МУТЕИНЫ ПЛАЦЕНТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА 1 ТИПА, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2009 года по МПК C12N15/18 C07K14/515 C07H21/00 C07K16/22 A61K38/18 A61K39/395 

Описание патента на изобретение RU2344172C2

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается стабильных мутеинов плацентарного фактора роста 1-го типа (PLGF-1), их получения, терапевтического и косметического применения и фармацевтических и косметических композиций, содержащих данные производные. Изобретение также касается получения антител к данным производным и их применения при диагностике и лечении онкологических и неонкологических патологий.

Уровень техники

Плацентарный фактор роста 1 типа (PLGF-1) представляет собой ангиогенный гомодимерный гликопротеин. Ангиогенная активность относится к димерной форме, так как мономерная форма не активна. Полная полинуклеотидная последовательность, кодирующая белок PLGF-1, вместе с его полипетидной последовательностью, были описаны Maglione и Persico в патенте ЕР-В-0 550 519 (WO-A-92/06194).

В этом патенте описан способ получения PLGF-1 в бактериях, модифицированных при помощи индуцибельной системы экспрессии, причем данный способ включает после индукции лизис бактерий и прямую экстракцию неочищенного белка из лизата. Белок, полученный таким способом, проявляет низкий уровень биологической активности.

Способ экстракции и очистки сырого плацентарного фактора, полученного путем экспрессии в бактериях, описан Maglione et al. в патентной заявке PCT/IT02/00065. Способ включает ряд операций экстракции, ренатурации и очистки, что в целом дает возможность получить чистый белок преимущественно в форме димера, т.е., иными словами, в его наиболее активной форме. В самом деле, известно, что мономерная форма белка биологически неактивна и приобретает ангиогенные функции только после ренатурации в димерную форму.

Однако авторы настоящего изобретения заметили, что белок в форме димера частично неустойчив и при хранении или обработке в водном растворе образует мультимерные формы, обладающие меньшей биологической активностью и по этой причине менее пригодные для терапевтического применения вследствие неопределенности доз и биологической активности.

Целью настоящего изобретения, таким образом, является решение проблемы недостаточной химической/биологической стабильности PLGF-1, которая в основном наблюдается при хранении его в водных растворах.

Раскрытие изобретения

Изобретение основывается на неожиданном открытии того, что производные природного белка PLGF-1 с модификациями в полипептидной последовательности, в частности включающими замену или удаление, по меньшей мере, одного остатка цистеина, проявляют значительное повышение химической стабильности, сохраняя при этом исходную биологическую активность в сущности неизменной. В свете этого открытия первый объект заявки представлен мутеином мономерной формы плацентарного фактора 1 типа (PLGF-1) человека или животных, включающим замену или удаление по меньшей мере одного из девяти остатков цистеина (Cys), содержащихся в полипетидной последовательности белка дикого типа. Такая замена или удаление не влияет на процесс димеризации, необходимый для получения белка в биологически активной форме, но предотвращает мультимеризацию мономерной формы.

Было замечено, что из различных остатков цистеина особенно эффективно удаление или замена остатка, находящегося в С-концевой части, особенно в положении 142 в полной полипептидной последовательности, то есть включающей и зрелый белок PLGF-1, и соответствующий сигнальный пептид. В предпочтительном воплощении изобретения остаток цистеина в положении 142 замещен остатком глицина (Gly). При такой замене образуется мутеин мономерной формы PLGF-1, обладающий неизмененной способностью к димеризации, но практически не способный к образованию мультимерных продуктов. Наряду с модификациями, описанными выше, мутеины согласно настоящему изобретению могут содержать и другие удаления, замены или добавления одной или нескольких аминокислот белка дикого типа, при условии что такие модификации не изменяют функциональные характеристики самого мутеина.

Второй объект изобретения, таким образом, представлен мутеином фактора PLGF-1 в форме димера, предпочтительно очищенный таким образом, чтобы он содержал только димер. Данный мутеин может равным образом быть зрелым белком или белком-предшественником, включающим сигнальный пептид в N-концевой части.

Следующим предметом изобретения является нуклеотидная последовательность, включающая ДНК, кодирующую рассматриваемый мутеин. Последовательность характеризуется тем, что кодон TGC или TGT, кодирующий аминокислоту цистеин в природной последовательности PLGF-1, удален или модифицирован. В предпочтительном воплощении изобретения кодон, соответствующий цистеину, заменен кодовом GGC, GGT, GGA или GGG - все они кодируют аминокислоту глицин (Gly). Предпочтительно для создания кодона GGC основание тимидин (Т) в положении 382 (кодон TGC) в последовательности SEQ ID NO:1 заменяют основанием гуанозин (G).

Следующим предметом изобретения является система экспрессии, включающая нуклеотидную последовательность, указанную выше, которая фланкирована нетранслируемыми последовательностями, контролирующими и регулирующими экспрессию. Эта система может быть индуцирована в прокариотических клетках, предпочтительно бактериальных клетках.

Экспрессия находится под контролем индуцибельного промотора и может быть индуцирована при помощи соответствующих соединений. Клетки-хозяева, модифицированные с помощью данной системы экспрессии, также являются объектом изобретения. Они представлены прокариотическими клетками, предпочтительно клетками бактерий, таких как Е. coli. Изобретение также охватывает способы получения нуклеотидной последовательности, в которых кодирующую мутеин ДНК получают методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя в качестве праймеров олигонуклеотиды, модифицированные соответствующим образом относительно последовательности белка дикого типа. Предпочтительно в качестве 5'-3' прямого праймера применяется олигонуклеотид SEQ ID NO:3, а в качестве 5'-3' обратного праймера применяется олигонуклеотид SEQ ID NO:4.

Следующим объектом изобретения является способ получения и экстрагирования мутеина, в котором клетки-хозяева, предпочтительно бактериальные, модифицированные с помощью системы экспрессии согласно изобретению, культивируют в подходящей культуральной среде, индуцируют экспрессию белка соответствующим индуктором, выделяют и лизируют клетки и экстрагируют мутеин из лизата. На стадии ферментации и перед стадией индукции экспрессии клетки культивируют до достижения высокой оптической плотности (O.D.) культуральной среды. После этого индуцируют экспрессию белка добавлением соответствующих индуцирующих агентов. На последующих стадиях клетки лизируют для высвобождения внутриклеточного материала в культуральную среду, а именно: нуклеинового материала и телец включения, причем последние солюбилизируют и полученный при этом белок подвергают ренатурации в димерную форму. Процесс экстракции и очистки может включать дополнительные необязательные стадии для очистки димерного белка. В предпочтительном воплощении процесс включает по меньшей мере еще одну дополнительную стадию очистки методом ионообменной или обращенно фазовой хроматографии. В другом воплощении процесс включает первоначальную очистку методом анионообменной хроматографии с последующей очисткой методом обращенно фазовой хроматографии.

Мутеин, полученный при помощи способа продукции, экстракции и очистки согласно изобретению, содержит не менее 98,5% активного белка и не более 1,5% мономерной формы. Активная форма в основном состоит из димерной формы и содержит только следовые количества мультимерной формы. Тесты на стабильность подтверждают высокую стабильность при хранении и во время обработки, что типично для мутеина в димерной форме.

Краткое описание фигур

На Фиг.1 представлен электрофоретический профиль PLGF-1CG, полученный методом SDS-PAGE, после ресуспендирования в физрастворе при концентрации 20 мг/мл и хранения при 4-8°С в течение 40 дней. Этот профиль сравнивается с профилем мутеина сразу после солюбилизации.

Обозначения: (М) - маркеры молекулярного веса; (1) - PLGF-1CG (3 мкг), солюбилизированный при концентрации 20 мг/мл и замороженный (контроль); (2) - PLGF-1CG (3 мкг), солюбилизированный в физрастворе при концентрации 20 мг/мл и хранившийся при 4-8°С в течение 40 дней.

На Фиг.2 представлены данные из табл. 2, выраженные в виде графика.

На Фиг.3 представлен электрофоретический профиль, полученный методом SDS-PAGE, мутеина PLGF-1CG, солюбилизированного в геле Карбопол при 0,2 мг/мл и хранившегося при 4-8°С в течение 170 дней. Обозначения: (М) - маркеры молекулярного веса; (1) - PLGF-1CG (2 мкг), солюбилизированный в геле Карбопол при концентрации 0,2 мг/мл и хранившийся при 4-8°С в течение 170 дней; (2) - PLGF-1CG (2 мкг), солюбилизированный в геле Карбопол при концентрации 0,2 мг/мл и замороженный (контроль).

На Фиг.4 представлен электрофоретический профиль, полученный методом SDS-PAGE, нативной формы PLGF-1CG, солюбилизированной в геле Карбопол при 0,2 мг/мл и хранившейся при 4-8°С в течение 150 дней. Обозначения: (М) - маркеры молекулярного веса; (1) - PLGF-1CG (2 мкг), солюбилизированный в геле Карбопол при концентрации 0,2 мг/мл и хранившийся при 4-8°С в течение 150 дней; (2) - PLGF-1CG (2 мкг), солюбилизированный в геле Карбопол при концентрации 0,2 мг/мл и замороженный (контроль).

На Фиг.5 представлена схема, иллюстрирующая процесс конструирования плазмиды pET3PLGF1CG, кодирующей мутеин PLGF-1, именуемый PLGF-1CG.

На Фиг.6 представлена ангиогенная активность PLGF-1 дикого типа и мутеина PLGF-1CG при возрастающих концентрациях. Активность основного фактора роста фибробластов bFGF приведена для сравнения.

На Фиг.7 представлен эффект мутеина PLGF-1CG на вызванное изопреналином ишемическое повреждение сердечной ткани у кроликов. На оси х приведена продолжительность обработки в днях, а величина AUC означает общую площадь под кривой, ограниченной количеством баллов ЭКГ за день. Перечень последовательностей:

SEQ ID NO:1 - нуклеотидная последовательность PLGF-1 дикого типа без сигнального пептида.

SEQ ID NO:2 - нуклеотидная последовательность природного PLGF-1. SEQ ID NO:3 - последовательность олигонуклеотида, используемого в качестве прямого праймера при ПЦР.

SEQ ID NO:4 - последовательность олигонуклеотида, используемого в качестве обратного праймера при ПЦР.

Осуществление изобретения

Полная последовательность полипептида фактора PLGF-1 человека, состоящая из 149 аминокислот, вместе с фрагментом кДНК из 1645 нуклеотидов, содержащим последовательность, кодирующую фактор PLGF-1, приведены в патенте ЕР-В-0 550 519. Находящаяся в свободном доступе плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность из 1645 оснований, также депонирована в АТСС за номером 40892.

Последовательность, кодирующая белок-предшественник, заключается между положениями 322 и 768 и обозначается в данной заявке как SEQ ID NO:1.

PLGF-1 дикого типа в виде белка-предшественника представляет собой полипептид из 149 аминокислот, содержащий сигнальный пептид из 18 аминокислот в N-концевой части. Последовательность зрелого белка, заключенная между положениями 19 и 149, обозначается в данной заявке как SEQ ID NO:2. Данная последовательность содержит 9 остатков цистеина (Cys), находящихся в положениях 35, 60, 66, 69, 70, 77, 111, 113 и 125.

В мутеинах согласно изобретению, по меньшей мере, один из остатков цистеина удален или замещен другим остатком с одним единственным условием: чтобы мутация не оказывала заметного влияния на или не устраняла способности мутеина в мономерной форме к образованию биологически активной и терапевтически полезной димерной формы. Экспериментальные данные показывают, что удаляемый или замещаемый остаток должен предпочтительно находиться в С-концевой части белка и что оптимальным остатком для целей изобретения является остаток в положении 125.

Мутеины плацентарного фактора роста дикого типа могут быть получены путем синтеза известными в литературе методами синтеза полимеров. Однако предпочтительным методом является экспрессия белка в генетически модифицированных клетках-хозяевах. Для этой цели клетки трансформируют путем введения клонирующего и/или экспрессирующего вектора, содержащего вставку, соответствующую гену PLGF-1 после соответствующей модификации.

Получение ДНК, кодирующей мутенины по изобретению, проводится методом сайт-специфического мутагенеза и предполагает точковые мутации в кодонах, соответствующих цистеину, то есть в кодонах TGC или ТОТ. Эти мутации могут представлять собой делеции или замены одного или нескольких оснований без смещения рамки считывания вслед за мутацией. Таким образом, в случае делеции необходимо удалить весь кодон. Предпочтительно сайт-специфическая мутация представлена точковой заменой одного основания в кодоне цистеина с последующим образованием нового кодона. В этом смысле мутация приводит к замене остатка цистеина остатком другой аминокислоты.

Для получения кДНК, кодирующей требуемый мутеин, могут применяться различные известные методы сайт-специфического мутагенеза.

К методам, которые можно использовать, относятся, к примеру, мутагенез с помощью олигонуклеотидов (Adelman et al., "DNA" 2: 183, 1983), мутагенез с помощью ПЦР (Leung et al.. Technique 1: 11-15, 1989) или кассетный мутагенез (Wells et al., Gene 34: 315,1985).

В предпочтительном воплощении изобретения синтез мутантной ДНК проводится методом мутагенеза посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для реакции ПЦР применяли ДНК, кодирующую фактор PLGF-1 дикого типа, описанную в литературе, или любые ее эквиваленты, являющиеся результатом вырожденности генетического кода. Предпочтительно используется только часть, кодирующая метионилированный в N-концевом положении белок вместе с или без сигнального пептида; к примеру, последовательность, приведенная в настоящей заявке как SEQ ID NO:1, или ее эквиваленты, заключенные в экспрессионный вектор pET3P1GF-l, что соответствует белку без сигнального пептида. В качестве праймеров для ПЦР использовали олигонуклеотид 5'-3' (прямой праймер), комплементарный участку, кодирующему N-концевую часть белка, и олигонуклеотид 5'-3' (обратный праймер), комплементарный участку последовательности, содержащему кодон цистеина, подлежащего мутированию. Обратный олигонуклеотид должен содержать замену основания или оснований, необходимых для введения требуемой мутации. Используемые праймеры могут в равной степени содержать дополнительные основания в 5'-концевых и в 3'-концевых участках для введения сайтов рестрикции, подходящих для выделения и очистки мутированной последовательности.

Кодон, соответствующий остатку цистеина, может быть замещен кодоном, кодирующим любую нейтральную аминокислоту, как полярную, типа Ser, Thr, Gin или Asn, так и неполярную, типа Gly, Ala, Val, He или Leu. Предпочтительными являются аминокислоты Gly или Ala.

В предпочтительном воплощении прямой праймер представлен последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:3, тогда как обратный праймер представлен последовательностью SEQ ID NO:4. Последняя включает замену T→G в положении 382 последовательности SEQ ID NO:1, замену, которая трансформирует кодон TGC цистеина в положении 125 SEQ ID NO:4 в кодон GGC, соответствующий глицину.

Соответствующим образом модифицированную кДНК затем разрезают и вставляют в экспрессионный вектор под контролем подходящей индуцибельной системы, совместимой с клеткой-хозяином.

Предпочтительно используются индуцибельные экспрессионные системы, совместимые с прокариотическими клетками. Вот примеры таких систем:

экспрессионная система pBAD (Invitrogen BV), в которой синтез белка находится под контролем промотора araBAD и может быть индуцирован в различных штаммах Е. coli с помощью арабинозы;

экспрессионная система Т7 (Invitrogen BV или Promega), в которой синтез белка контролируется промотором РНК-полимеразы фага Т7 и может быть индуцирован с помощью лактозы, изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) либо их производных или функционально эквивалентных аналогов. В этом случае необходимо использовать производные Е. coli DES-типа, (В121 или JM109), то есть те, что содержат копию гена РНК-полимеразы фага Т7, находящегося под контролем индуцируемого лактозой промотора;

экспрессионная система Trc (Invitrogen BV), в которой синтез белка находится под контролем гибридного промотора trc. Этот промотор был получен слиянием промотора trp с промоторами lac и может быть индуцирован в различных штаммах E.coli с помощью лактозы или близких к ней эквивалентов (IPTG);

экспрессионная система Тас (Amersham Biosciences), в которой синтез белка находится под контролем промотора tac. В этой системе синтез белка индуцируется в штаммах E.coli lacIq (типа JM105) с помощью лактозы или близких к ней эквивалентов (IPTG);

экспрессионная система PL, в которой синтез белка находится под контролем промотора PL и может быть индуцирован добавлением триптофана. В этом случае необходимо использовать производные Е. coli (GI724), содержащие копию гена, кодирующего репрессор cI фага лямбда, под контролем индуцируемого триптофаном промотора.

Конечно, можно экспрессировать модифицированную ДНК, кодирующую мутеин, в эукариотических клетках-хозяевах, происходящих из дрожжей или многоклеточных организмов. В этом случае нужно выбрать экспрессионную систему, совместимую с данными клетками.

В предпочтительном воплощении изобретения экспрессия осуществляется под контролем РНК-полимеразной системы фага Т7 и индуцируется изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом.

Экспрессирующий вектор также включает дополнительные последовательности, кодирующие нормальные функции, необходимые для клонирования, селекции и экспрессии, такие как селективные маркеры, и/или сайт полиаденилирования, и/или последовательность регуляции транскрипции.

Таким образом, клетки-хозяева траснформируют, используя стандартные методы, известные специалистам в этой области, экспрессирующим вектором, содержащим кДНК, кодирующую требуемый мутеин. Эти клетки могут быть прокариотическими, эукариотическими, клетками животных, человека или растений, в частности бактериальными клетками типа Е. coli или Bacillus, дрожжевыми клетками типа Saccharomyces или клетками животных типа Vero, HeLa, CHO, COS.

Предпочтительный микроорганизм получают путем встраивания в коммерчески доступный штамм [В 12 (DE3) pLysS] (Promega Corporation USA) гена мутеина PLGF-1 человека.

Модифицированные клетки, используемые для получения мутеинов согласно изобретению, хранятся до употребления в лиофилизированном виде для сохранения их экспрессирующей способности. Перед употреблением лиофилизированный материал ресолюбилизируют в подходящем буфере.

Затем модифицированные клетки хозяина выращивают в жидкой культуральной среде. Несмотря на то что в продаже имеется большой выбор известных культуральных сред и их можно эффективно использовать, стадия ферментации по изобретению предпочтительно проводится в культуральной среде, лишенной каких-либо материалов, происходящих из животных или человека, во избежание риска инфекции. Наиболее подходящей средой для этого процесса являются дрожжевые экстракты (Difco), дополненные одним или несколькими подходящими антибиотиками. Стадии ферментации может предшествовать стадия предварительной инокуляции, на которой лиофилизированный микроорганизм суспендируют в культуральной среде и поочередно подвергают операциям инкубации и разбавления с целью получения оптимального количества клеток микроорганизма в культуре.

Ферментация проводится в вышеуказанной культуральной среде при температуре, подходящей для микроорганизма, обычно приблизительно 37°С, при насыщении кислородом, составляющим от 20% до 40%, предпочтительно 30% относительно воздуха. Значение рН во время культивирования поддерживается на оптимальном для используемого микроорганизма уровне, который в норме нейтрален или слегка кислый или щелочной (от 6,4 до 7,4). Кроме того, поскольку процесс ферментации происходит с перемешиванием, целесообразно применять противопенные добавки.

По мере протекания ферментации она сопровождается повышением оптической плотности культуральной среды. Поэтому оптическая плотность при 600 нм используется в соответствии с изобретением для наблюдения за развитием процесса. Плотность клеток, а тем самым и оптическая плотность, которую достигает культура ко времени индукции экспрессии, должна быть достаточно высокой, чтобы гарантировать высокий выход экспрессируемого белка. Хотя для работы годятся и оптические плотности при 600 нм (OD600) свыше 0,2 единиц, однако можно получить оптические плотности вплоть до 50 благодаря применяемым культуральным средам. Для достижения высокого уровня продукции мутеинов предпочтительны плотности, превышающие 18. Плотности между 16 и 20 давали оптимальные результаты. Ферментация поддерживается при указанных выше условиях до достижения этих значений оптической плотности, после чего проводится индукция экспрессии белка.

Могут применяться любые вещества или физико-химические условия, способные индуцировать механизмы гетерологической экспрессии мутеинов в клетках используемого микроорганизма. В конкретном случае применения бактериального штамма BL21 (DE3) pLysS, модифицированного экспрессионной плазмидой, содержащей промотор фагаТ7, экспрессию индуцируют с помощью лактозы или ее производных, таких как изопропил-β-тиогалактопиранозид (IPTG) в соответствующей концентрации, то есть приблизительно 1 мМ. Продолжительность индукции может варьировать в зависимости от требований. Хорошие результаты получали при продолжительности в несколько часов, предпочтительно от 3 до 4 часов. В оптимальном процессе индукция продолжается в течение 3 часов 20 минут при насыщении растворенным кислородом примерно 10%.

До и после индукции отбираются образцы клеток, которые подвергаются контрольным анализам такими методами, как электрофорез в SDS-PAGE, для определения результатов индукции.

По достижении требуемого уровня экспрессии белка клетки отделяют от культуральной среды, к примеру, центрифугированием, и подвергают процессу экстракции.

Процесс экстракции предусматривает начальную стадию лизиса клеток. В самом деле, при экспрессии мутеина в бактериях он остается заключенным внутри клетки-хозяина в виде телец включения. Процесс лизиса может проводиться с использованием замораживания/оттаивания, пресса Френча, обработки ультразвуком и прочих известных методов, в растворах для лизиса, содержащих детергенты в соответствующих концентрациях, предпочтительно содержащих тритон Х-100 в концентрации от 0,5% до 1%. Предпочтительным методом при использовании бактериального штамма BL21 (DE3) pLysS является метод замораживания/оттаивания, который в оптимальном варианте повторяют по меньшей мере два раза подряд.

Учитывая, что мутеин PLGF-1 высвобождается в лизирующую среду в том виде, в каком он экспрессируется в клетках хозяина, то есть в виде биологически неактивного мономера, после лизиса следует стадия ренатурирования, по меньшей мере, частичного, которая заключается в димеризации мономера. Ренатурирование мутеина осуществляется при добавлении в разбавленный раствор окислительно-восстановительной пары в соответствующей концентрации с последующим периодом инкубации от 10 до 30 часов, предпочтительно от 18 до 20 часов, при температуре от 10°С до 30°С, предпочтительно 20°С, с перемешиванием. Примеры таких пар: цистин/цистеин, цистамин/цистеамин, 2-гидроксиэтилдисульфид/2-меркаптоэтанол, или глутатион в окисленной и восстановленной форме. Последний является предпочтительным средством и применяется в окисленной форме при концентрации от 0,1 до 2,5 мМ, предпочтительно 0,5 мМ, и в восстановленной форме - от 0,25 до 6,25 мМ, предпочтительно 1,25 мМ.

В том случае, когда экспрессируемый мутеин PLGF-1 высвобождается в лизирующую среду в виде телец включения, стадии ренатурации предшествует операция солюбилизации. Фракцию, содержащую тельца включения, солюбилизируют в денатурирующем буфере, содержащем известные денатурирующие вещества, такие как мочевина, гуанидин-изотиоцианат, гуанидин-гидрохлорид. Предпочтительно денатурирующий раствор представляет собой раствор мочевины в денатурирующей концентрации, например, 8 М. Для ускорения процесса солюбилизации может оказаться выгодным подвергнуть фракцию, содержащую тельца включения, гомогенизации или обработке ультразвуком. После этого раствор, содержащий белок, разбавляют самим денатурирующим буфером и/или разбавляющим раствором до достижения оптической плотности при 280 нм примерно 0,5 единиц OD280. Подходящие разбавляющие растворы содержат соли и полиэтиленгликоль (ПЭГ) и имеют щелочное значение рН (около 8).

Высвобождение мутеина PLGF-1 в лизирующую среду обычно сопровождается высвобождением различных компонентов и внутриклеточных веществ из микроорганизма, прежде всего нуклеиновых веществ, которые могут повлиять на процесс очистки белка или помешать ему. Чтобы избежать этой проблемы, полученную непосредственно при лизисе клеток суспензию/раствор можно подвергнуть дополнительной, необязательной и предварительной обработке, состоящей во фрагментировании данного материала. Это осуществляется при помощи энзиматических средств, таких как ДНКазы (природные или рекомбинантные типа Bensonase), химических средств, таких как дезоксихолевая кислота, или физико-механических средств, таких как обработка ультразвуком, быстрое перемешивание лопастями, например, в гомогенизаторе. Физическая фрагментация ДНК проводится в соответствующем объеме промывочного раствора, содержащего хелаторы и детергенты, например, ЭДТА и тритон Х-100, и предпочтительно ее повторяют несколько раз, перемежая с разбавлением, центрифугированием и удалением супернатанта, чтобы удалить всевозможные клеточные компоненты или вещества из фракции, содержащей тельца включения.

Несмотря на то что мутеин PLGF-1 после ренатурирования может быть сразу использован как есть, предпочтительно его подвергают, по меньшей мере, одной стадии очистки любым из методов, хорошо известных в этой области для очистки белкового материала. С этой целью мутеин может быть подвергнут гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, ВЭЖХ, обращенно фазовой хроматографии и/или гель-электрофорезу. Предпочтительными методами являются анионообменная и обращенно фазовая хроматография. Если нужно получить особенно высокий уровень очистки, к примеру, подходящий для терапевтического применения, то сочетают, по меньшей мере, два из указанных выше методов подряд.

Раствор, содержащий частично ренатурированный мутеин, то есть находящийся, по крайней мере частично, в виде димера, можно наносить на анионообменную смолу для обогащения смеси димерной формой и освобождения ее от бактериальных загрязнений. Можно использовать любой коммерчески доступный матрикс, пригодный для анионообменной хроматографии, в той мере, в какой его емкость, характеристики нагрузки и скорости пропускания совместимы с промышленным потоком. В предпочтительном воплощении применяется смола с высокой скоростью потока, например, Q-сефароза Fast Flow (Amersham biosciences) или эквивалентная. Используемые смолы позволяют наносить большие объемы белкового раствора, при этом отношение наносимого объема к объему колонки варьирует от 1:1 до 10:1. Предпочтительны отношения объемов, близкие к 10:1, поскольку они позволяют оптимально использовать колонку. Весь процесс хроматографии может преимущественно проводиться в автоматическом режиме с помощью компьютеризированной системы, управляемой соответствующей программой, к примеру, системы FPLC Director Software (Amersham biosciences).

В том варианте процесса, который представлен выше, частично ренатурированный мутеин может быть очищен при помощи обратнофазовой хроматографии.

В этом случае соответствующим образом разбавленный раствор, содержащий частично ренатурированный мутеин, то есть находящийся частично в виде димера и частично в виде мономера, можно нанести на коммерчески доступный хроматографический матрикс, подходящий для указанного применения. Предпочтительно используют смолу с такими гранулометрическими характеристиками, которые гарантируют оптимальное использование абсорбирующей способности матрикса вместе с легкостью набивки колонки. Примеры таких матриксов - смолы RP Source 15 или RP Source 30 (Amersham biosciences). Все растворы для уравновешивания, нанесения, промывки смолы и элюции представляют собой водно-органические растворы, содержащие различное количество в процентах органических растворителей. Примеры таких растворов - это растворы, содержащие этанол, метанол или ацетонитрил. Предпочтительно применяются водно-спиртовые растворы, содержащие возрастающие количества этанола. Преимущественно весь процесс обратнофазовой хроматографии проводится в автоматическом режиме с помощью компьютеризированной системы, работающей под управлением соответствующей программы, например системы FPLC Director Software (Amersham biosciences).

При использовании двух и более методов очистки, следующих друг за другом, мутеин может быть получен в высокоочищенной активной форме, то есть при этом белок находится преимущественно в виде димера без примесей мономерной формы. Полученный таким образом препарат содержит не менее 98,5% активной формы, предпочтительно не менее 99,5%. Остаточная мономерная форма не превышает 1,5%. С учетом того, что мутеин химически устойчив, все продукты мультимеризации сведены до уровня примеси. Очищенный белок, полученный вышеописанным способом, может быть подвергнут дальнейшей обработке, например ультрафильтрации через мембрану. В этом случае препарат фильтруют через мембрану, имеющую предел исключения (отсекания), меньший или равный 30 кД, и подвергают диафильтрации против воды, подкисленной ТФУ, до достижения степени разбавления 1:106. Конечный продукт, полученный таким образом, может быть адекватно приготовлен вместе с лиофилизационными добавками и подвергнут лиофилизации для сохранения активности на оптимальном уровне. В практическом воплощении изобретения мутеин может быть соответствующим образом экстрагирован, выделен и очищен в соответствии со способом очистки, описанным в международной патентной заявке РСТ IT02/00065 (Geymonat) для очистки белка PLGF-1 дикого типа, при необходимости адаптируя рабочие условия.

Химическую устойчивость мутеинов PLGF-1 по изобретению оценивали методами, в которых лиофилизованный мутеин и белок PLGF-1 дикого типа солюбилизировали в солевом растворе или вводили в состав геля и хранили при температуре 4-8°С в течение 40, 170 и 210 дней. Приведенные ниже результаты четко показали, что мутеин в активной форме димера устойчив при всех исследованных концентрациях (20, 5 и 1 мг/мл), так как он не имеет тенденции к выпадению в осадок или к образованию мультимеров: в самом деле, его концентрация, как оказалось, осталась на первоначальном уровне. Напротив, концентрация димерной формы белка дикого типа резко снижается уже через несколько дней.

Мутеины по изобретению наряду с улучшением химической/биологической стабильности проявляют ангиогенную активность, сравнимую с активностью белка PLGF-1 дикого типа. Эта активность делает мутеины по изобретению пригодными для всех терапевтических и косметических применений природного PLGF-1, известных к настоящему времени из предшествующего уровня техники.

Ангиогенное действие мутеинов PLGF-1 по изобретению определяли известными методами, выполняемыми in vivo или in vitro. В частности, использовали тест на васкуляризацию роговицы кролика или тест на васкуляризацию хориоаллантоисной мембраны кур (САМ), как описано в Maglione et al. "II Farmaco", 55,165-167 (2000).

Второй метод, используемый для оценки васкуляризации кожи, - компьютеризированный морфометрический анализ образцов кожи животных, как описано Streit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, December 21, 96(26), 14888-14893. Срезы кожной ткани, подвергавшиеся или не подвергавшиеся обработке по настоящему изобретению, окрашивали иммуногистохимически с помощью моноклональных антител против CD31 используемого животного. Обработанные таким образом срезы анализировали под электронным микроскопом, определяя число кровеносных сосудов на 1 мм2, их средние размеры и занимаемую ими относительную площадь. Ангиогенное действие мутеинов на ткань миокарда, особенно в случае ишемии или инфаркта миокарда, оценивали на модели сердечной ишемии у животных, как описано Maglione et al. (supra).

Активность мутеинов по изобретению при лечении склеродермии оценивали на животной модели, как описано Yamamoto et al.. Arch. Dermatol. Res. Nov. 2000, 292(11), 535-541. Состояние склеродермии у мышей СЗН вызывали блеомицином (100 мкг/мл) путем ежедневного введения подкожно в течение 3 недель. Через 3 недели животных забивали и образцы кожи из обработанных участков подвергали гистологическому анализу. Влияние обработки проявляется в гистологических явлениях, которые могут быть приписаны вызванному блеомицином склерозированию кожи, в частности утолщению кожи и высокому содержанию гидроксипролина.

Приведенные ниже результаты свидетельствуют об эффективности мутеинов PLGF-1 по изобретению при лечении всех патологических или естественных дегенеративных состояний, поддающихся улучшению при усилении васкуляризации пораженных участков. Первое применение - это профилактика или лечение ишемии и повреждений, возникающих после эпизода ишемии. Заболевания, которые могут подлежать лечению: ишемия ткани миокарда, инфаркт миокарда, ишемический удар и хронические болезни миокарда, ишемия и ишемический удар головного мозга, ишемия кишечника, периферическая ишемия конечностей.

Второе терапевтическое применение - лечение склеродермии. Это болезнь, которая затрагивает микрососудистую систему, кожную и подкожную соединительную ткань и соединительную ткань внутренних органов. Болезнь вызывает активацию фибробластов и чрезмерную продукцию и отложение коллагена в тканях и вокруг сосудов, что сильно способствует образованию участков фиброза и кальцификации, а тем самым и возникновению симптомов, вызываемых болезнью. В частности, при капилляроскопии можно видеть, что большое количество склеротизированного коллагена окружает сосуды кожи, вызывая сужение просвета сосудов. Различают очаговую склеродермию с поражением кожи, которая характеризуется огрубением и утолщением кожи вследствие чрезмерного и неадекватного отложения коллагена, и прогрессирующую системную склеродермию (склероз), при которой кровеносные сосуды связаны с фиброзом кожи, наряду с системным склерозом с поражением внутренних органов. Кожа, прежде всего на пальцах и руках, оказывается огрубевшей, утолщенной и опухшей. Болезнь также проявляется на уровне миокарда как сердечная недостаточность и на уровне пульмонарной, желудочно-кишечной, почечной и костно-мышечной систем. У некоторых пациентов также возникает эрозивная артропатия, вызванная фиброзом кожи, что сильно затрудняет подвижность суставов. Maglione et al. сообщали (итальянская патентная заявка ИМ 2002 А000119) в отношении фактора PLGF-1 дикого типа, что усиление ангиогенеза, в особенности в коже, в результате применения композиций, содержащих PLGF-1, оказывает благотворное действие на общее состояние вызванного неомицином склероза у мышей. Такие же результаты наблюдались на животных, у которых заранее вызывали состояние склеродермии и лечили мутеинами согласно изобретению.

Третье терапевтическое применение - лечение, способствующее процессам заживления ожогов, язв и внутренних или кожных ран, в частности, в ходе послеоперационных процедур.

Следующее применение согласно изобретению касается лечения явлений, типичных для старения кожи. Такое лечение, хотя оно считается по сути косметическим, имеет терапевтические последствия, если учитывать преждевременное ухудшение состояния кожной ткани вследствие продолжительного воздействия солнечного света (фотостарение), других видов излучения или агрессивных факторов окружающей среды/атмосферы.

При исследовании образцов фотоповрежденной кожи под электронным микроскопом проявляется типичная морфология микрососудов, которая характеризуется, среди прочего, наличием патологически расширенных капилляров, покрытых эластином или окруженных плотным аморфным веществом. Обнаружено, что стимулирование новой васкуляризации кожи оказывает как при естественном, так и преждевременном старении кожи модулирующее действие на внеклеточный матрикс, отвечающий за тонус кожи и ее толщину. Усиление капиллярной васкуляризации сопровождается увеличением количества фибробластов и продукцией нового коллагена, после чего наступает общее улучшение внешнего вида кожи.

Следующее применение соединений по изобретению касается выпадения волос. В самом деле, улучшение васкуляризации кожи, особенно в перифолликулярной зоне, сопровождается модуляцией роста дериватов кожи (волос на голове, на теле и т.д.) в смысле предупреждения выпадения волос и стимуляции их регенерации. Анагенная фаза, соответствующая фазе роста волоса, сопровождается естественным усилением васкуляризации волосяного фолликула (мешочка). Местное ангиогенное действие способствует такому увеличению васкуляризации и последующему росту волоса. Компьютеризированный морфометрический анализ срезов кожи вблизи от волосяных фолликулов животных, получавших композиции по изобретению, показал не только увеличение размеров просвета волос и плотности волос, а тем самым и общее возрастание васкуляризации в перифолликулярной зоне, но также и увеличение размеров волосяной луковицы и диаметра самого волоса.

Эффект предупреждения выпадения волос или усиления их роста заново применим не только в случае естественного выпадения, но и в случае выпадения после клинически значимых состояний, таких как облысение, гормональные нарушения, химиотерапия, лучевая терапия или применение медикаментов.

Вышеуказанные терапевтические показания касаются непосредственного, системного или местного применения мутеина фактора PLGF-1. Однако мутеины по изобретению также могут применяться для получения антител - поликлональных, моноклональных или функционально активных фрагментов, способных распознавать эндогенный фактор PLGF-1, в частности те участки аминокислотной последовательности, которые содержат сайт связывания PLGF-1 с рецептором. Антитела этого типа способны нейтрализировать ангиогенную активность PLGF-1 и могут найти применение при лечении всех заболеваний, характеризующихся патологическим ангиогенезом. Примеры таких заболеваний - это воспалительные заболевания типа ревматоидного артрита или астмы, отеки, легочная гипертензия и образование и разрастание опухолевой ткани. Сами антитела могут применяться в качестве реагентов для иммунодиагностики в методах качественного и количественного определения продукции эндогенного PLGF-1. Такие реагенты находят применение в диагностике всех патологических состояний, которые сопровождаются аномальной продукцией PLGF-1, таких как образование и разрастание опухолевой ткани.

Антитела или их фрагменты, способные к распознаванию мутеинов PLGF-1, получают в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в этой области, например описанными в заявке WO-A-01/85796 для получения антител, специфичных к белку PLGF-1 дикого типа.

Настоящее изобретение также касается фармацевтических композиций, содержащих вышеописанные мутеины или соответствующие нейтрализующие антитела в качестве активных агентов или диагностических реагентов.

Можно использовать любые рецептуры, подходящие для системного или местного применения согласно изобретению. В частности, фактор PLGF-1 может применяться парентерально с системным или местным действием, или наружно на кожу или слизистую оболочку с преимущественно местным действием. Системное действие достигается главным образом при внутривенном введении, хотя возможно и внутрибрюшинное или внутримышечное введение. Местное действие достигается при наружном применении либо при внутримышечном, подкожном, внутрисуставном парентеральном введении. Мутеины PLGF-1 также могут вводиться на местном уровне путем электротранспорта или ионофореза. Также могут применяться подкожные импланты, когда необходимо замедленное высвобождение в течение некоторого времени. Пероральное введение фактора также возможно, хотя это не так сильно рекомендуется ввиду хрупкой природы активного продукта.

Композиции для системного или местного парентерального применения включают растворы, суспензии, суспензии липосом, эмульсии вода/масло или масло/вода. Композиции для наружного применения включают растворы, лосьоны, суспензии, суспензии липосом, эмульсии вода/масло, масло/вода, вода/масло/вода или масло/вода/масло, гели, мази, кремы, помады и пасты. В предпочтительном воплощении активное вещество заключают в лиофилизованную форму в смеси с подходящими лиофилизационными добавками, которая готова к ресолюбилизации с помощью терапевтически приемлемых растворителей. Лиофилизационные добавки, которые можно использовать: буферы, полисахариды, сахароза, маннит, инозит, полипептиды, аминокислоты и любые другие добавки, совместимые с активным веществом. В предпочтительном воплощении изобретения активное вещество растворяют в фосфатном буфере (NaH2PO4·H2O - Na2HPO4·2H2O) в таком количестве, что отношение мутеин/фосфат после лиофилизации составляет между 1:1 и 1:2. Подходящие растворители для парентерального применения: вода, физраствор, растворы сахаров, водно-спиртовые растворы, масляные растворители, полиолы типа глицерина, полиэтиленгликоля или полипропиленгликоля и любые другие растворители, совместимые со способом применения в отношении стерильности, рН, ионной силы и вязкости.

В случае эмульсий или суспензий композиции могут содержать подходящие поверхностно-активные вещества типа неионных, цвиттерионных, анионных или катионных детергентов, обычно применяемых в рецептурах лекарств. Гидрофильные эмульсии масло/вода или вода/масло/вода предпочтительны для парентерального/системного применения, тогда как липофильные эмульсии вода/масло или масло/вода/масло предпочтительны для местного или наружного применения.

Кроме того, композиции по изобретению могут содержать необязательные добавки, к примеру вещества для поддержания изотоничности типа сахаров или полиспиртов, буферы, хелаторы, антиоксиданты, антибактериальные средства.

Композиции для наружного применения включают жидкие и полутвердые формы. К жидким относятся растворы и лосьоны. Они могут быть водными, водно-спиртовыми типа этанол/вода или спиртовыми, и их получают путем растворения лиофилизованного вещества.

В качестве альтернативы растворы активного вещества могут быть заключены в гель путем добавления известных гелеобразующих средств, таких как крахмал, глицерин, полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, поли(мет)акрилат, изопропиловый спирт, гидроксистеарат, Carbopol®.

Другие виды композиций для наружного применения - это эмульсии или суспензии в виде помад, паст и кремов. Эмульсии вода/масло предпочтительны, так как они обеспечивают более быстрое всасывание. Примеры липофильных наполнителей: вазелиновое масло, безводный ланолин, белый вазелин, цетиловый спирт, стеариловый спирт, растительные масла, минеральные масла. Можно с пользой использовать вещества, повышающие проницаемость кожи с тем, чтобы усилить всасывание. Примеры таких веществ - это физиологически приемлемые добавки, такие как поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль или диметилсульфоксид (DMSO).

Другие добавки, используемые в наружных композициях, - это вещества для поддержания изотоничности типа сахаров или полиспиртов, буферы, хелаторы, антиоксиданты, антибактериальные средства, загустители, диспергирующие вещества.

Для местного или системного применения также могут равно применяться композиции замедленного высвобождения в течение некоторого периода времени, которые включают такие полимеры, как полилактат, поли(мет)акрилат, поливинилпирролидон, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и другие вещества, известные в данной области. Также могут применяться композиции медленного высвобождения в виде подкожных имплантов на основе, к примеру, полилактата или другого биодеградируемого полимера.

Несмотря на то что активное вещество устойчиво само по себе и предпочтительно расфасовывается в лиофилизованном виде, фармацевтические композиции также могут с пользой содержать дополнительные стабилизирующие вещества для мутеинов PLGF-1 в активной форме димера. Примеры таких веществ: цистеин, цистеамин или глутатион.

Дозировка мутеина зависит от способа применения и от выбранной лекарственной формы. Для парентерального применения она может варьировать от 1 мкг/кг/день до 500 мкг/кг/день, предпочтительно от 10 мкг/кг/день до 200 мкг/кг/день. Такие дозы вводятся в виде фармацевтических композиций, содержащих от 50 мкг до 30 мг на единичную дозу, предпочтительно от примерно 500 мкг до 10 мг на дозу. Для терапевтического наружного применения оказались эффективными дозы, варьирующие от 0,1 мг до 10 мг на 1 г композиции. Косметические композиции для местного применения для лечения старения кожи или выпадения волос предпочтительно содержат от 0,01 мг до 0,09 мг активного вещества на 1 г композиции.

Продолжительность лечения зависит от патологии или требуемого эффекта. В случае лечения склеродермии продолжительность применения варьирует от 1 дня до 12 месяцев в зависимости от тяжести патологии. В случае лечения естественного или преждевременного старения кожи продолжительность применения варьирует от 1 до 400 дней, предпочтительно не менее 30 дней. В случае применения для предупреждения выпадения волос или для стимуляции роста волос заново продолжительность применения также варьирует от 1 до 400 дней.

Далее изобретение описывается при помощи примеров, предназначающихся только для иллюстрации, а не для ограничения изобретения.

Пример 1. Синтез кДНК, кодирующей мутеин

Мутеин P1GF-1, который мы назвали P1GF-1CG, был получен путем мутации тимидина (Т) в положении 382 (SEQ ID NO:1) на гуанидин (G). При этом кодон TGC, кодирующий цистеин и состоящий из нуклеотидов 382-384 в указанной выше последовательности, был превращен в кодон GGC, кодирующий глицин.

С точки зрения аминокислотной последовательности цистеин, превращенный путем мутации в глицин мутеина P1GF-1CG, находится в положении 125 в SEQ ID NO:2.

Для синтеза ДНК, кодирующей мутеин, применяли метод ПЦР (полимеразной цепной реакции). В качестве матрицы для ПЦР использовали экспрессионный вектор pET3PLGFl, кодирующий белок метионил-PlGF-1 без сигнального пептида (ER-A-0 550519). Практически это белок PLGF-1 дикого типа без первых 18 аминокислот (сигнальный пептид) и с метионином в положении 1 (на N-конце) (SEQ ID NO:2). В качестве праймеров использовали следующие олигонуклеотиды:

олиго 1 (прямой праймер), имеющий последовательность 5'-CTGGCGCATATGCTG CCTGCTGTGCCC-3'. Он содержит сайт Ndel (подчеркнут) и стартовый кодон (выделен жирным шрифтом);

олиго 2 (обратный праймер), имеющий последовательность 5'-GGTTACCTCCGG GGAACAGCATCGCCGCCCC-3'. Он содержит мутацию T→G (нуклеотид подчеркнут и выделен жирным шрифтом), которая превращает кодон TGC, кодирующий цистеин, в кодон GGC (жирный шрифт), кодирующий глицин.

Цепочку нуклеотидов, полученную после проведения ПЦР на приборе Gene Cycler фирмы BioRad, подвергали реакции заполнения (fill-in), после чего расщепляли с помощью рестрикционного фермента Ndel. Полученный фрагмент с NdeI "тупым" концами клонировали по соответствующим NdeI "тупому" концам прокариотического экспрессионного вектора рЕТ3 в соответствии со стандартной методикой. При этом была получена плазмида pET3PLGF1CG, кодирующая мутеин PLGF-1, известный как PLGF-1CG.

Эту плазмиду использовали в соответствии с известными методами для трансформации штамма Е. coli [BL21 (DE3) pLysS] (Promega Corporation USA) и получения штамма-хозяина [BL21 (DE3) pLysS PLGF-1 CG].

Методика конструирования этой плазмиды представлена на фиг.5.

Пример 2. Продукция, экстракция и очистка мутеина PLGF-1CG

Микроорганизм [BL21 (DE3) pLysS PLGF-1CG] культивировали в ферментере, используя в качестве культуральной среды раствор SBM, содержащий:

раствор А (на 1 л):

дрожжевой экстракт Bacto (Difco)34 гсульфат аммония2,5 гглицерин100 млH2Oдо 900 млраствор В (х10) (на 100 мл):КН3PO41,7 гК2HPO4·3Н2O20 гили К2HPO415,26 гН2Oдо 100 мл

Растворы А и В смешивают в стерильном виде перед употреблением.

Экспрессию индуцируют с помощью 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG).

Ферментации предшествует стадия предварительной инокуляции. Берут пробирку с лиофилизованным микроорганизмом и суспендируют в 1 мл SBM + 100 мкг/мл ампициллина +34 мкг/мл хлорамфеникола, затем суспензию разбавляют и инкубируют при 37°С в течение одной ночи. После разбавления тем же раствором SBM с добавлением ампициллина и хлорамфеникола предварительный инокулят разделяют на 4 колбы Эрленмейера.

Содержимое каждой Эрленмейеровсной колбы инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Смешивают содержимое 4 Эрленмейеровсных колб и измеряют OD600, разводя водой 1/20 (50 мкл + 950 мкл воды).

Затем установленный объем предварительного инокулята центрифугируют 10 мин при 7500 g при 4°С в стерильных пробирках. Затем бактерии ресуспендируют в 20 мл SBM + 200 мкг/мл ампициллина +10 мкг/мл хлорамфеникола для 1 л объема ферментации путем перемешивания при 420 об/мин при комнатной температуре в течение 20 минут.

Ферментацию проводят в растворе SBM, содержащем 200 мкг/мл ампициллина, 10 мкг/мл хлорамфеникола и соответствующее количество пеногасителя, при температуре 37°С, при насыщении растворенным кислородом 30% и при значении рН между 6,4 и 7,4.

Индукцию начинают при достижении культуральной средой оптической плотности при 600 нм (OD600) в 16-20 единиц.

Для индукции используют 1 мМ IPTG при насыщении растворенным кислородом в 10% (относительно воздуха). Продолжительность индукции составляет приблизительно 3 часа. Индукцию контролируют путем проведения электрофореза в SDS-PAGE, нанося по 20 мкл предварительно прокипяченного раствора до и после индукции.

Затем культуральную среду, содержащую индуцированные бактерии, центрифугируют 10 мин при 7500 g или 25 мин при 3000 g при 4°С и отбрасывают супернатант.

После этого бактериальные клетки подвергают лизису с последующей экстракцией и очисткой телец включения. Лизис бактерий проводится при помощи 2 циклов замораживания/оттаивания при - 80/37°С в лизирующем растворе, содержащем

Смесь для лизиса инкубируют 30 мин при комнатной температуре с перемешиванием (250 об/мин), а затем заливают в блендер соответствующей вместимости, разбавляют таким объемом промывочного раствора, содержащего 0,5% тритона Х-100 + 10 мМ ЭДТА рН 8, который эквивалентен 3 мл на 450 единиц OD600 бактерий.

При необходимости добавляют 0,4 мкл неразбавленного пеногасителя на 1 мл образца.

Раствор гомогенизируют в блендере при максимальной скорости в течение 1 мин либо до получения гомогенного образца. Затем содержимое блендера переносят в сосуд соответствующей вместимости, адекватно разбавляют из расчета 6,5 мл промывочного раствора на 450 единиц OD600 бактерий, полученную при этом суспензию центрифугируют 45 мин при 13000 g при 25°С и отбрасывают супернатант.

Весь процесс промывки повторяют несколько раз до получения конечного осадка, содержащего тельца включения экспрессированного белка.

После этого осадок, содержащий тельца включения, солюбилизируют в 7 мл денатурирующего буфера BD (8 М мочевина, 50 мМ трис рН 8, 20 мМ этилендиамин), а затем раствор разбавляют до конечной концентрации мочевины 5 М. Ренатурирование белка проводится в полученном при этом растворе путем добавления восстановленного глутатиона (конечная концентрация эквивалентна 1,25 мМ) и окисленного глутатиона (конечная концентрация эквивалентна 0,5 мМ) и инкубации при 20°С в течение 18-20 часов с перемешиванием.

По окончании инкубации его центрифугируют 10 мин при 20°С при 10000 g и фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,45 или 0,8 мкм.

Мутеин в ренатурированном виде, то есть в виде димера, подвергают очистке методом анионообменной хроматографии.

Раствор мутеина наносят на Q-сефарозу Fast Flow (Amersham biosciences), уравновешенную в буфере А (20 мМ этаноламин-HCl рН 8,5), и элюируют после промывки с помощью 20% буфера В (буфер А + 1 М NaCl), что соответствует концентрации NaCl 200 мМ.

Частично очищенный мутеин доводят до более высокой степени очистки методом обращенно фазовой хроматографии. С этой целью пик элюции после ионообменной хроматографии разбавляют раствором, содержащим ТФУ и этанол, таким образом, что образец разбавляется в 1,5 раза и содержит 15% этанола и 0,3% ТФУ. Добавление этих веществ увеличивает связывание мутеина с обращено фазовой смолой.

Раствор наносят на носитель RP Source (Amersham Bioscience) со средним диаметром частиц в 15 или 30 микрон, уравновешенный раствором, содержащим 40% этанола и 0,1% TFA. Промывочный раствор удаляет мономерную форму мутеина, тогда как димерная форма элюируется с помощью возрастающего градиента этанола при достижении содержания этанола в 70%.

Процесс хроматографической очистки проводится под контролем поглощения при 280 нм в элюируемых фракциях.

Полученный таким образом раствор димера хранят при -20°С, а затем подвергают ультрадиафильтрации и лиофилизации известными методами.

Пример 3. Первое исследование стабильности мутеина PLGF-1CG, несущего замену Cys-125 на Gly

Мутеин PLGF-1CG солюбилизировали в физрастворе до теоретической концентрации в 20, 5 и 1 мг/мл. Одновременно также солюбилизировали белок PLGF-1 (не содержащий мутации) в физрастворе до концентрации в 20 мг/мл. Все образцы хранили в холодильнике (4-8°С) вплоть до 40 дней.

Действительную концентрацию определяли путем вычисления среднего значения из 3 подходящих независимых разведении. Использовали метод спектрофотометрии при длине волны 280 нм, принимая, что поглощение в 1 единицу OD (оптической плотности) при измерении в кювете со стандартной длиной оптического пути в 1 см соответствует концентрации PLGF-1 и PLGF-1CG, эквивалентной 1 мг/мл. В последующие дни после начала эксперимента (время 0 в табл. 1) перед выполнением соответствующих разведений для определения концентрации порцию каждого образца центрифугировали при 13000 об/мин в микроцентрифуге ALC 4212 в течение 10 мин и для последующего анализа использовали супернатант. Таким образом, исключались возможные осадки, вследствие чего результаты относятся только к белку, остающемуся в растворе.

Результаты этого исследования приведены в табл. 1, и они четко показывают, что мутеин при всех исследованных концентрациях (20, 5 и 1 мг/мл), и, по меньшей мере, вплоть до 40 дней остается стабильным в том, что он не проявляет тенденции к образованию осадка в такой степени, что концентрация остается в пределах исходных значений. Напротив, уже после 4 дней хранения в растворе остается только 7,8% белка, не содержащего мутации, при хранении в концентрации 20 мг/мл в тех же условиях, что и мутеин. Эта величина уменьшается еще больше (5,5%) после 12 дней. Важно отметить, что всего после 24 часов хранения при 4-8°С уже наблюдается сильная преципитация белка PLGF-1, не содержащего мутации.

Таблица 1

Время хранения при 4-8°С (дни)Средняя концентрация (мг/мл)PLGF-1CG
20 мг/мл
SDPLGF-1CG
5 мг/мл
SDPLGF-1CG
1 мг/мл
SDPLGF-1
20 мг/мл
SD
020,381,005,430,041,070,0220,140,18419,690,575,250,270,980,081,570,101220,460,545,280,191,000,011,110,012620,720,33н/он/он/о4020,320,75н/он/он/о

SD = стандартное отклонение; н/о = определение не проводилось

Электрофоретический профиль (состав мономер-димер-полимер) мутеина PLGF-1CG (фиг.1) также практически стабилен при вышеуказанных условиях. Так, электрофорез в SDS-PAGE в невосстановительных условиях белка PLGF-1 CG, растворенного в физрастворе при 20 мг/мл и замороженного (контроль, кривая 1 на фиг.1), либо хранившегося при 4-8°С в течение 40 дней (образец, кривая 2 на фиг.1), в сущности проявляет лишь минимальные изменения, представленные исчезновением крошечной доли мономера и образованием чрезвычайно низкого количества тримера (0,5% от димера).

Пример 4. Второе исследование стабильности мутеина PLGF-1CG, заключенного в гель

Мутеин PLGF-1CG и не содержащий мутации белок PLGF-1 солюбилизировали при концентрации 0,2 мг/мл в геле, имеющем следующий состав:

Carbopol9401%ацетат натрия рН 4,415 мМ ЭДТА,натриевая соль, без доведения рН0,04%метилпарабен0,05%

Значение рН доводили до между 5,5 и 6 с помощью NaOH/уксусной кислоты.

Оба геля хранили при 4-8°С. Через различные промежутки времени отбирали порции геля в двойном повторе из обоих гелей (примерно 0,2 мл) и взвешивали на аналитических весах.

К взвешенным образцам добавляли невосстановительный 2-кратный буфер для образцов в объеме (в мкл), эквивалентном весу порции геля (в мг).

После перемешивания на вибрационной мешалке в течение 10 мин и центрифугирования при 13000 об/мин (микроцентрифуга ALC 4214) в течение 10 мин отбирали супернатант. Его центрифугировали опять и отделяли новый супернатант. Одну порцию его вместе с количественными стандартами анализировали методом невосстановительного электрофореза в SDS-PAGE. Гели после электрофореза окрашивали и анализировали с помощью денситометра для определения концентрации димерной формы в исследуемых образцах.

Результаты, полученные через различные промежутки времени и выраженные как содержание димера в процентах от его содержания в начальный момент времени (t=0), приведены в табл. 2 и представлены в виде графика на фиг.2. Из этих данных видно, что в то время как содержание димера PLGF-1CG остается постоянным вплоть до окончания исследуемого периода в 170 дней, содержание PLGF-1 падает до 71% через 150 дней и до 5 5% через 210 дней.

Электрофоретический профиль (состав мономер-димер-полимер) также свидетельствует, что мутеин PLGF-1CG практически стабилен при вышеуказанных условиях (фиг.3). Так, электрофорез в SDS-PAGE в невосстановительных условиях белка PLGF-1CG, растворенного в геле Carbopol при 0,20 мг/мл и замороженного (контроль, дорожка 2 на фиг.3), либо хранившегося при 4-8°С в течение 170 дней (образец, дорожка 1 на фиг.3), не обнаруживает никаких явлений полимеризации. Напротив, такие явления полимеризации четко выражены у не содержащего мутации белка PLGF-1, как видно из фиг.4 (ср. дорожку 1 - белок хранился при 4-8°С в течение 150 дней, и дорожку 2 - замороженный белок).

Таблица 2

Время хранения при 4-8°С (дни)Содержание димера (%)FenbcPLGF-lCG (мутеином)Гель с PLGF-10100,00100,0030108,00н/о57н/о83,40119н/о72,7013398,70н/о150н/о71,10170101,50н/о210н/о54,90

н/о = определение не проводилось

Пример 5. Оценка ангиогенной активности мутеина PLGF-1 CG

Сравнивали ангиогенную активность мутеина PLGF-1 CG, фактора PLGF-1 дикого типа и в качестве положительного контроля основного фактора роста фибробластов (bFGF), используя тест на васкудяризацию хориоаллантоисной мембраны кур (САМ), ранее описанный Maglione et al. ("II Farmaco", supra). Различные количества мутеина и фактора дикого типа наносили на желатиновые губки размером 1 мм3 (от 0 до 3 мкг/губку), которые затем имплантировали на поверхности САМ. Через 12 дней делали срезы участков САМ, соприкасавшихся с образцами, окрашивали и определяли ангиогенный эффект морфометрическим методом, известным как "подсчет точек". А именно, срезы САМ анализировали под микроскопом на решетке, имеющей 144 точки пересечения, и результаты выражали как процент числа точек пересечения, занятых капиллярами в поперечном разрезе (процент площади, подвергнувшейся васкуляризации). Результаты, представленные на фиг.6, свидетельствуют о практически эквивалентной ангиогенной активности мутеина и фактора дикого типа.

Пример 6. Оценка влияния мутеина PLGF-1 CG на вызванную изопреналином ишемию сердца

Влияние мутеина PLGF-1 CG на ишемию сердца и инфаркт оценивали на модели ишемии, вызванной изопреналином у животных, как описано Maglione et al. (supra) в отношении фактора дикого типа. Эксперимент проводили на кроликах, которым один раз в день вводили дозу мутеина в 160 мкг/кг или эквивалентный объем одного лишь наполнителя при внутривенном введении с 1-го по 5-й день. Изопреналин вводили подкожно в 1-й и 2-й день. Типичные характеристики электрокардиограммы (ЭКГ), указывающие на сильное ишемическое повреждение, такие как инверсия зубца Т, уширение зубца S и увеличение зубца Q, были значительно сильнее выражены у животных, обработанных одним лишь наполнителем, чем у животных, обработанных исследуемым мутеином. Изменения ЭКГ у обработанных и необработанных животных оценивали по шкале от 0 до 6 следующим образом: 0 - нет повреждений, 1 - увеличение зубца S, 2 - увеличение зубца Т, 3 - прогибание нисходящего плеча зубца Т, 4 - уширение зубца S, 5 - инверсия зубца Т, 6 - увеличение зубца Q. Также рассчитывали общую площадь под кривой, определяемой числом баллов ЭКГ за 5 дней тестирования у опытных и контрольных животных. Результаты представлены на фиг.7 и свидетельствуют о значительном уменьшении ишемических повреждений у животных, обработанных мутеином PLGF-1CG. Результаты, полученные на основании электрокардиографического профиля, были подтверждены при макроскопии и микроскопии ишемических тканей. Такое исследование показало наличие ишемических повреждений и гистологических изменений средней тяжести по сравнению с теми, что наблюдались в сердечной ткани у животных, обработанных только наполнителем.

Пример 7. Оценка влияния мутеина PLGF-1CG на вызванную неомицином склеродермию

В этом исследовании использовали модель склеродермии на животных, описанную Yamamoto et al. (supra).

Первую группу мышей С3Н обрабатывали блеомицином (100 мкг/мл) один раз в день путем подкожных инъекций в течение 3 недель. Три другие группы мышей С3Н обрабатывали сходным образом, но с добавлением 0,1, 1 и 10 мкг/мл мутеина PLGF-1CG к ежедневным инъекциям соответственно. Через 3 недели обработки животных забивали, брали образцы кожи из обработанных участков и подвергали гистологическому анализу. Эффект применения PLGF-1CG при 1 и 10 мкг/мл, но не при 0,1 мкг/мл свидетельствует о значительном уменьшении гистологических явлений, которые могут быть приписаны склеротизированию кожи, вызванному блеомицином. В частности, утолщение кожи и уровень гидроксипролина значительно снижались по сравнению с мышами, обработанными только блеомицином.

Пример 8. Фармацевтические композиции

i) Раствор для парентерального применения

58 мг лиофилизованного мутеина, содержащего 25 мг очищенного PLGF-1CG и 33 мг фосфатного буфера (10 мг NaH2PO4·H2O и 23 мг Na2HPO4·H2O), и приблизительно 125 мл физраствора для парентерального применения вносят по отдельности в специальные ампулы, позволяющие смешивать лиофилизованный препарат с растворителем непосредственно перед употреблением. Концентрация активного вещества после солюбилизации составляет примерно 0,2 мг/мл.

ii) Композиция для наружного применения в виде геля

Порцию лиофилизованного материала, содержащую 10 мг активного вещества, вносят в 20 мл водно-спиртового раствора 10% этанола, содержащего 20% DMSO. Затем в раствор добавляют подходящий гелевый наполнитель, содержащий следующие ингредиенты: 1% Carbopol 940, 15 мМ ацетат натрия (рН 4,4), 0,04% двунатриевой соли ЭДТА, 0,05% метилпарабена при конечном значении рН от 5,5 до 6.

Похожие патенты RU2344172C2

название год авторы номер документа
ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДА, СОДЕРЖАЩАЯ ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ МУТЕИН [C245S] ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ С-КОНЦЕВЫМ ТАГОМ, БАКТЕРИЯ E. coli - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C245S] ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ С-КОНЦЕВЫМ ТАГОМ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C245S] ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ С-КОНЦЕВЫМ ТАГОМ, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C245S] ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ С-КОНЦЕВЫМ ТАГОМ 2012
  • Воробьев Иван Иванович
  • Орлова Надежда Александровна
  • Усакин Лев Алексеевич
  • Мацкевич Виктор Александрович
RU2550027C2
ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНОВ, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА, ФЕРМЕНТАТИВНО АКТИВНЫЙ КОНЪЮГАТ МУТЕИНА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА 2011
  • Орлова Надежда Александровна
  • Воробьев Иван Иванович
RU2502803C2
ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА 2011
  • Орлова Надежда Александровна
  • Воробьев Иван Иванович
  • Мацкевич Виктор Александрович
  • Звягин Иван Владимирович
RU2495934C2
НОВЫЕ РАСТВОРИМЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ CD83, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ 2009
  • Бранд Стефен
  • Чоу Чих-Хсиун
  • Моо-Йоунг Мюррей
RU2535340C2
МУТЕИНЫ ЛИПОКАЛИНА 2 ЧЕЛОВЕКА (LCN2, HNGAL) С АФФИННОСТЬЮ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕННОЙ МИШЕНИ 2010
  • Скерра Арне
  • Гебауэр Михаэла
  • Хинц Доминик
  • Раут Забине
  • Мачинер Габриэле
  • Хюльсмейер Мартин
RU2564125C2
КОНЪЮГАТЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2006
  • Бахманн Мартин
  • Шпон Гунтер
  • Тиссо Ален
RU2441067C2
СИНТЕТИЧЕСКАЯ МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ), ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, КЛЕТКА МЛЕКОПИТАЮЩЕГО ХОЗЯИНА И СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БЕЛКА АНТИГЕНА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА-2 (HER2/neu) ИЛИ ЕГО УКОРОЧЕННОЙ ФОРМЫ 2004
  • Галло Паскуаль
  • Моначи Паоло
  • Нуццо Маурицио
RU2397249C2
СПОСОБ МАССОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ОБЛАСТИ Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА С УДАЛЕННЫМИ НАЧАЛЬНЫМИ МЕТИОНИНОВЫМИ ОСТАТКАМИ 2006
  • Дзунг Сунг Юб
  • Ким Дзин Сун
  • Шин Дзин Хван
  • Квон Се-Чанг
  • Ли Гван-Сун
  • Сонг Дае Хае
RU2428430C2
СТАБИЛЬНАЯ РЕКОМБИНАНТНАЯ АДЕНОЗИНДЕАМИНАЗА 2008
  • Филпула Дэвид Р.
  • Янгстер Стефен К.
RU2486246C2
ИММУНОСУПРЕССОРНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ 2008
  • Каррер Эрик Е.
  • Пейдхунгат Мадан М.
  • Бейс Стивен Х.
  • Нейборс Маргарет
  • Пуннонен Юха
  • Чепин Стивен Дж.
  • Висванатхан Сридхар
  • Ларсен Брент Р.
RU2506275C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 344 172 C2

Реферат патента 2009 года МУТЕИНЫ ПЛАЦЕНТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА 1 ТИПА, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ

Изобретение относится к генной инженерии, конкретно к получению мутеинов плацентарного фактора роста 1-го типа (PLGF-1), и может быть использовано в медицине. Мутеин мономерной формы PLGF-1 человека включает замену или удаление в полипептидной последовательности белка дикого типа одного остатка цистеина (Cys) в положении 142 полипептидной последовательности белка-предшественника с целью предотвращения мультимеризации данной мономерной формы. Изобретение позволяет получить химически стабильные мутеины PLGF-1 и эффективно применить их для диагностики и лечения онкологических и неонкологических патологий. 16 н. и 28 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 344 172 C2

1. Мутеин мономерной формы плацентарного фактора роста 1-го типа (PLGF-1) человека или животного, характеризующийся тем, что он включает замену или удаление в полипептидной последовательности белка дикого типа одного остатка цистеина (Cys) в положении 142 полипептидной последовательности белка-предшественника, которое соответствует цистеину в положении 125 в SEQ ID NO:2, причем данная замена или удаление не влияет на образование биологически активного димера, но предотвращает мультимеризацию данной мономерной формы, или его вариант, содержащий, помимо указанной модификации в положении 142, также модификацию одной или нескольких аминокислот, не приводящую к изменению функциональных характеристик мутеина.2. Мутеин по п.1, характеризующийся тем, что остаток Cys в положении 142 заменен остатком глицина (Gly).3. Мутеин по п.1 в виде белка-предшественника или зрелого белка.4. Мутеин по п.1, в котором еще одна или несколько аминокислот белка дикого типа удаляется, заменяется или добавляется без изменения функциональных характеристик мутеина.5. Мутеин по п.1 в димерной форме.6. Мутеин по п.5, содержащий по меньшей мере 98,5% димерной формы.7. Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая мутеин плацентарного фактора роста 1-го типа (PLGF-1) человека или животного и соответствующая аминокислотной последовательности мутеина по любому из пп.1-4.8. Нуклеотидная последовательность по п.7, характеризующаяся тем, что кодон TGC или TGT в последовательности, кодирующей PLGF-1 дикого типа, удален или модифицирован.9. Нуклеотидная последовательность по п.8, в которой кодон TGC или TGT заменен кодоном GGC, GGT, GGA или GGG.10. Нуклеотидная последовательность по п.9, в которой тимидиновое основание в положении 382 в последовательности SEQ ID NO:1 или ее производных, являющихся результатом вырожденности ДНК, заменено на гуанозиновое основание.11. Экспрессионная система, включающая нуклеотидную последовательность по п.7, фланкированную нетранслируемыми последовательностями для контроля и регуляции экспрессии.12. Экспрессионная система по п.11, характеризующаяся тем, что она представляет собой экспрессионную систему, индуцибельную в бактериальных клетках.13. Экспрессионная система по п.11, характеризующаяся тем, что экспрессия находится под контролем индуцибельного промотора.14. Экспрессионная система по п.11, характеризующаяся тем, что она представляет собой экспрессионную систему на основе РНК-полимеразы фага Т7 и что экспрессия индуцируется с помощью лактозы, изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) или функционально эквивалентного аналога.15. Клетка-хозяин, трансформированная при помощи экспрессионной системы по п.11 для продуцирования мутеина по п.1.16. Клетка-хозяин по п.15, характеризующаяся тем, что она представляет собой бактериальную клетку.17. Клетка-хозяин по п.16, характеризующаяся тем, что она происходит из штамма Е. coli.18. Способ получения нуклеотидной последовательности по п.7, характеризующийся тем, что ДНК, кодирующую мутеин, получают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя в качестве праймеров олигонуклеотиды, которые вносят сайт-специфичный мутагенез в кодон, соответствующий цистеину 125 относительно нуклеотидной последовательности дикого типа, и тем, что последовательность ДНК, полученную в ПЦР, подвергают реакции заполнения, а затем расщепляют соответствующими рестрикционными ферментами и клонируют в клонирующий вектор.19. Способ по п.18, в котором олигонуклеотид с последовательностью SEQ ID NO:3 используется в качестве 5'-3' (прямого) праймера, а олигонуклеотид с последовательностью SEQ ID NO:4 используется в качестве 5'-3' (обратного) праймера.20. Способ по п.18, в котором последовательность ДНК, кодирующая белок PLGF-1 без сигнального пептида, используется в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции.21. Способ получения мутеина фактора PLGF-1, характеризующийся тем, что клетки-хозяева по п.15 культивируют в подходящей культуральной среде, содержащей один или более селективных агентов, дрожжевой экстракт, глицерин и соли аммония, тем, что экспрессию белка индуцируют с помощью лактозы, изопропил-β-тиогалактопиранозида (IPTG) или функционально эквивалентного аналога, тем, что клетки выделяют и подвергают лизису, и что мутеин экстрагируют из лизисной смеси.22. Способ по п.21, в котором культуральная среда свободна от материала, происходящего из животных или человека.23. Способ по п.21, в котором клетки культивируют, перед стадией индукции экспрессии, до достижения оптической плотности (OD) культуральной среды от 0,2 до 50 единиц при 600 нм.24. Способ по п.21, в котором лизис клеток осуществляют при помощи замораживания/оттаивания, пресса Френча или другим эквивалентным методом.25. Способ по п.24, в котором тельца включения, высвобождаемые во время лизиса, выделяют при помощи, по меньшей мере, двух циклов центрифугирования и промывки в соответствующем буфере.26. Способ по п.24, в котором тельца включения солюбилизируют в денатурирующем буфере, содержащем мочевину, гуанидинизотиоцианат, гуанидингидрохлорид или другой денатурирующий агент и при необходимости гомогенизируют или обрабатывают ультразвуком.27. Способ по п.26, в котором после солюбилизации телец включения раствор разбавляют и ренатурируют белковый материал в димерной форме путем добавления в раствор окислительно-восстановительных агентов и инкубации в течение от 10 до 30 ч, предпочтительно от 18 до 20 ч, при температуре от 10 до 30°С, предпочтительно 20°С, с перемешиванием.28. Способ по п.21, включающий, по меньшей мере, одну стадию очистки димерного белка.29. Способ по п.28, в котором стадия очистки заключается в ионообменной хроматографии.30. Способ по п.28, в котором раствор после стадии ренатурирования наносят на анионообменную колонку при соотношении наносимого объема и колоночного объема от 1:1 до 10:1, предпочтительно 10:1.31. Способ по п.28, включающий стадию очистки на колонке методом обращено-фазовой хроматографии.32. Способ по п.21, включающий дополнительную стадию ультрафильтрации на мембране с последующей лиофилизацией в присутствии или в отсутствие соответствующих добавок.33. Поликлональное, моноклональное антитело или его функционально активный фрагмент, обладающий способностью к распознаванию мутеина по любому из пп.1-6, способностью к перекрестной реакции с PLGF-1 дикого типа и к нейтрализации его ангиогенной активности.34. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество мутеина по любому из пп.5 или 6 либо антитела по п.33 и фармакологически приемлемый наполнитель, для лечения ишемических заболеваний, склеродермии, кожных язв, ран, ожогов, послеоперационных состояний, патологического выпадения волос.35. Фармацевтическая композиция по п.34, пригодная для парентерального, наружного, орального, назального применения или применения в имплантах.36. Косметическая композиция, содержащая эффективное количество мутеина по любому из пп.5 или 6 и косметически приемлемый наполнитель, для лечения естественного или преждевременного старения кожных тканей или естественного выпадения волос.37. Способ получения фармацевтической композиции по п.34, в котором мутеин PLGF-1 объединяют с фармакологически приемлемым наполнителем и с другими обычными добавками.38. Способ получения косметической композиции по п.36, в котором мутеин PLGF-1 объединяют с косметически приемлемым наполнителем и с другими обычными добавками.39. Применение мутеина по любому из пп.5 или 6 для получения композиции для лечения ишемических заболеваний.40. Применение по п.39, где ишемические заболевания включают ишемию ткани миокарда, инфаркт миокарда, ишемический удар и хронические ишемические заболевания миокарда, ишемию головного мозга и ишемический удар, ишемию кишечника, периферическую ишемию конечностей.41. Применение мутеина по любому из пп.5 или 6 для получения композиции для лечения склеродермии.42. Применение мутеина по любому из пп.5 или 6 для получения композиции для лечения кожных язв, ран, ожогов, послеоперационного лечения.43. Применение мутеина по любому из пп.5 или 6 для получения композиции для лечения естественного или преждевременного старения кожных тканей.44. Применение мутеина по любому из пп.5 или 6 для получения композиции для лечения естественного или патологического выпадения волос.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2009 года RU2344172C2

WALSH Т.Р
et al., Computer modelling of the receptor-binding domains of VEGF and PIGF, Protein Eng., 1997, v.10, n.4, p.389-398
US 5919899, 06.07.1999
WO 9926975, 03.06.1999
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ТКАНЕВОЙ АКТИВАТОР ПЛАЗМИНОГЕНА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 1988
  • Ясуси Каваути[Jp]
  • Тосиюки Такемото[Jp]
  • Макото Такаяма[Jp]
  • Масами Екота[Jp]
  • Масао Като[Jp]
  • Кимио Катсута[Jp]
  • Хироси Гусима[Jp]
RU2107727C1

RU 2 344 172 C2

Авторы

Мальоне Доменико

Баттисти Мауро

Конти Этторе

Сальвиа Джузеппе

Туччи Марина

Мион Альберто

Даты

2009-01-20Публикация

2003-05-19Подача