Способ получения иммобилизованных клеток,обладающих глюкозоизомеразной активностью Советский патент 1984 года по МПК C12N11/04 C12N9/92 

Oi

со

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам иммобилизации клеток, обладающих ферментативной активностью, и может быть использовано при производстве глюкоэофруктозного сиропа.

Известен способ получения иммобилизованных клеток Saccharomyces uvarum С использованием полимерных гелей на основе альгината натрия. Суспензию клеток смешивают с 1-2%ным раствором альгината натрия, затем прибавляют по каплям в 0,080,1 М раствор СаС1г и дубят в растворе этой соли при .

Преимуществами способа являются высокая механическая и термическая стабильность препаратов иммобилизованных .клеток вследствие возникновения ионно-координационных связей между Макромолекулами альгйнл та и ионами Са СИ.

Одна.ко способ невозможно исполь.зовать дляиммобилизации клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, так как обработка геля солями приводит к ингибированию .глюкозоизомеразЫо

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, путем смешивания клеток с раствором полисахаридного гелеобразователя и последующего выдерживания смеси в растворах солей металлов, например калия. При осуществлении способа клетки, обладающие активностью глюкозоизомеразы, включают в матрицу полисахаридного гелеобразователя типа фурцеллорана, каррагинана или сульфата целлюлозы с последующим формованием и выдерживанием препарата игимобилизованных клеток в растворах солей металлов с атомным весом выгие 23. Для придания полученному препарату механической прочности и термостабильности его подвергают дополнительной обработке в растворах солей и обработке различными органическими сшивающими агентами (глутаровым альдегидом, глиоксалем, диоксиацетоном, эпихлоргидрином и др.). Остаточна;я активность полученного препарата составляет 35% от активности исходных клеток С2 ..

Недостатками излестногб способа являются снижение активности глюкозоизомеразы после обработки препарата иммобилизованных клеток различными органическими сшивающими агентами на 20-25%, необходимости исползопания в качестве гелеобразователя гелей типа фурцеллорана, каррагинана, агароида, которые обладают недостаточной прочностью (для повышения прочности требуется дополнительная обработка), а также сложность технологии получения препаратов, так как требуется дополнительная обработка препаратов растворами органических сшивающих агентов для обеспечения механической и термической прочности.

Кроме того, .использование в качестве гелеобразователя полисахаридов типа альгината, низкоэтерифицированнрго пектината и лизостерата калия, натрия или аммония невозможно, так как при выдерживании в солях, указанных в известном способе, например в солях калия, гель не образуется, а при выдерживании в кальция .происходит ингибирование глюкозоизомеразы.

Цель изобретения - повышение глюкозоизомеразной активности иммобилизованных клеток и упрощение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, заключающемуся в смешивании клеток с раствором полисахаридного гелеобразователя и поЬледующем выдерживании смеси в- растворе соли, на стадии смешивания клеток с полисахаридным гелеобразователем вводят соли металлов-активаторов Со и в 1 онцентрациях 0,02-2,5% при сле дующем соотношении компонентов (в расчете на сухие вещестёа) клетки: полисахаридный гедеобразователь 1:(О,8-1,25), в качестве полисахаридного гелеобразователя используют полиурониды, а выдерживание смеси проводят в растворе 0,08-0,12 М хлористого кальция.

При использовании изобретения подавления активности глюкозоизомеразы под действием ионов не наблюдается. Причина этого явления заключается в том, что ионы-активаторы, введенные на стадии смешивания, прочнее связываются с активным центром фермента, чем ионы Са . Использование указанного приема позволяет устранить неполноту проявления активности глюкозоизомеразы, которая возникает вследствие затруднения процесса диффузии ионов металлов-активаторов к клеткам после иммобилизации.

При использовании в качестве полисахаридного гелеобразователя типа альгината, низкоэтерифицирОванного пектината или зостерата калия, натрия или аммония, а в качестве солей в дубильном растворе - соли кальция .пищевых кислот между молекулами полисахаридных гелеобразователей и 3 ионами возникают ионно-коорди-.

нациоаные рвязи, наиболее прочные, чем водородные связи (как в прототипе при использовании в качестве полисахаридного гелеобразователя типа фурцеллорана, каррагинана и агароида, а в качестве солей в ду.Сильном растворе - .соли калия пищевых кислот). Это позволяет получить более стабильные(механически и термически) препараты без дополнительной обработки органическими сшивающими агентами (обработка этими агентами ведет к падению активности, как в прототипе;

что приводит

к упрощению технологии получения препаратов.

Пример 1. За единицу активности глюкозоизомеразы принимают количество фермента, катализирующее изомеризацию одного микромоля сУбстрата (глюкозы) в фруктозу при рН 7,0 и температуре 70°С за 1 мин.

Для измерения активности, глюкозоизомеразы навеску препарата иммобилизованных клеток (0,15-0,2 г) помещают в 10 Мл раствора 2 М глюкозы, инкубируют 10 мин при при постоянном перемео1ивании,

Клетки Act, altop.riseolus (5 г), 1апученные после ;Ц ёнтрифугирования культуральнойЖид Гости и обладающие активностью 57,3 ед/г влажной биомассы, смешивают с 5 г 4%-ного альгината натрия, предварительно нагретого до 70С. В иммобилизапионную ячейку добавляют 2 ,5%СоС1 -6Н2 О и 2,5 -МкЗОц- . Смесь продавливают через фидьеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплям ,1 М раствору CaClj и дубят 2 чпри . Активность влажного препарата 52,1 ед/г, что составляет 250% по сравнению с контрольным препаратом. ГИД контрольного препарата, полученного по способу-прототипу, составляет 20,6 ед/г влажного препарата и принята за 100%.

.Пример 2. Клетки Act, olivocinereus (5 г), полученные после центрифугирования культу эальной жидкости и обладающие активностью

57.3ед/г влажной биомассы, смешивают с 5 г 5%-ного низкоэтерифицированного пектината калия, предварительно нагретого до 70с. В иммобилизационную ячейку добавляют 1,2% CoClj,. и 1,2% М MgSOi, Смесь продавливают через фильеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплйм к 0,08 М раствору CaClj и дубят 2 ч при 30°С Затем измеряют активность глюкозойзомеразыо Активность препарата

46.4ед/г влажного препарата, что составляет 223% по сравнению с активностью контрольного препарата.

Пример 3. Клетки Act. albogriseol s (5 г), полученные после центифугированиикуль туральной жидкости и обладающие активностью глюкозоизомеразы 57,3 ед/г влажной биомассы, смешивают с 5 г 6%-ного зосте эата аммония, предварительно нагргтого до ,. В иммобИлизационную ячейку добавляют 0,02% и 0,02% MgSO -THiO. Смесь, продавливают через фильеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплям к 0,12 М раствору CaClj и дубят 2 ч при 30°С. Активность полученного препарата 43,2 ед/г влаж0ного препарата, что составляет 207% по сравнению с активностью контрольного препарата. . .

Пример 4. KheTKH Act. albo riseolus (5 г), полученные после

5 центрифугирования культуральной жидкости и обладающие активностью 57,3 ед/г влажной биомассы, смешиьают с 5 г 5%-ного альгината калия, . предварительно нагретого до .

0 В иммобилизационную ячейку добавляют 0,02% CoClj.- И 1,2% Mgcij . Смесь продавливают через фильеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплям к 0,1 М раствору CaClj и дубят

5 2 ч при . Активность полученного препарата 41,3 ед/г влажного препарата, что составляет 200% по сравнению с активностью контрольного препарата.

0

Пример 5. Клетки Act, olivocinereus (5 г), .полученные после центрифугирования культуральной жидкости и обладающие активностью 57,3 ед/г влажной биомассы, смешива5ют с 5 г 6%-ного низкоэтерифицированного пектината натрия, предварительно нагретого до 70°С. В иммобилизационную ячейку добавляют 1,2% СоБОц 711, и 0,02% МрЗОц-. . Смесь

0 продавливают через фильеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплям к 0,08 М раствору CaCl и дубят 2ч при . Активность полученного препарата 40,6 ед/г влажного препарата, что составляет 195% по сравне5нию с активностью контрольного препарата.

Таким образом, предлагаемый способ получения препаратов иммобилизованных клеток, обладающих глюкозо0изомеразной активностью, позволяв, во-первых, увеличить ферментную активность препарата иммобилизованных клеток на 95-150% при сохранении механической и термической стабиль5ности; во-вторых, использоватьв качестве гелеобразователей не только сульфатированные галактаны, такие как фурцеллоран, каррагинан, агароид, но и карбоксилсодержащие полисаха0ридные гедеобразователи (альгинат, низкоэтерифицированный пектинат, зостерат), что способствует упрощению технологии получения препаратов иммобилизованных клеток и обеспечи5вает их механическую и термическую $10 стабильность в-втретьих, сократить технологический цикл процесса при эксплуатации препаратов иммобилизованных клеток, исключив стадию очистки глюкозофруктоэного сиропа от и Mg вследствие прочного связывания ионов-активаторов с ферментом; в-четвертых, сократить расход дорогостоящих металлов-активаторов, так как исчезает необходи70163мость добавлять их в каждую партию субстрата. Кроме того, ожидаемый экономический эффект от использования предлагаемого способа получения иммобили5зованных клеток, обладающих глюкоэоиэомеразной активностью, составит 24 356 тчс.руб, на 1 т препарата, а годовой экономический эффект ,306 тыс. руб.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК, ОБЛАДАЮЩИХ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, путем смешивания клеток с раствором полисахаридного гелеобразователя и последующего выдерживания смеси в растворе соли, отличающи йс я тем, что, с целью повышения глюкозоизомеразной активности и упрощения процесса, на стадии смешивания клеток с полисахаридным гелеобразователем вводят соли металловак-ткваторов и КгО в концентрациях 0,02-2,5% при следующем соотношении компонентов (в расчете на сухие вещества) клетки полисахаридный гелеобразователь 1:(О ,8-1,25 ) , в качестве полисахаридного гелеобсл разователя используют полиурониды, а вьвдеркивание смеси проводят в растворе 0,08-0,12 М хлористого кальция.