СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМЕДИЦИНСКОГО МАТЕРИАЛА И МАТЕРИАЛ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ Российский патент 2008 года по МПК A61L27/04 A61L27/06 A61L27/24 A61F2/28 

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам получения новых пористых биомедицинских материалов на основе сплава титан-кобальт, которые могут быть использованы для изготовления костных имплантатов.

Разработка и создание новых материалов для костных имплантатов остается актуальной задачей современной имплантологии и стоматологии. Дальнейший прогресс в этой области связан с развитием высоких технологий получения новых материалов для имплантатов. В последнее время в медицине все более широкое применение получают композиционные материалы, которые сочетают в себе свойства металлов, полимеров и керамики. Одновременно с этим определенный интерес представляют пористые материалы, которые по своей структуре и свойствам максимально соответствовали бы костной ткани. С одной стороны, пористые материалы обеспечивают процесс остеоинтеграции, с другой - возможно использование таких материалов в качестве носителей клеточного материала, в первую очередь, стволовых клеток (D.I.Ilan, A.L.Ladd: Bone Graft Substitutes, Operative Techniques in Plastic and Reconstructive Surgery, 2003, vol.9, pp.151-160; S.J.Simske, R.A.Ayers, T.A.Bateman: Porous materials for bone engineering, Mater Sci Forum, 1997, vol.250, pp.151; T.W.Bauer, G.F.Muschler: Bone graft materials: an overview of the basic science, Clin Orthop Rel Res, 2000, vol.371, pp.10-27). Одним из таких перспективных материалов для имплантатов являются сплавы на основе титан-кобальт.

Сплавы на основе кобальта широко используются в ортопедической стоматологии для изготовления отливок каркасов зубных протезов (RU 2009247 C1, C22C 19/07, 15.03.1994), для изготовления металлических частей зубных протезов (RU 2021882 C1, B22F 3/12, С22С 1/04, С22С 19/07, А61К 6/04, 30.10.1994; RU 2057492 C1, A61C 13/083, 10.04.1996). Сплавы представляют большой интерес для медицины поскольку обладают высокими прочностью, коррозионной стойкостью и низкой изнашиваемостью (D.Granch, et al., Biomater., 1999, 20, 1079). Несмотря на такие положительные характеристики кобальтовых сплавов, они, по сравнению с титановыми, имеют более низкую биологическую совместимость. При вживлении в организм имплантатов, изготовленных из кобальтовых сплавов, вокруг них образуются не вполне жизнеспособные зернистые ткани, кровоснабжение данных тканей затруднено, что приводит к интенсивному освобождению имплантата (Иголкин А.И. Титан в медицине. Титан, 1993, N 1, с.86-90, М. ВИЛС). Для того чтобы избежать отрицательного влияния, в частности, кобальта на живой организм существуют различные способы. Одним из таких способов является нанесение путем плазменного напыления биоактивных покрытий на поверхность металлических (кобальтсодержащих) материалов. (Yanke S.J., Pletka В.J., Luckey H.A., Jonson W.A. Process for fabrication НА coatings for biomedical aplications. Sprey Conference. May 2-25, 1990; Long beac, CA: 433-438; Ducheyene P., Radin S., Healy K., Cuckler J.М. The effect of plasma-spreying on the stracture and properties of calcium phospate ceramics. 34th Annual miting, Orthopedic Reasearch Sociaty. Februry 1-4, 1988, Atlanta, GA:50).

Другим вариантом является способ покрытия поверхности металлических эндопротезов гидроксиапатитом (ГАП) (RU 2158189 C1, B05D 7/24, B05D 7/14, A61L 27/00, 27.10.2000), который включает смешивание порошка гидроксиапатита со связующим веществом, сушку, термический обжиг, причем в качестве связующего вещества используют фосфатные связки, а порошок (ГАП) и фосфатную связку берут в соотношении 1-1,5:1,5-2, обжиг проводят при 250-600°С.

Металлические эндопротезы, покрытые известным способом, при использовании в медицине позволяют улучшить клинические результаты за счет регулирования соотношения аморфных и кристаллических фаз гидроксиапатита и как следствие этого регулировать процессы биоактивности покрытия в зависимости от вида и предназначения имплантата.

Однако известный способ получения биомедицинского материала длителен по времени, многостадиен, при приготовлении материала покрытия используется фосфорная кислота, что накладывает ограничения на способ в части экологии. Покрытие имеет неравномерный характер распределения аморфных и кристаллических фаз, что сказывается на биологической совместимости с живыми тканями.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является способ получения ортопедического имплантата на основе кобальтсодержащего сплава, включающий приготовление экзотермической смеси порошков оксида кобальта с металлом, в качестве которого используют: алюминий, магний, цирконий, компактирование смеси, инициирование химической реакции самораспространяющегося высокотемпературного синтеза (СВС) путем локального нагрева компакта под давлением инертного газа (гелий, неон, аргон, криптон, ксенон, радон) 0,08-1,0 атм и температуре предварительного нагрева 933-950 К (660-677°С), в течение 1-5 с (US 6896846, С22В 5/04, 24.05.2005). Дополнительно в состав исходных компонентов для повышения твердости конечного материала могут быть введены хром, молибден, титан, их карбиды, нитрид титана, а также оксид алюминия или железа. Способ обладает высокой производительностью, характерной для всех процессов, протекающих в режиме СВС. Однако полученный материал имеет сложный состав, представляет собой литой сплав (пористость не более 1%), обладает недостаточно высокой биоактивностью и совместимостью с живыми тканями и малоэффективен для использования в костнопластической хирургии.

Задачей предложенного решения является создание нового способа получения нового биомедицинского пористого материала для имплантатов на основе сплава титан-кобальт с заданными структурой и свойствами, обладающего высокой биоактивностью, совместимостью с живыми тканями и который может быть использован для создания костных имплантатов в ортопедии и стоматологии.

Техническим результатом является упрощение способа получения, повышение биологической совместимости полученного пористого материала на основе сплава титан-кобальт с живыми тканями при его высоких механических характеристиках.

Технический результат достигается тем, что способ получения биомедицинского материала на основе сплава титан-кобальт в режиме СВС, включает приготовление экзотермической смеси исходных реагентов из порошка титана и кобальта, добавление в смесь не более 4 мас.% гидрида титана и не более 15 мас.% аморфного нанодисперсного порошка гидроксиапатита кальция или аморфного нанокомпозита гидроксиапатита кальция с биополимером природного происхождения, прессование из смеси исходных порошков заготовки, размещение ее в реакторе СВС, предварительный нагрев заготовки до температуры 350-580°С, инициирование процесса горения в инертной атмосфере, с последующим выделением целевого продукта. В качестве биополимера природного происхождения используют, по крайней мере, один, выбранный из ряда, включающего: коллаген, желатин, кератин, альгинат натрия, ксантан, карбоксиметил целлюлоза, хитозан.

Полученный биомедицинский материал представляет собой пористый сплав, соответствующий формуле TiCo, с общей пористостью 55-70% при доле открытой пористости 90-98%, с размерами пор 200-800 мкм, имеющими вытянутую форму, перегородки между порами также имеют пористую структуру с преобладанием пор округлой формы, диаметром около 100 мкм, при этом поверхность порового пространства сплава покрыта соединениями кальция, фосфора и кислорода, являющимися продуктами разложения гидроксиапатита кальция, с преобладающим содержанием перовскита кальция. Материал нецитотоксичен, клетки имеют характерную распластанность и активно мигрируют внутрь порового пространства.

Относительно наиболее близкого аналога предлагаемый способ отличается природой исходных компонентов, их соотношением, введением в смесь различных видов ГАП кальция: аморфного, аморфного нанокомпозита с биополимером природного происхождения, гидрида титана и параметрами предварительного нагрева спрессованной смеси компонентов.

Общими признаками являются: локальное инициирование процесса горения предварительно спрессованной смеси компонентов в атмосфере инертного газа с последующим реагированием компонентов в режиме СВС.

Виды исходных порошков ГАП, которые были использованы для осуществления изобретения:

- Гидроксиапатит кальция [Са₁₀(PO₄)₆ОН₂] в виде аморфного нанодисперсного порошка с размерами частиц 5-10 нм (ТУ 6-09-3538-91;

Санитарно-эпидемиологическое заключение №77.01.12.262.п. 26688.11.3 от 21.11.03. В краткой записи ГАП_аморф.

- Нанокомпозит аморфного гидроксиапатита кальция с биополимерами (патент RU 2235061 С2, 27.08.2004), в частности «БИАЛЬГИН» - аморфный, нанодисперсный гидроксиапатит кальция в виде микрогранул диаметром 0,5-1 мкм. Микрогранулы в свою очередь состоят из нанодисперсных, эпитаксиально расположенных частиц гидроксиапатита кальция размером 5-10 нм и волокон, неплотно сформированных из тех же частиц, включенных в органическую оболочку из биополимера природного происхождения. В краткой записи ГАП_орг.

- Гидроксиапатит кальция кристаллический, полученный известными методами, например по RU 2147290 С1, 10.04.2000 или RU 21492827 С1, 27.08.2004. В краткой записи ГАП_кр.

В качестве гидрида титана использовали микропорошок, полученный методом СВС по патенту RU2208573, 20.07.2003. Однако может быть использован любой другой порошок, как отечественного, так и импортного производства.

Порошки титана и кобальта использовали как отечественного, так и импортного производства: Ti (ПТС, <25 мкм) и Со (<2 мкм).

Для проведения тестирования материалов на цитотоксичность и определения их адгезивных характеристик была использована первичная культура клеток, выделенных из эмбриона человека на сроке 6 недель. Клетки культивировали в среде ДМЕМ/199 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% CO₂. Культура клеток на 11 пассаже (CD133^-, Cd117^-, CD45^-, CD90⁺, CD54^-, CD62L^-, CD62P^-, CD9⁺, CD34^-, CD31^-, CD71^-, CD20^-, CD157^-, СD106⁺, CD62E⁺) была использована для тестирования материалов, типирование культуры говорит о принадлежности клеток к разряду мезенхимальных стволовых. Клетки высевали на поверхности образцов с плотностью 35 тыс./см² и культивировали в течение 72 часов. Тестирование материалов на цитотоксичность проводили путем исследования жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток на поверхности культурального пластика (NUNC) при сокультивировании их с металлами. Материал считали токсичным для клеток при появлении в культуре более 10% апоптотических клеток при сокультивировании их с исследуемыми материалами. Гибель клеток определяли стандартным методом по включению трипанового синего. Адгезионные характеристики материалов и степень их влияния на жизнедеятельность клеток определяли путем оценки морфологии клеток, высеянных на поверхность исследуемых материалов. Оценку морфологии и жизнеспособности клеток проводили на микроскопе ЛЮМАМ И2 с использованием метода окрашивания клеток 0,0002% раствором акридинового оранжевого в фосфатном буфере. Данный краситель селективно взаимодействует с ДНК и РНК путем интеркаляции или электростатического притяжения соответственно. При этом связанная с красителем ДНК флуоресцирует в зеленом свете (525 нм), а электростатически связанный с РНК акридиновый оранжевый флуоресцирует в красной области (>630 нм). Это делает возможным общую оценку состояния клеток (активность, пролиферирация, покой, апоптоз) (Darzynkiewicz Z. et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13(8):795-808, 1992).

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1 (сравнительный).

Готовят экзотермическую смесь из порошков титана и кобальта, взятых в стехиометрическом соотношении на получение TiCo. Затем в смесь добавляют 1 мас.% гидрида титана TiH₂, 10 мас.% ГАП_кр., перемешивают, прессуют образцы в виде цилиндров диаметром 12 мм, высотой 15-16 мм, с плотностью 3,4-3,7 г/см³, размещают образцы в реактор СВС, реактор вакуумируют, заполняют аргоном до давления 1 атм, размещенные образцы нагревают в реакторе до 580°С, после чего инициируют процесс горения (реакцию СВС) раскаленной вольфрамовой спиралью. После прохождения реакции полученный материал охлаждают в среде аргона, затем его извлекают и анализируют известными методами.

Полученный пористый материал представляет собой образец с общей пористостью 50-55%, доля открытой пористости составляет не более 90% от общей пористости, размер пор варьируется от 50 мкм до 80 мкм. Предел прочности на сжатие полученного материала составляет 70 МПа.

Тестирование данного материала на цитотоксичность и определение его адгезивных характеристик показало, что полученный пористый материал токсичен для клеток и не может использоваться в медицинской практике.

Пример 2.

Готовят экзотермическую смесь из порошков титана и кобальта, взятых в стехиометрическом соотношении на получение TiCo. В смесь добавляют 1 мас.% гидрида титана TiH₂, перемешивают, после этого в смесь вводят 10 мас.% ГАП_орг. и все тщательно перемешивают. В качестве биополимера природного происхождения ГАП_орг. содержит коллаген. После прессования смеси образцы в виде цилиндров диаметром 12 мм, высотой 13-14 мм, с плотностью 3,0-3,2 г/см³ размещают в реактор СВС, реактор вакуумируют, заполняют аргоном до давления 1 атм, затем образцы нагревают до 350°С, после чего инициируют процесс горения раскаленной вольфрамовой спиралью. После прохождения реакции СВС полученный материал охлаждают в среде аргона, извлекают и анализируют известными методами.

Полученный пористый материал представляет собой образец с пористостью 55-60%, доля открытой пористости составляет 90-98% от общей пористости. Поры имеют вытянутую форму, размер пор 200-500 мкм. При этом перегородки между порами тоже имеют пористую структуру, преобладают поры округлой формы, диаметром приблизительно 100 мкм.

Предел прочности на сжатие полученного материала составляет 130 МПа. Исследование микроструктуры и элементного состава синтезированных композиционных материалов показало, что матрицы образцов состоят из одной фазы TiCo. Поверхность пор покрыта соединениями кальция, фосфора и кислорода, являющимися продуктами разложения ГАП, с преобладающим содержанием перовскита кальция формулы CaTiO₃.

Тестирование данного материала на цитотоксичность и определение его адгезивных характеристик показало, что полученный пористый материал нецитотоксичен, имеет высокие показатели активности мезенхимальных стволовых клеток (наблюдались характерное распластывание и миграция клеток внутрь порового пространства, синтез РНК) и характеризуется высоким интеграционным потенциалом.

При использовании ГАП_орг. с другими биополимерами, указанными в формуле, получают пористый материал со свойствами материала по примеру 2 и высокими биомедицинскими характеристиками.

Пример 3.

Готовят экзотермическую смесь из порошков титана и кобальта, взятых в стехиометрическом соотношении на получение TiCo. В смесь добавляют 4 мас.% гидрида титана TiH₂, перемешивают, затем в эту смесь добавляют 15 мас.%. ГАП_аморф., все тщательно перемешивают. Прессуют образцы в виде цилиндров диаметром 12 мм, высотой 12-14 мм, с плотностью 3,2-3,5 г/см³, размещают образцы в реактор СВС, реактор вакуумируют, заполняют аргоном до давления 1 атм, после чего размещенные образцы нагревают до 580°С и инициируют процесс горения раскаленной вольфрамовой спиралью. После прохождения реакции СВС полученный материал охлаждают в среде аргона, извлекают и анализируют известными методами.

Полученный пористый материал представляет собой образец с пористостью 60-70%, доля открытой пористости составляет 95-98% от общей пористости. Поры имеют вытянутую форму, размер пор 300-800 мкм. При этом перегородки между порами тоже имеют пористую структуру, преобладают поры округлой формы, диаметром приблизительно 100 мкм. Предел прочности на сжатие полученного материала составляет 35 МПа. Исследование микроструктуры и элементного состава синтезированных композиционных материалов показало, что матрицы образцов состоят из одной фазы TiCo. Поверхность пор покрыта соединениями кальция, фосфора и кислорода, являющимися продуктами разложения ГАП.

Тестирование данного материала на цитотоксичность и определение его адгезивных характеристик показало, что полученный пористый материал нецитотоксичен, имеет более высокие показатели активности мезенхимальных стволовых клеток, характеризуется более высоким интеграционным потенциалом по сравнению с материалом, полученным в примере 2.

Исследование структуры полученных материалов было проведено на образцах методом локального рентгеноспектрального анализа на рентгеновском микроанализаторе "Superprobe JCXA-733". Прочностные характеристики материалов определяли при одноосном нагружении образцов на испытательной машине «Инстрон-1195» (о сжатия). Фазовый состав полученных материалов определяли методом рентгенофазового анализа с помощью установки ДРОН-3 на медном излучении.

Оценку токсичности композитных материалов Ti-Co-ГАП, полученных методом СВС, проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) по критериям: адгезия клеток и распластывание клеток. Для этого использовали стандартный тест на цитотоксичность материалов с использованием культуры эмбриональных «кожно-мышечных» фибробластов человека.

На фиг.1 представлены фотографии структуры образцов материалов, полученных предложенным методом. Все образцы обладают равномерной открытой пористостью 50-70%. Видно, что в зависимости от химического и фазового состава ГАП, добавляемого в исходную смесь, меняется не только величина пористости, но и форма и размер пор полученного материала. Так при использовании кристаллического ГАП (сравнительный) размер пор 50-80 мкм, преобладают поры округлой формы (фиг.1а). При добавке аморфного ГАП и нанокомпозита аморфного гидроксиапатита кальция с биополимерами пористая структура образцов изменяется - поры имеют вытянутую форму, размер пор 200-800 мкм (фиг.1б, 1в). При этом перегородки между порами тоже имеют пористую структуру, преобладают поры округлой формы, диаметром около 100 мкм. Образец, не содержащий добавок ГАП (сравнительный), характеризуется неравномерной пористостью, а размер пор варьируется от 50 мкм до 80 мкм (фиг.1г).

Исследование микроструктуры и элементного составов образцов того же состава, что и на фиг.1, показало, что при добавке ГАП в исходную смесь матрицы синтезированных образцов состоят из одной фазы TiCo (фиг.2). Поверхность пор образцов с добавками ГАП покрыта соединениями кальция, фосфора и кислорода. Матрица образцов, синтезированных без добавок ГАП, состоит из двух фаз - TiCo и TiCo₂ (фиг.2г сравнительный).

Таким образом, введение ГАП_аморф. и ГАП_орг. в исходную смесь положительно влияет на эксплуатационные характеристики нового материала (доля открытой пористости 90-98% и предел прочности материала на сжатие до 130 МПа).

Кроме указанных характеристик новый материал проявляет высокий уровень биологической совместимости к клеточным элементам, на которой основывается прогнозируемая их способность к остеоинтеграции.

Исследование с применением СЭМ показало, что метод, основанный на изучении контакта культивированных фибробластов эмбрионов человека с поверхностью образцов, позволяет исследовать не только токсикологические характеристики испытуемых образцов, но и их интеграционный потенциал по отношению к живым тканям, для чего были использованы показатели адгезии клеток и их распластывания.

На фиг.3 представлен рост мезенхимальных стволовых клеток в объеме пор и на поверхности синтезированных образцов: а) по примеру 1; б) по примеру 2, в) по примеру 3, г) Ti+Co (сравнительный).

На фиг.4 представлен рост клеточной ткани в порах образцов, а) по примеру 1; б) по примеру 2; в) по примеру 3; г) Ti+Co (сравнительный).

Установлено, что наиболее высоким интеграционным потенциалом обладают образцы, полученные из Ti+Со+10%ГАП_орг.+1%TiH₂ (пример 2) и Ti+Co+15%ГАП_аморф.+4%TiH₂ (пример 3). Использование ГАП_орг не только облегчает формирование пор, но и приводит к модификации свойств их поверхности. По результатам элементного анализа поверхность поры содержит кальций, фосфор, кислород, что является более благоприятным для клеток.

Исследования полученного материала показали, что клетки имеют характерную распластанность и активно мигрируют внутрь порового пространства. Использование флуоресцентного красителя, который селективно взаимодействует с ДНК и РНК путем интеркаляции или электростатического притяжения соответственно, позволило установить пролиферативную и биосинтетическую активность клеток при культивировании их на поверхности данного материала. При этом клеточная гибель составляет не более 5%, что соответствует показателям в контроле при выращивании клеток на поверхности специально обработанного для роста клеток полистирола (культуральный пластик производства фирмы NUNC).

Таким образом: разработан новый способ получения новых пористых биомедицинских материалов на основе сплава Ti-Co в режиме СВС, позволяющий формировать материалы с равномерной однофазной структурой и свойствами, обладающими высокой биоактивностью и совместимостью с живыми тканями; определены оптимальные параметры способа.

Заявленная совокупность признаков способа позволяет получить новый биомедицинский материал для имплантатов с открытой пористостью 55-70%, и структурой поверхности порового пространства, позволяющей адгезию и миграцию мезенхимальных стволовых клеток.

Новый материал может найти применение для создания костных имплантатов в ортопедии и стоматологии.

Тестирование заявленного материала на цитотоксичность и определение его адгезивных характеристик показало, что полученный пористый материал не обладает токсичностью, имеет высокие показатели активности мезенхимальных стволовых клеток и высокий интеграционный потенциал.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам получения новых пористых биомедицинских материалов на основе сплава титан-кобальт, которые могут быть использованы для изготовления костных имплантатов. Способ получения биомедицинского материала на основе сплава титан-кобальт в режиме СВС, включает приготовление экзотермической смеси исходных реагентов из порошка титана и кобальта, добавление в смесь не более 4 мас.% гидрида титана, и не более 15 мас.% аморфного нанодисперсного порошка гидроксиапатита кальция (ГАП) или нанокомпозита гидроксиапатита кальция с биополимерами, прессование из смеси исходных порошков заготовки, размещение ее в реакторе СВС, предварительный нагрев заготовки до температуры 350-580°С, инициирование процесса горения в инертной атмосфере с последующим выделением целевого продукта. Полученный биомедицинский материал представляет собой пористый сплав, соответствующий формуле TiCo, с общей пористостью 55-70% при доле открытой пористости 90-98%, с размерами пор 200-800 мкм, имеющими вытянутую форму, перегородки между порами также имеют пористую структуру с преобладанием пор округлой формы диаметром около 100 мкм, при этом поверхность порового пространства сплава покрыта соединениями кальция, фосфора и кислорода, являющимися продуктами разложения гидроксиапатита, с преобладающим содержанием перовскита кальция. Материал нецитотоксичен, клетки имеют характерную распластанность и активно мигрируют внутрь порового пространства. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ получения биомедицинского материала на основе сплава титан-кобальт в режиме СВС, включающий приготовление экзотермической смеси исходных реагентов из порошка титана и кобальта, добавление в смесь не более 4 мас.% гидрида титана, и не более 15 мас.% аморфного нанодисперсного порошка гидроксиапатита кальция или аморфного нанокомпозита гидроксиапатита кальция с биополимером природного происхождения, прессование из смеси исходных порошков заготовки, размещение ее в реакторе СВС, предварительный нагрев заготовки до температуры 350-580°С, инициирование процесса горения в инертной атмосфере с последующим выделением целевого продукта.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биополимера природного происхождения используют, по крайней мере, один, выбранный из ряда, включающего: коллаген, желатин, кератин, альгинат натрия, ксантан, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан.3. Материал, полученный по способу по пп.1 и 2, характеризующийся тем, что он представляет собой пористый сплав, соответствующий формуле TiCo, с общей пористостью 55-70% при доле открытой пористости 90-98%, с размерами пор 200-800 мкм, имеющими вытянутую форму, перегородки между порами также имеют пористую структуру с преобладанием пор округлой формы, диаметром около 100 мкм, при этом поверхность порового пространства сплава покрыта соединениями кальция, фосфора и кислорода, являющимися продуктами разложения гидроксиапатита кальция, с преобладающим содержанием перовскита кальция.4. Материал по п.3, характеризующийся тем, что он нецитотоксичен, клетки имеют характерную распластанность и активно мигрируют внутрь порового пространства.