Способ обработки клеток бактерий,имеющих глюкозоизомеразную активность,перед процессом получения продукта,содержащего фруктозу Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

I

Изобретение относится к области биохимии.

Известно, что глюкозоизомеразный фермент может быть использован для каталитического ускорения перерабатки глюкозы (декстрозы) во фруктозу левулезу), которая обладает более высокой способностью подслащивания, чем исходный материал. Глюкозоизомераза образуется главным образом внутри клеток бактернй, которые растут в процессе их производства. Эти клетки отфильтровывают из культуральной среды и непосредственно использук)т в качестве источника глюкозоизомеразы.

Желательно, чтобы клетки бактерий, обладающих активностью глюкозоизомеразы, могли использоваться в непрерывном процессе изомерации глюкозы во фруктозу. Предлагались различные способы иммобилизации фермента для того, чтобы он мог быть повторно использован в непрерывном процессе.

Известен один из способов обработки клеток бактерий, имеющих глюкозоизомеразную активность 1).

Суть способа заключается в обработке клеток бактерий глутаровым альдегидом. При этом глюкозоизомераза нммобнлнзуется в клетках и клетки могут быть использованы в реакторе с перенащиваннем или в колонне изомеризацни. Однако установлено, что если клетки бактерий с иммобилизованной глюкозоизомеразной активностью не будут обработаны перед использованием в качестве катализаторов изомеризации, то они не будут иметь удовлетворительную физическую устойчивость, а это ухудщает гидравлические характеристики колонны, В результате получаемый изомернзованный сироп может иметь нежелательную окраску, а время жнзни фермента будет недостаточно продолжительным.

Целью изобретения является придание клеткам бактерий физической устойчивости.

Для этого клетки бактерий, обладающие глюкозоизомеразной активностью, смешнвают при температуре 10-27°С с водным раствором глюкозы при рН 8,0, измеренном при 25°С для гидратации клеток и стабилизации рН, образуют слой клеток

и пропускают через него водный раствор глюкозы при- и рН 7,5-8,0, измеренном при 60°С, до получения прозрачного раствора и стабилизации рН на уровне 7,5-8,0, измеренном при 60°С.

Целесообразно, чтобы водный раствор глюкозы имел декстрозный эквивалент 97- 98 и 30-50 вес.°/о сухих веществ, из которых глюкоза составляет 93-96 вес.%. Можно использовать для осуществления этого способа клетки бактерий, . обработанные глутаровым альдегидом. Пропускать водный раствор через слой клеток следует снизу вверх при величине расхода 53-61 л/м площади поперечного сечения в 1 мин. Водный раствор глюкозы может содержать кобальт в концентрации 0,0005 м/л, магний - 0,005-0,007 м/л и 0,01 N лимонную кислоту.

Клетки бактерий с глюкозоизомеразной активностью могут быть получены с помощью хорошо известных способов. Предпочтительные знзимсодержащие клетки получают глубинным выращиванием в аэробных условиях культуры Sfreptornuces olivaceus NNRS 3583 или его мутантов в среде, содержащей соответствующие питательные вещества. Получаемые клетки бактерий отделяют от культуральной среды фильтро.ванием или центрифугированием.

Для иммобилизации глюкозоизомеразы могут быть использованы различные хорошо известные способы. Предпочтительно отделенные клетки бактерий суспендировать в водной среде и смешивать с глутаропым альдегидом в количестве примерно от 0,1 до 60 вес.% (в пересчете на сухое вещество клеток).

Так как обработанные клетки бактерий, содержащие фермент, обычно вырабатывают в ином месте и раньше того вре.мени, когда получают продукт, содержащий фруктозу, то для хранения и транспортировки клетки обычно высушивают. Тако высушивание до величины влагосодержания примерно 3-10 вес.°/о может быть осуществлено в любом сущильном аппарате при температуре примерно 60-70°С. Получаемые аггломерированные высушенные клетки затем сортируют по размеру для последующегоиспользования в слое колонны. Аггломерированную высушенную массу клеток обычно разделяют на небольшие части при минимальном нажиме на клетки. Эти части помещают на сита для получени фракции, которая задерживается на сите 60 меш и проходит через сито 20 меш.

Если приготовленные аггломераты длеток бакте.рий должны использоваться в производстве сиропа из глюкозы, содержащего фруктозу, то их перед тем как поместить в колонну, обрабатывают согласно изобретению. Если в колонну загрузить необработайные клетки, то необходимо значительное время до того, чтобы реакция изомеризации стабилизировалась в относительно постоянном состоянии. В течение этого времени получаемый изомеризованный сироп имеет

нежелательную окраску. При этом время жизни клеток (физическая устойчивость) короткое.

Соответственно описан1гому способу клетки прежде всего смешивают с водой или с водным раствором глюкозы. Этот последний раствор может состоять из глюкозы, растворенной в воде. Предпочтителен состав из осахаренного раствора высококачественной глюкозы, получаемого энзи.матической переработкой крахмала. Этот раствор

глюкозы должен содержать примерно 30- 50 вес.% растворенных твердых веществ, а также твердые вещества должны содержать примерно 93-96 вес.% глюкозы. Глюкозный эквивалент раствора глюкозы составляет примерно 97-98. Воду или раствор глюкозы используют в количестве примерно 10 вес. ч, на 1 вес. ч. высушенных клеток. Температура воды или раствора глюкозы составляет примерно 10-27°С. В воде или растворе глюкозы может содержаться

5 также кобальт в виде хлорида кобальта в мольной концентрации примерно 0,005, магний в виде гидроокиси магния в мольной концентрации при.мерно 0,005-0,007 и хелатный и буферный агент (лимонная кислота) в нop faльнoй концентрации примерно 0,01. Лимонная кислота является предпочтительной потому,что она образует растворимый хелатный комплекс с нонами кобальта и магния и участвует R образовании буферного действия воды или раствора глюкозы при желаемой величине р11. Вода или раствор глюкозы должны иметь рН 8,0 измеренный при 25°С. Такую величину рН обычно получают добавлением соответствующего количества едкого натра. Клетки и

о вода или раствор глюкозы поддерживаются в ко 1такте при минимальном перемешивании в течение примерно I ч. За это время происходит гидратация клетки и стабилизация величины рН.

Массу, состоящую из клеток и воды или раствора глюкозы, нолученную на указанной стадии, направляют на соответствующую реакционную колонну с двойными стенками для получения слоя, имеющего толO шину в отстоявшемся состоянии примерно 89-100 см. Перемешивание массы должно быть минимальным для того, чтобы уменьшить всякое механическое повреждение аггломератов клеток. В одном из вариантов изобретения раствор глюкозС) того же сос тава, что и описанные выше, с рН 7,5-8,0, замеренным при 60°С, пропускают (при температуре примерно 60°С) снизу вверх через слой клеток нри. расходе примерно 53-6 л/м площади поперечного сечения слоя в I мин. Это такой расход, который дает увеличение установившегося объема аггломератов клеток примерно на 50- 60 об.%. О также обеспечивает желаемую классификацию и перегруппировку аггломератов клеток. Когда начинает поступать раст вор глюкозы, в рубашку колоикы пропускают теплоагент с температурой 60°С. Раствор, выходящий из верхней части колонны, имеет значительное количество окрашиваюпцих веществ, так как он содержит различные остатки клеток бактерий. Горячий раствор глюкозы следует пропускать снизу вверх через колонну до тех пор, пока выходящий поток не станет светлым и пока рН выходящего потока ие установится на величине 7,5-8,0, измеренной при 60°С. Это требует раствора в количестве примерно равном 2-3 об. слоя в I ч в течение I-3 ч. Затем подачу раствора глюкозы прекращают и слою клеток дают отстояться. Лля уменьщения количества раствора глюкозы, требуемой для такой предварительной обработки, слабо окрашенную часть выходящего раствора глюкозы можно использовать повторно. Величина рН рециркулируемого материала должна быть доведена до 7,5-8,0 и замерена при 60°С. В варианте изобретения клетки в колонне реактора первоначально обрабатывают пропусканием раствора того же состава, что н водный раствор, описанный выше, при температуре примерно 10-27°С и рН 8,0 измеренном при 25°С, снизу вверх через слой клеток до тех пор, пока выходящий раствор не станет светлым, а рН не установится 8,0 (измеряется при 25°С). После этого пропускают водный раствор глюкозы того же состава, что и описанный выше раствор глюкозы, снизу вверх через слой при температуре 60°С и рН 7,5-8,0, измеренном при 60°С, до тех пор, пока вы.ходящий поток не будет иметь такое же содержание глюкозы, что и входящий поток глюкозы. Во время указанной выше обработки водный раствор и водный раствор глюкозы рециркулируют через слой. Величину рН рециркулируемого материала доводят до желаемого уровня добавлением щелочи. Все растворы глюкозы, которые вступают в контакт с к летками бактерий, имеют глюкозоизомеразную активность, которая содержит некоторое количество фруктозы, образованной реакцией изомеризации. Следовательно растворы глюкозы, используемые на указанных выше стадиях предварительной обработки, могут быть обесцвечены углем, умягчены ионообменными материалами, а затем использованы в качестве компонентов фруктозосодержащих продуктов. Клетки, обработанные указанным способом, затем могут быть использованы для получения изомеризованного сиропа. Раствор глюкозы описанного состава может быть пропущен нисходящим потоком через слой при величине рН примерно 8,0 и температуре примерно 60°С для получения продукта, содержащего примерно 42-48 вес./о фруктозы, в зависимости от расхода потока. Аггло.мераты клеток, предварительно обработанные по предлагаемому способу, имеют высокую физическую стабильность и хорЬшие гидравлические характеристики, вполFie подходящие для использоьлнкя в сравнительно толстых слоях (76-102 см). Использование клеток, обработанных по известны.м способам, должно ограничиваться тонкими слоями (1,3-10,2 см) при крайне большой площади поверхности. Пример . Культуральную среду, содержащую клетки бактерий Streptom ces ofcvaeeusffi}RS3583, получают выращиванием таких клеток в среде, содержащей ксилозу. Величину рН культуральной среды доводят до 8,2 добавлением гидроокиси натрия. Водный раствор глутарового альдегида добавляют в бродильную среду из расчета 7 вес./о (на сухое вещество к,аеток в среде). Полученную смесь перемешивают в течение 1,5 ч. В это время добавляют гидроокись натрия для поддержания величины рН на уровне 8,2. Затем клетки профильтровывают, промывают до рН 8,0 и затем высушивают при 60-70°С до содержания сухих веществ 3- 10 вес./о. Высушенные клетки фракционируют на сите для получения фракции, которая задерживается ситом 60 меш и проходит через сито 20 меш. Полученные отсортированные и высушенные аггломераты клеток бактерий; содержап1ие иммобилизованную глюкозоизомеразу, затем помешают на хранение при комнатной температуре перед их дальнейшим использо(анием. При необходимости берут 300 г сухих клеток и смешивают с водным раствором глюкозы, полученным энзнматической обработкой крахмала. Этот раствор имеет глюкозный эквивалент 97 и содержит 30 вес растворенных твердых веществ. Твердые вещества содержат 94 вес./о глюкозы. Температура раствора 10- 27°С. Его используют из расчета 10 вес. ч. на I вес. ч. высушенных клеток. В растворе также содержится хлорид кобальта в концентрации 0,0005 м/л, гидроокись магния в концентрации примерно 0,005 - 0,007 м/л и лимонная кислота в нормальной концентрации примерно 0,01. В него добавляют гидроокись натрия в количестве, достаточном для того, чтобы поддерживать рМ раствора на уровне 8,0, амеряемый при 2Г)С. Клетки выдерживают в контакте с pacTfiopoM глюкозы примерно 771 в течение 1 ч, для их гидратации и выравнивания рИ. Полученную массу клеток и раствор глюкозы направляют в реакционную колонну диаметром 3,75 см , снабженную рубаш кой, и образуют слой клеток толщиной примерно 89-100 см. Перемешивание массы должно быть минимальным для того, чтобы уменьшить всякое механическое повреждение гидратированных клеток. Раствор глюкозы того же состава, что описанный выше, с рН 7,5-8,0 . (измерен .при 60°С) пропускают при 60°С снизу вверх через слой клеток при расходе потока 53-61 л/м площади поперечного сечения в 1 мин. При поступлении в раствор глюкозы в слой через рубашку колонны пропускают теплоагент с температурой 60°С. Горячий раствор глгокозы пропускают снизу вверх через колонну в течение I ч до тех пор, пока выходящий раствор не становится светлым и величина рН не устанавливается на уровне 7,5-8,0 (измеряют при 60°С). Затем подачу раствора глюкозы прекращают и клеткам дают отстояться в течение 15-20 мин. Во время указанной обработки раствор глюкозы рециркулируют через слой клеток. Величину рН рециркулируемого раствора гдюкозы поддерживают равной 7,5-8,0 (измеряют при 60°С) путем добавления гидроокиси натрия. Во время обработки величину рН нельзя уменьшать ниже 7,0,так как это может привести к физическому повреждению аггломератов клеток. После этого слой клеток готов к использованию для изомеризации глюкозы во.фруктозу. Раствор глюкозы того же самого состава, что и описанный выше, пропускают самотеком при напоре примерно 10,2-15,2 см через указанный слой при температуре 60°С и расходе примерно равном 1,5 объемам слоя в 1 час. В этом случае расход составляет примерно 22 л/м площади поперечного сечения в I ч. Величину рН раствора глюкозы поддерживают равной 8 (замеряемой при 60°С) путем добавления гидроокиси натрия. Получают изомеризованный сироп, содержаний примерно 42-43 вес,% фруктозы в пересчете на вес растворенных твердых веществ, не имеющий окраски и не содержащий псикозы (psicose). Когда расход подачи сиропа глюкозы уменьшают до 1,1 об. слоя в ч (16,3 л/м2 в 1 ч), то получают продукт, содержащий примерно 45-46 вес./о фруктозы (в пересчете на вес растворенных твердых веществ имею,щим окраски и не содержащий глюкозы. Указанный слой клеток использовали непрерывно лля изомеризации в течение бо-, лее 1000 ч и при этом активность аггломера-tJB клеток уменьщилксь весьма незначиельно . При использовании клеток, не обрабоанных по описанному способу, они теряли по меньшей мере половину своей энзимной активности примерно после 500-600 ч непрерывной работы. . Пример 2. Аналогично, примеру I получают порцию отсортированных по размеру аггломератов клеток бактерий (300 г), содержащих иммобилизованную глюкозоизомеразу. Приготавливают водный раствор, содержащий хлорид кобальта в концентрации примерно 0,0005 м/л, гидроокись магния в концентрации примерно 0,005-0,007 м/л, лимонную кислоту в нормальной концентрации примерно 0,01 и гидроокись натрия, в количестве, достаточном для поддержания величины рН на ур рвнях, измеряемой при температуре 25°С. Затем высушенные клетки смешивают с этим водным раствором при 10-27°С в количестве 10 вес. ч. воды на I вес. ч. высушенных клеток. Последние поддерживают в контакте с водным раствором в течение примерно I ч. Полученную массу клеток и водного раствора направляют в реакционную колонну диаметром 3,75 см, снабженную рубащкой, и образуют слой клеток тол циной примерно 100 см. Водный раствор того же состава с рН 8,0 (измерен при 25°С) пропускают при температуре IО-27°С снизу вверх через слой клеток при величине расхода 53-6 л/м площади поперечного сечения в мин. Водный раствор пропускают снизу вверх через колонну примерно в течение I ч до тех пор, пока выходящий поток не станет светлым, а величина рН выходящего потока .не стабилизируется на уровне 8,0 (измеряют при 25°С). Подачу водного раствора прекращают. Затем водный раствор, описанный в примере I, при и рН 7,5-8,0 (измеряют при 60°С) пропускают снизу вверх через слой клеток при величине расхода 53-61 JY площади поперечного сечения в I мин до тех пор, пока состав выходящего из слоя раствору не будет таким же как и входящий раствор глюкозы. При поступлении раствора глюкозы в слой клеток через рубашку колонны пропускают теплоагент с температурой 60°С. Педачу раствора глюкозы прекращают и слою клеток дают отстояться в течение примерно 15-20 мин. Во время указанной обработки водный раствор и последующий раствор глюкозы рециркулируют через слой клеток. Величины рН рецнркулируемых во.аного раствора и пос.чслурщего раствора глюкозь: поддерживают соответственно на уровне 8,0 (измеряют fipn ) и на уров- не 7,5-8,0 (измеряют при 60С) путем добавления гидроокиси натрия. Полученный обработанный слой клеток затем используют для изомеризации глюкозы во фруктозу способом, описанным в примере 1, для получения изомеризованного сиропа, содержащего примерно 42-43 аес.% фруктозы, не имеющего окраски и не содержащего псикозы. Обработанный указанным способом слой клеток физически устойчив. Формула изобретения I. Способ обработки клеток бактерий, имеющих глюкозонзомеразную активность, перед процессом получеиия продукта, содержащего фруктозу, отличающийся тем, что, с целью придания клеткам бактерий физической устойчивости, смешивают клетки при температуре Ю-27°С с водным раствором глюкозы при рН 8,0, измеренном при 25°С для гидратации клеток и стабилизации рН, образуют слой клеток и пропускают через него водный раствор глюкозы при температуре 60°С и рН 7,5-8,0, измеренном при 60°С, до получения прозрачного раствора и стабилизации рН на уровне 7,5- 8,0,измеренном при . 2.Способ по п. I, отличающийся тем, что водный раствор глюкозы имеет декстрозный эквибалент 97-98 и 30-50 вес.°/о сухих веществ, из которых глюкоза составляет 93-96 вес.%. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют клетки бактерий, обработанные глутаровым альдегидом. 4.Способ по п. , отличающийся тем, что водный раствор глюкозы пропускают через слой клеток снизу вверх при величине расхода 53-61 л/м площади поперечного сечения в 1 мин. 5.Способ по п. I, отличающийся тем, что водный раствор глюкозы содержит кобальт в концентрации 0,0005 м/л, магний - 0,005- 0,007 м/л и 0,01 N лимонную -кислоту. Источники информации, принятые во BHHivfaHHe при экспертизе 1. Патент Великобритании № 1376983, кл. С 3 Н, олублик. 1971.