркхольдерий. Мутант депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «М») под номером КМ196. Особенностями штамма является опосредованный действием химического мутагена (НГ) дефект в продукции порина OpcPl, сочетающийся с фенотипом множественной чувствительности к антибиотикам (пефлоксацину, офлоксацину, цефтазидиму, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу).

B.cepacia, как и другие патогенные представители рода Burkholderia, характеризуется высокой природной резистентностью к антибиотикам, в формировании которой участвуют различные молекулярные механизмы [6, 10, 11, 15]. Принципиальное значение для развития множественной резистентности у B.cepacia имеют изменения в проницаемости клеточной оболочки, связанные с функцией ЛПС [9] и белков наружных мембран [5]. Отмечена роль порообразующих белков наружной мембраны в резистентности B.cepacia к бета-лактамам [5], аминогликозидам и полимиксину [14], салицилатам [6]. Клонированы и секвенированы последовательности гена, ответственного за липопротеин наружной мембраны мутанта B.cepacia с множественной резистентностью к хлорамфениколу, триметориму и цефтазидиму [7]. Показано функционирование этого порина в составе выявленной у B.cepacia системы лекарственного эффлюкса.

Необходимыми элементами модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих устойчивость к тем или иным антимикробным соединениям, являются маркированные штаммы с измененной чувствительностью к антибиотикам [1, 2, 8, 12]. Для изучения молекулярных механизмов устойчивости к антибиотикам фторхинолонового (пефлоксацин, офлоксацин) и цефалоспоринового (цефтазидим) ряда у различных видов буркхольдерий (B.pseudomallei, В.mallei, B.cepacia) проведено получение штаммов с повышенной резистентностью к препаратам, характеризующихся дополнительной множественной резистентностью широкого спектра, включающего аминогликозиды, тетрациклины, хлорамфениколы [3, 4]. При анализе белковых спектров этих штаммов [4, 17] установлено варьирование продукции белков наружных мембран с различной молекулярной массой, в том числе полифункциональных поринов мембранной транспортной системы клеток с M_r 36 кДа (B.cepacia) и M_r 39 кДа (B.pseudomallei). Роль этих поринов, имеющих сходные структурно-функциональные характеристики [16], в формировании резистентности множественного типа у патогенных буркхольдерий не изучена.

Прототипом сконструированного штамма B.cepacia KM196 являлся полученный методом направленной селекции мутант B.cepacia SMR2 с повышенным уровнем резистентности к антибиотикам фторхинолонового (МПК пефлоксацина более >200 мкг/мл) и цефалоспоринового (МПК цефтазидима >250 мкг/мл) ряда, характеризующийся измененной экспрессией ряда мембранных протеинов.

Целью изобретения является получение мутанта с повышенной чувствительностью к антибиотикам множественного типа, позволяющего оценивать роль поринов, входящих в состав мажорных белков наружной мембраны B.cepacia, являющихся частью многофункциональной системы транспорта через мембрану различных соединений, стабильно сохраняющего свои свойства при хранении, культивировании на питательных средах, пассировании через организм лабораторных животных.

Заявляемый штамм B.cepacia KM196 получен в результате двух циклов НГ мутагенеза штамма B.cepacia 25416 и последующего направленного выделения мутантных клонов на понижающихся от МПК для исходного штамма концентрациях пефлоксацина (офлоксацина) и цефтазидима. Среди мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам классов цефалоспоринов и фторхинолонов далее осуществляли отбор клонов, чувствительных к канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, недостаточных по продукции мажорных белков наружной мембраны. Предлагаемый штамм является вариантом с селектированными маркерами чувствительности Pfx^SOfx^SfCz^SKan^STet^SChl^S, дефектным по белку-порину ОрсР1 с M_r 36 кДа и обозначен в рабочей коллекции как B.cepacia 25416 NSP.

Основные свойства штамма.

Культурально-морфологические свойства: грамотрицательные палочки; культуры штамма растут в факультативных аэробных условиях на полноценных питательных средах (МПА, МПБ, L-arap, Nutrient agar, Nutrient broth «Difco» (США), Tryptic soy agar (broth) «Difco» (США) при оптимальной температуре 37°С, рН 6.8-7.2. На плотных питательных средах через 24 ч формируют гладкие полупрозрачные колонии, которые через 48 ч приобретают пигментацию бежевого цвета; в бульоне через 24 ч дают помутнение и образование тонкой пленки, через 48 ч - образование плотной пленки кремового цвета и рыхлого осадка на дне.

Биохимическая активность: в тесте Хью-Лейфсона - окисление глюкозы (+), мальтозы (+); оксидаза (+), аргининдигидролаза (-), лизиндекарбокси-лаза (+), орнитиндекарбоксилаза (-), желатиназа (-), L-арабиноза (+), Аrа (+).

Устойчивость к антибиотикам: штамм чувствителен к пефлоксацину (МПК<3 мкг/мл), офлоксацину (МПК<5 мкг/мл), цефтазидиму (МПК<3 мкг/мл); канамицину (МПК<20 мкг/мл), тетрациклину (МПК<30 мкг/мл); левомицетину (МПК<5 мкг/мл).

Отношение к видовым диагностическим сывороткам: диагностируется в РДД с преципитирующей сывороткой к штамму B.cepacia 25416.

Белковый спектр: дефектен по продукции белков наружной мембраны M_r 21, 27, 36, kDa;

Вирулентность: не вирулентен для белых мышей (LD₅₀>5×10⁸ м.к.).

Питательные потребности: прототроф.

Генетические особенности: Pfx^SOfx^SCfz^SKan^STet^SChl^SОрсР^-.

Полученный с помощью описанных приемов штамм B.cepacia 25416 NSP депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «М») под номером КМ196.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Определение основных культурально-биохимических свойств мутанта B.cepacia KM196.

При посеве в Nutrient broth через 48 ч при 37°С культура штамма B.cepacia KM196 давала равномерное помутнение среды с образованием на поверхности пигментированной пленки и придонного осадка; на Nutrient agar через 24-48 ч вырастала в виде полупрозрачных колоний в S-форме бежевого оттенка.

Определение биохимических свойств показало наличие признаков, характерных для типового штамма B.cepacia 25416 (окисляет, но не ферментирует глюкозу на среде Хью-Лейфсона, обладает оксидазной, лизиндекарбоксилазной активностью, не имеет аргининдигидролазной, орнитиндекорбоксилазной и желатиназной активности; утилизирует из минимальной среды арабинозу, Ara+). На среде Skin milk («Difco», США) не гидролизует козеин молока, не проявляет лецитиназной и липазной активности.

МПК антибиотиков различных классов для культур мутантного штамма (1×10⁷ м.к./мл) определяли на плотной питательной среде, используя общепринятый метод серийных разведений. Результаты представлены в таблице 1. Показано, что мутант B.cepacia KM196 имеет сниженную в сравнении с исходным штаммом резистентность к ряду препаратов различных классов, отличающихся по механизму действия на клетку.

Определение вирулентности. Мутант B.cepacia KM196 не вирулентен для белых мышей. При внутрибрюшинном заражении культурой в дозе 5×10⁸ м.к. гибель лабораторных животных не наблюдали в течение 21 сут. Заражение на фоне применения иммунодепрессантов (гидрокортизон, циклофосфамид) также не вызывало гибели белых мышей.

Пример 2. Анализ экспрессии мажорных белков клеточных мембран В. cepacia KM196.

Для изучение продукции белков клеточных мембран мутантного штамма использовали электрофорез в SDS-полиакриламидных гелях по Laemmli [13]. Анализ в SDS-PAGE препаратов клеточных мембран, выделенных из исследованных штаммов, показал у В. cepacia 25416 NSP наличие дефекта в продукции белков M_r 21, 27, 36 kDa (рисунок 1). В. cepacia 25416 NSP (KM196 - трек 7).

Пример 3. ПЦР-анализ последовательности гена орсР1 мутанта B.cepacia KM196.

Для детекции последовательности орсР1 полимеразную цепную реакцию проводили с олигонуклеотидными праймерами bpsomp39s и bpsomp39as, фланкирующими кодирующую последовательность гена omp39 В. pseudomallei, гомологичного opcP1 B.cepacia [16], таблица 2.

ДНК выделяли из клеток 24 ч культур исследуемого штамма на Nutrient agar. Культуру суспендировали в 0,15 М Nad до плотности 2×10⁹ м.к./мл, смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-НСl, 100 мМ КСl, 5 мМ MgCl₂, 0,2 мг/мл желатина, 0,9% Nonidet P-40, 0,9% Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К) и инкубировали при 65°С 120 мин; прогревали при 95°С 30 мин для инактивации фермента. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 1 мин и использовали 10 мкл супернатанта, 1×реакционный буфер (Интерлабсервис, Россия), 1,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого dNTP, 15 пмоль каждого праймера, 1 ед. ДиаТак ДНК-полимеразы (Интерлабсервис, Россия). Амплификацию последовательностей пориновых генов орсР1 В.cepacia и omp39 В.pseudomallei проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) по программе: начальный прогрев 95°С 5 мин, 35 реакционных циклов (94°С 30 с, 57°С 30 с, 72°С 60 с), финальная элонгация 72°С 10 мин. Электрофоретический анализ ПЦР-ампликонов проводили в 1,5-2% агарозных гелях, окрашивая ДНК этидиум бромидом. Продукты ПЦР анализировали в 1,5% агарозном геле (рис.2).

Установлено, что у мутантного штамма В.cepacia KM196 (трек 3) не обнаружены продукты амплификации, по размеру соответствующие фрагментам ДНК, выявляемым у исходного штамма В.cepacia 25416.

Таким образом, мутант В.cepacia KM196 с фенотипом множественной чувствительности к антибиотикам (Pfx^SOfx^SCfz^SKan^STet^SChl^S) дефектен по гену орсР1 и не продуцирует детерминируемый им порообразующий белок ОрсР1 с M_r 36 kDa.

Таблица 1 Устойчивость к антибиотикам индуцированного НГ мутанта В.cepacia KM196 Штаммы В.cepacia Фенотип МПК, мкг/мл Cfz Pfx Ofx Tet Kan Chl 25416 W.t 30 10 20 200 250 50 25416 NSP (KM196) Tet^SKan^SChl^SPfe^SCfz^S 2.5 2.5 5 10 10 2 Примечания: Cfz - цефтазидим, Pfx - пефлоксацин, Chl - хлорамфеникол, Tet - тетрациклин, Kan - канамицин

Описан новый штамм Burkholderia cepscia KM196, несущий индуцированную нитрозогуанидином (НГ) мутацию в последовательности гена opcP1, ответственного за экспрессию перового белка с м.м. 36 kDa. Штамм получен в результате двух циклов мутагенеза] N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (НГ) штамма B.cepacia 25416 и последующего направленного выделения мутантных клонов на понижающихся от МПК для исходного штамма концентрациях пефлоксацина (офлоксацина) и цефтазидима. Среди мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам классов цефалоспоринов и фторхинолонов отбирают клоны, чувствительные к канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, недостаточные по продукции мажорных белков наружной мембраны. Штамм 25416 - вариант с селектированными маркерами чувствительности к пефлоксацину, офлоксацину, цефтазидиму, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу (Pfx^SOfx^SCfz^SKan^STet^SChl^S), дефектным по белку-порину OpcP1 с M_r 36 кДа и депонирован в ГКПБ «Микроб» под номером 25416 NSP. Штамм обладает повышенной чувствительностью к антибиотикам различных классов и предназначен для изучения молекулярно-генетических основ множественной лекарственной резистентности у B.cepacia и филогенетически родственных видов буркхольдерий. 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Мутантный штамм Burkholderia cepacia KM196 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), дефектный по продукции порина ОрсР1, для исследования механизмов множественной резистентности к антибиотикам у патогенных буркхольдерий.