СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ АДЕНОВИРУСОВ ПТИЦ Российский патент 2003 года по МПК C12N7/02 A61K39/235 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и касается способа получения антигенов аденовирусов птиц.

Основными антигенами в структуре аденовирусов, на которые возникает иммунный ответ в организме при попадании вируса в организм, являются белки капсида вируса - гексон и фибер.

Современные представления о структуре возбудителя позволяют получать профилактические и диагностические препараты на основе очищенных антигенных компонентов возбудителя без этапов его аттенуации и инактивации.

Известны способы получения антигенов аденовирусов, включающие выращивание вируса в культуре клеток, выделение антигенов из культуральной среды и клеток и их очистку. Способы сходны между собой на этапах выращивания и извлечения антигенов из клеток или культуральной среды и различаются на этапе очистки антигенов. Очистку проводят препаративным электрофорезом, различными методами хроматографии или их комбинацией. Для повышения степени очистки антигена осуществляют дополнительное концентрирование, повторную кристаллизацию или очистку, обессоливание (Virology, 1967, v. 33, р. 575-583; J. Biochem. , 1973, v. 39, р. 37-42; J. Mol. Biol, 1974, v. 89, р. 163-178; А.С. СССР 1364342, А 61 К 39/00, 1988), что приводит к нарушению структуры антигенов, количественным потерям, удорожанию конечного продукта. В качестве ближайшего аналога выбран способ получения аденовирусных антигенов по А.С. СССР 1364342, А 61 К 39/00, 1988, включающий получение антигенов на клеточных культурах с последующей очисткой антигенов сорбционной хроматографией в две стадии. Способ разработан для получения аденовирусных антигенов млекопитающих из клеток и культуральной жидкости и не применим для получения антигенов аденовирусов птиц, которые выращивают в эмбрионах птиц и по некоторым физико-химическим свойствам отличаются от антигенов аденовирусов млекопитающих.

Задача изобретения - получение очищенных антигенов аденовирусов птиц для использования их в качестве препаратов для диагностики и профилактики.

Для этого в способе получения антигенов аденовирусов птиц, включающем выращивание аденовирусов и очистку антигенов сорбционной хроматографией, выращивание аденовирусов птиц осуществляют в эмбрионах птиц, а сорбционную хроматографию проводят в одну стадию, для чего супернатант после центрифугирования подкисляют до рН 4,5-5,0 и наносят на сорбент, предварительно уравновешенный буферным раствором до рН 4,5-5,0, затем через колонку пропускают уравновешивающий буфер и производят эллюцию антигена с сорбента буферным раствором рН 9,0 с необязательным добавлением 10% изопропанола или 10% этанола.

Предлагаемый способ обеспечивает количественный выход целевого продукта и не требует дополнительных процедур выделения и очистки, как в случае использования инфицированных клеточных культур. Способ технологически прост и осуществим в крупномасштабном производстве.

Антигены, полученные предлагаемым способом, сохраняют полную антигенность и иммуногенность и могут быть использованы в качестве вакцинных и диагностических препаратов без дополнительной инактивации.

Способ осуществляется следующим образом.

В аллантоисную полость птичьих эмбрионов вводят инфекционный штамм вируса. После инкубации эмбрионов при температуре 37^oС в течение 3-х суток отбирают вируссодержащую аллантоисную жидкость, осветляют ее центрифугированием, подкисляют до рН 4,5-5,0 и наносят на колонку с гидрофобным сорбентом с рН 4,5-5,0. После чего антигены элюируют буферным раствором рН 9,0. Наличие и количество белка в элюате определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм, а степень чистоты антигенов - электрофорезом в ПААГ-ДСН.

Для осуществления способа использовали аденовирусы, вызывающие заболевания домашней птицы, ССЯ-76 (синдром снижения яйценоскости-76) и Celo (аденовирус птиц 1 серотипа). В качестве сорбентов применяли фенилсефарозу 650М, "Toson", Япония (пример 1), макропористое стекло бутил-МПС с диаметром пор 80-160 мкм, Россия, (пример 2) и бутил-тойоперл 650С, "Toson", Япония (пример 3). Способ осуществим и с другими гидрофобными сорбентами. Для сорбции антигенов используют кислые буферные растворы, например калий-ацетатный или натрий-ацетатный, а для элюции антигенов - щелочные буферные растворы, например калий-фосфатный или натрий-карбонатный. Содержание белка в элюате определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм, степень чистоты антигенов - электрофорезом в ПААГ-ДСН по методу Laemmli (Laemmli U.K. Nature, 1970, v. 227, р. 680-685).

Пример 1. В аллантоисную полость 21-дневных утиных эмбрионов вводят инфекционный штамм аденовируса вируса ССЯ-76 в стандартной дозе 0,05 Б.О.Е. на эмбрион. Через трое суток инкубации при температуре 37^oС отбирают вируссодержащую аллантоисную жидкость и осветляют ее центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант подкисляют до рН 4,5 5М буферным раствором ацетата калия и в количестве 150 мл со скоростью 200 мл/час наносят на колонку (2,5•2,5 см) с сорбентом, уравновешенную 10 мМ буферным раствором ацетата калия рН 4,0. Затем через колонку пропускают 250 мл уравновешивающего буфера со скоростью 200 мл/час. Элюцию антигенов с сорбента проводят 20 мМ буферным раствором фосфата калия рН 9,0 со скоростью 15 мл/час. Выход антигена составил 97%. Степень чистоты 96%.

Пример 2. В аллантоисную полость 21-дневных куриных эмбрионов вводят инфекционный штамм вируса Celo в стандартной дозе 0,05 Б.О.Е. на эмбрион. Через трое суток инкубации при температуре 37^oС отбирают вируссодержащую аллантоисную жидкость и осветляют ее центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант подкисляют до рН 4,5 5М буферным раствором ацетата калия и в количестве 1000 мл со скоростью 1000 мл/час наносят на колонку (4,6•5,0 см) с сорбентом, уравновешенную 10 мМ буферным раствором ацетата калия рН 4,5. Затем через колонку пропускают 250 мл уравновешивающего буфера с той же скоростью. Элюцию антигенов с сорбента проводят 20 мМ буферным раствором фосфата калия рН 9,0 со скоростью 100 мл/час. Для ускорения процесса элюции добавляют 10% изопропанола. Выход антигена составил 94% со степенью чистоты 94%.

Пример 3. В аллантоисную полость 21-дневных утиных эмбрионов вводят инфекционный штамм вируса ССЯ-76 в стандартной дозе 0,05 Б.О.Е. на эмбрион. Через трое суток инкубации при температуре 37^oС отбирают вируссодержащую аллантоисную жидкость и осветляют ее центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант подкисляют до рН 5,0 5М буферным раствором ацетата натрия и в количестве 350 мл со скоростью 300 мл/час наносят на колонку с сорбентом (2,5•3,0 см), уравновешенную 10 мМ буферным раствором ацетата натрия рН 4,5. После нанесения материала через колонку пропускают 250 мл уравновешивающего буфера с той же скоростью. Элюцию антигенов с сорбента проводят 20 мМ буферным раствором карбоната натрия рН 9,0, содержащим 10% этанола, со скоростью 100 мл/час. Выход антигена составил 96% со степенью чистоты 95%.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и касается способа получения антигенов аденовирусов птиц. Способ предусматривает выращивание аденовирусов и очистку антигенов сорбционной хроматографией. Выращивание аленовирусов птиц проводят на эмбрионах птиц. Сорбционную хроматографию проводят в одну стадию, для чего супернатант после центрифугирования подкисляют до рН 4,5-5,0 и наносят на сорбент, который предварительно уравновешен буферным раствором до рН 4,5-5,0. Далее через колонку пропускают уравновешивающий буфер и проводят элюцию антигена с сорбента буферным раствором рН 9,0. Способ позволяет получать антиген аденовирусов птиц с выходом 94-97% и чистотой 94-96%. Предложенный способ может быть использован для получения препаратов антигенов аденовирусов птиц для диагностики и профилактики. 1 з. п. ф-лы.

1. Способ получения антигенов аденовирусов птиц, включающий выращивание аденовирусов и очистку антигенов сорбционной хроматографией, отличающийся тем, что выращивание аденовирусов птиц осуществляют в эмбрионах птиц, а сорбционную хроматографию проводят в одну стадию, для чего супернатант после центрифугирования подкисляют до рН 4,5-5,0 и наносят на сорбент, предварительно уравновешенный буферным раствором до рН 4,5-5,0, после чего через колонку пропускают уравновешивающий буфер и производят элюцию антигена с сорбента буферным раствором рН 9,0.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию антигена с сорбента осуществляют с добавлением 10% изопропанола или 10% этанола.