ОЧИЩЕННЫЙ 145 кДа-БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ СВЯЗЫВАТЬ ХОЛЕСТЕРИН И/ИЛИ ИНГИБИТОРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА, СПОСОБЫ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ОЧИСТКИ И ПРИМЕНЕНИЕ 145 кДа-БЕЛКА Российский патент 2009 года по МПК C07K14/47 

Данное изобретение касается метода выделения кишечного белка, вовлеченного в абсорбцию кишечного холестерина и способности связывать ингибиторы абсорбции холестерина.

У людей в среднем примерно 50% холестерина присутствует в просвете кишечника. Внутрипросветный холестерин происходит главным образом из пищи и желчи. Примерно 2 г холестерина в день выделяется из желчи. Абсорбция кишечного холестерина сильно зависит от присутствия желчных солей. Таким образом, эффект введения ингибиторов вторичного захвата желчных солей или соединений, связывающих желчные соли, заключается в ингибировании абсорбции кишечного холестерина.

Ингибирование абсорбции кишечного холестерина является важной целью лечения липидных нарушений, артериосклероза и сердечно-сосудистых нарушений. Среди экспертов превалирует мнение, что абсорбция кишечного холестерина происходит посредством физико-химической диффузии.

Известен ряд наблюдений в связи с транспортом холестерина, которые показывают, что в него вовлечен белок. Абсорбция кишечного холестерина подвержена большой индивидуальной вариабельности. Биохимические данные экспериментов in vitro показывают, что белки вовлечены в холестериновый обмен между небольшими однослойными везикулами и везикулами щеточной каймы кишечника. Можно наблюдать большое различие в кишечной абсорбции растительных стеринов, таких как β-ситостерин и кампестерин, которые различаются только метильной группой (β-ситостерин) и этильной группой (кампестерин). У людей β-ситостерин демонстрирует, кроме всего, ингибирование абсорбции холестерина. Существует два высокоактивных класса соединений, которые ингибируют абсорбцию кишечного холестерина при введении в просвет. Данные соединения, с одной стороны, являются производными сапонина, такими как тикузид и памаквезид, и, с другой стороны, некоторыми производными 2-азетидинонов. Производные 2-азетидинонов, как ингибиторы абсорбции холестерина, описаны в работе Clader и др., J. Med. Chem. 39, 3684-3693, 1996. Для целей данного изобретения термин "абсорбция" используют для обозначения присоединения вещества к белку и транспортировки данного вещества при помощи данного белка.

Кишечная абсорбция холестерина вносит существенный вклад в гомеостаз холестерина сыворотки. Ингибиторы абсорбции кишечного холестерина, подобные эзетимибу (Ezetimibe) или памаквезиду (Pamaqueside), доказали при клинических испытаниях свою эффективность в качестве новых агентов, понижающих холестерин. Несмотря на огромные научные усилия, их молекулярный способ действия, а также механизмы абсорбции кишечного холестерина еще не известны и дискутируются. Обычно предполагают пассивную диффузию холестерина через плазменные мембраны и клеточную мембрану щеточной каймы кишечника, но имеется увеличивающееся число доказательств процесса абсорбции кишечного холестерина, опосредованного белком: абсорбция холестерина показывает сильное видовое различие, и структурно тесно связанные растительные стерины, подобные β-ситостерину или кампестерину, со сравнимыми физико-химическими характеристиками, в противоположность холестерину, только слабо абсорбируются, делая маловероятным простой диффузионный процесс. Наличие специфических транспортных ингибиторов холестерина, таких как 2-азетидинонов и стерингликозидов, с сильной взаимосвязью структура-активность в высокой степени предполагает опосредованный белком способ абсорбции кишечного холестерина.

Холестерин представляет собой разностороннее соединение, которое является жизненно важным (в небольших количествах) для функционирования человеческого организма. Только животные продуцируют его; растительный продукт не содержит холестерина до тех пор, пока в него не добавлен при обработке животный продукт, такой как лярд. У людей холестерин выполняет три основные функции. Он используется некоторыми железами для производства стероидных гормонов или гормонов, подобных кортизону, включая половые гормоны. Он помогает печени продуцировать желчные кислоты, которые существенны для переваривания жиров. Последнее, но не самое меньшее, он является важнейшим компонентом клеточных мембран и структур типа строительного блока для тканей организма. Без холестерина не существовало бы жизни млекопитающих.

Проблема с холестерином появляется, когда в организме его слишком много, или имеются его отложения в ненужных местах. Коронарная болезнь сердца появляется в результате отложения холестерина внутри стенок сердечных коронарных артерий, основных поставщиков кислорода к мышечным тканям сердца. Там он способствует образованию прочных жировых закупорок, называемых бляшками. Такое накопление бляшек называют по-разному: артериосклероз, затвердение артерий и атеросклероз. Холестерин может также отлагаться внутри артерий в другом месте организма, где он может способствовать возникновению инсульта (из-за блокированных артерий в головном мозге) и периферического сосудистого заболевания (из-за артериальной блокировки в ногах).

Для перемещения по организму холестерин должен быть упакован в специальные молекулы, называемые липопротеинами. Липиды или жирные компоненты холестерина упакованы в водорастворимую протеиновую оболочку. Различные типы липопротеинов содержат изменяющиеся липопротеины для динамической экономии в организме, транспортируя холестерин к некоторым тканям и удаляя его из других. Основным холестерин-несущим соединением в организме является липопротеин низкой плотности или LDL-холестерин. LDL часто обозначают как "плохой холестерин", так как, по-видимому, он играет ключевую роль в отложении холестерина в артериях. Он называется липопротеин низкой плотности, так как имеет очень мало белка, основного составляющего плотности молекулы, и состоит в основном из жиров. Высокое содержание LDL связано с повышенным риском коронарного сердечного заболевания. Липопротеин высокой плотности часто называют "хорошим холестерином", так как он, по-видимому, помогает удалять холестерин со стенок артерий и транспортировать его в печень для экскреции. В противоположность LDL-холестерину, низкие уровни HDL связаны с повышенным риском коронарного сердечного заболевания, тогда как более высокие уровни HDL, по-видимому, защищают от данного заболевания.

Другие подтипы холестериновых частиц включают хиломикроны, которые продуцируются кишечными клетками, когда перевариваются жиры, и липопротеин очень низкой плотности (VLDL), продуцируемый печенью как важный предшественник производства LDL-холестерина. VLDL представляет собой важный липопротеин, который транспортирует триглицериды, производимые печенью.

Для целей определения риска сердечного заболевания LDL и HDL являются ключевыми.

На основании тех фактов, что пища с высоким содержанием жира и высоким содержанием холестерина способствует повышенным уровням холестерина в крови и что высокое содержание холестерина в крови составляет определенный фактор риска для сердечного заболевания, может казаться естественным допущение, что понижение холестерина в крови посредством диеты или другим способом снижает данный риск.

Целью данного изобретения является обеспечение способа выделения белка, который участвует в абсорбции кишечного холестерина и представляет собой молекулярную белковую мишень для ингибиторов абсорбции холестерина. Полагают, что такой способ приносит большую пользу терапевтическим усилиям по регулированию повышенных уровней холестерина. Данное изобретение касается способа выделения белка, в котором

a) получают биологический материал;

b) данный биологический материал из a) инкубируют с фотореактивным 2-азетидиноновым соединением, которое является радиоактивно меченым и способно специфически связываться с указанным белком;

c) солюбилизируют данный биологический материал и удаляют клеточный дебрис;

d) добавляют супернатант в устройство, содержащее агарозу с лектином ростков пшеницы;

e) элюат агарозы с лектином пшеничных ростков из d) наносят на колонку с гидроксилапатитом, которую элюируют с градиентом фосфатного буфера;

f) радиоактивно меченые фракции из e) загружают на препаративный SDS-PAGE;

g) радиоактивно меченые фракции собирают и, при необходимости, осаждают.

Данный биологический материал берут предпочтительно из ткани кишечника, или клеток кишечной клеточной культуры, или клеток щеточной каймы подвздошной кишки человека, крысы, мыши или кролика.

Фотореактивные 2-азетидиноновые соединения предпочтительно имеют следующую структуру (Kramer, W. и др. (2000) FEBS Letters 487, 293-297).

Формула I

где R выбран из одной из следующих групп a) - e):

Синтез соединений формулы I a, b и c раскрыт в DE 10042447 A1, опубл. 28 марта 2002 г. Синтез соединений формулы I d и e описан здесь далее в примерах.

Фотолабильную группу в молекуле можно использовать для образования ковалентных связей с молекулой, предпочтительно молекулой белка, расположенной в непосредственном соседстве. Для данной цели соединение с фотолабильной группой сначала приводят в непосредственное соседство с молекулой, с которой предполагается образование ковалентной связи. Это может происходить, например, через другую часть соединения, которое действует как специфический ингибитор белка, предпочтительно ингибитор абсорбции холестерина. Контакт данного соединения с данной молекулой сопровождается облучением УФ-светом. Облучение УФ-светом активирует фотолабильную группу и инициирует образование ковалентной связи с взаимодействующей молекулой, в частности белком. В качестве фотолабильной группы подходят, например, диазирин-, азидо- или карбонильная функциональные группы.

Можно применять для получения облучения обычную УФ-лампу, подобную применяемой, например, для визуализации полинуклеотидов с включенным этидийбромидом или для стерилизации лабораторных поверхностей, или фотохимический реактор, который можно приобрести, среди прочего, от "The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT". После облучения УФ-светом проводят разрушение клеток, применяя обычные способы. Их примерами являются циклическое замораживание и таяние, обработка клеток ультразвуком, использование френч-пресса или добавка детергента и ферментов. Фракционирование белков клеточного лизата можно выполнять, например, посредством осаждения сульфатом аммония, дифференциальным центрифугированием или применяя хроматографические методики. Хроматографическими методиками, подходящими для данной цели, являются, например, денатурирующий или неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле в одном или двух измерениях, жидкостная хроматография при высоком давлении, ионообменная хроматография или аффинная хроматография. Данные методики знакомы специалистам и подробно рассматриваются, например, в "Current Protocols in Protein Science"; John E. Caligan; Ben M. Dunn; Hidde L. Ploegh; David W. Speicher; Paul T. Wingfield; Wiley and Sons; ISBNO-471-11184-8.

Детектирование белка предпочтительно проводить после фракционирования посредством введения радиометки в соединение, содержащее ингибитор абсорбции кишечного холестерина и фотолабильную группу. Радиоактивный изотоп, который можно использовать для данной цели, представляет собой, например, ³H или ¹⁴C. Подходящим способом детектирования является, например, детектирование белка, который содержит ковалентно связанное соединение, посредством пленочного материала, применяемого для рентгеновской фотографии, после введения белка в полиакриламидный гель при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Другими подходящими способами детектирования является измерение в жидком сцинтилляторе или сканирование в плоском слое.

Биологический материал состоит предпочтительно из кишечных клеток. Кишечные клетки можно получить, например, путем рассечения кишечника животных и последующей очистки, ферментативного разрушения соединительной ткани и суспендирования отдельных клеток в изотонических буферных растворах. Кишечные ткани, подходящие для приготовления кишечных клеток, представляют собой, среди прочего, соответствующие части животных, остающиеся после забоя скота. Кишечные клетки можно также получить из частей ткани кишечника после того, как получены части кишечника при операции. Кишечные клетки могут также состоять из кишечных клеточных культур, полученных для целей данного изобретения посредством применения методик приготовления клеточных культур. Части кишечных клеток могут представлять собой органеллы кишечных клеток. Органеллы, предпочтительно, представляют собой мембраны кишечных клеток. Мембраны кишечных клеток можно получить дифференциальным центрифугированием после разрушения данных клеток. Части кишечных клеток также, предпочтительно, представляют собой белковые фракции. Запас кишечных клеток или частей кишечных клеток представляет собой кишечные клетки, содержащие предпочтительно клетки щеточной каймы кишечной ткани организмов млекопитающих.

Млекопитающие, из которых получают данные кишечные клетки, предпочтительно включают, но не ограничены этим, людей, обезьян, крупный рогатый скот, свиней, крыс, мышей, кроликов, хомяков или другие позвоночные виды. Данные клетки можно получить, готовя клеточные суспензии из ткани щеточной каймы кишечника таких организмов. Подходящий кишечный материал получают, например, при хирургических процедурах. Другие источники можно получить из частей животных после забоя скота. Также подходящими являются клетки кишечной клеточной линии. Для приготовления подходящих клеточных препаратов ткань кишечника можно подвергать ферментативной обработке для высвобождения отдельных клеток и затем проводить дифференциальное центрифугирование. Затем полученные клетки или органеллы переносят в подходящую водную среду. Такая водная среда может содержать буферные вещества, соли, белки и, кроме того, эксципиенты.

Данное изобретение касается также способа выделения связующего белка для ингибиторов абсорбции холестерина, вовлеченного в абсорбцию кишечного холестерина, в котором

a) получают биологический материал;

b) биологический материал из a) инкубируют с фотореактивным ингибитором захвата холестерина, который является радиоактивно меченым или биотин-меченым;

c) солюбилизируют биологический материал из b) и удаляют клеточный дебриз;

d) супернатант подвергают хроматографическим процедурам или добавляют в стрептавидин-агарозу;

e) элюат добавляют в SDS-PAGE;

f) белки, соответствующие диапазону размеров 140-150 кДа, удаляют, элюируют и, при необходимости, подвергают повторной укладке.

Данный биологический материал берут предпочтительно из ткани кишечника, или клеток кишечной клеточной культуры, или клеток щеточной каймы подвздошной кишки человека, крысы, мыши или кролика.

Ингибитор поглощения холестерина, который является биотин-меченым, предпочтительно имеет структуру:

Данное изобретение касается также белка, обладающего способностью специфически связывать ингибиторы абсорбции холестерина, который выделяют способом данного изобретения, как указано выше. Данный белок предпочтительно имеет размер 140-150 кДа и наиболее предпочтительно 145 кДа. Данный белок является необязательно гликозилированным.

Молекулярную массу белков устанавливают, допуская некоторый интервал неопределенности, что вызвано применяемым методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, но это известно также для других соответствующих способов. Колебания молекулярных масс происходят в диапазоне до ±10%. Указанные величины представляют средние значения из множества экспериментов. В случае белка с указанной молекулярной массой 145 кДа выполняют определения молекулярной массы в 10 экспериментах независимо друг от друга методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, получая среднее значение 145,3 кДа при стандартном отклонении ±7,55 кДа.

Специалисты обнаружат подробности подходящих способов проверки гликозилирования в работе "Carbohydrate Biotechnology Protocols, Methods in Biotechnology, 10 (1999) Humana Press, ISBN 0-89603-563-8, Editor C. Bucke".

Данное изобретение касается также комплекса, образуемого белком данного изобретения и соединением, имеющим следующую структуру:

Данное изобретение касается также фармацевтической композиции, содержащей белок данного изобретения и фармацевтически приемлемые соединения и/или эксципиенты для приготовления лекарственного средства. Такие вещества общеизвестны и описаны, например, в Remingtons Pharmaceutical Sciences, fifth edition, by Mack Publishing Company.

Кроме того, данное изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей комплекс белка данного изобретения и соединение, которое упоминается выше, а также фармацевтически приемлемые соединения для приготовления лекарственного средства.

Изобретение включает также применение белка данного изобретения для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое связано с повышенными уровнями холестерина. Такими заболеваниями являются, например, ожирение, артериосклероз, высокое кровяное давление, сердечная недостаточность и другие. Уровень холестерина 199 мг/дл считается повышенным.

Изобретение включает также применение комплекса белка данного изобретения и соединения, которое указано выше, для производства фармацевтической композиции для лечения заболевания, которое связано с повышенным уровнем холестерина.

Данное изобретение также касается применения белка данного изобретения для идентификации соединения, ингибирующего вторичный захват холестерина, в котором

a) получают биологический материал, который содержит белок данного изобретения;

b) получают соединение;

c) осуществляют взаимодействие данного биологического материала и данного соединения;

d) определяют количество холестерина, захваченного биологическим материалом из c);

e) результат из d) сравнивают с результатами контрольного эксперимента, где определяют захват холестерина биологическим материалом, который имеет такую же видовую и/или тканевую специфичность, как биологический материал из a), но не приведен в контакт с соединением из b);

f) результаты из e) определяют соединение, ингибирующее вторичный захват холестерина, в случае пониженного захвата холестерина клетками, которые приведены в контакт с соединением из b).

Изобретение касается также лекарственного средства, содержащего соединение, которое идентифицируют таким способом, а также фармацевтически приемлемые эксципиенты для лечения заболевания, которое связано с повышенными уровнями холестерина.

Молекулярная масса такого соединения предпочтительно составляет от 100 до 50000 Да и более предпочтительно от 100 до 5000 Да. Данное соединение может быть аналогом холестерина, белком, пептидом или соединением, содержащим жирную кислоту.

Получение соединения происходит, например, при химическом синтезе. Данное соединение может быть частью коллекции химических соединений, подобных соединениям, получаемым в результате накопления и каталогизации химических соединений из завершенных программ синтеза ("библиотеки соединений"). Данное соединение в других случаях может продуцироваться микроорганизмом, в частности бактериями или грибами, или животными или растительными видами (природные вещества). В случае природных веществ получение также может происходить посредством выделения из подходящих организмов. Взаимодействие белка с соединением в большинстве случаев происходит в водных растворах, к которым подмешивают некоторую долю такого растворителя как, например, диметилсульфоксид или этанол. Водные растворы также могут содержать буферные вещества, ионы или стабилизирующие добавки, такие как белки, глицерин или другие. Для взаимодействия могут быть полезны особые постоянные условия, например температура, pH, ионные состояния, концентрации белка или соединения или объем. Таким образом, во время взаимодействия может быть предпочтительным, например, поддерживать температуру постоянной при 37°C. Определение связывания соединения с белком после осуществления контакта проводят, например, посредством взаимодействия с холестерином или ингибиторами поглощения холестерина, которые имеют другую радиометку, используя замещение холестерина или ингибиторов абсорбции холестерина как меру сродства соединения относительно белка.

Примеры

Синтез [2-(4-азидофенил)-1-(4-{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил]фенилкарбамоил}бутилкарбамоил)этил]амида 5-(2-оксогексагидротиено[3,4-d]имидазол-6-ил)пентаноевой кислоты

Номера 1-14 в следующем отрывке относятся к общей реакционной схеме на фиг.1.

Синтез

биотин-меченого фотореактивного ингибитора холестерина [2-(4-азидофенил)-1-(4-{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил] фенилкарбамоил}бутилкарбамоил)этил]амида) (5-(2-оксогексагидротиено[3,4-d]имидазол-6-ил)пентаноевой кислоты

Номера 1-14 в следующем отрывке, касающиеся синтеза указанного биотин-меченого фотореактивного ингибитора холестерина, относятся к реакционной схеме на фиг.1 и 2.

3-[5-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-5-фенилпентаноил]-4-фенилоксазолидин-2-он (1)

30 г 3-(5-гидрокси-5-фенилпентаноил)-4-фенилоксазолидин-2-он растворяют в 50 мл ДМФА. После добавления 14,3 г имидазола и 19 г трет-бутилдиметилсилилхлорида в 25 мл ДМФА реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре до растворения всех компонентов (2-4 ч). Реакционный раствор выпаривают и после добавления воды экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты. После сушки органической фазы сульфатом магния и выпаривания получают соединение 1: C₂₆Н₃₅NO₄Si (453,6) МС (ESI⁺) 476 (M+Na⁺).

(4-метоксибензилиден)-(4-нитрофенил)амин (2)

К 50 г (370 ммоль) анисового альдегида в 160 мл изопропанола добавляют 51 г (370 ммоль) пара-нитроанилина. Через 2 ч при 80°C продукт осаждается. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Остаток промывают изопропанолом. После сушки получают 62,9 г продукта 2 (выход 66%) в виде желтых кристаллов: C₁₄H₁₃N₂O₃ (257,27).

3-{5-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-2-[(4-метоксифенил)-(4-нитрофениламино)метил]-5-фенилпентаноил}-4-фенилоксазолидин-2-он (3)

К 5,4 г (12,0 ммоль) продукта 1 и 6,2 г (24 ммоль) продукта 2 в 135 мл метиленхлорида добавляют 8 мл диизопропилэтиламина при 10°C и добавляют по капле 4,8 мл триметилсилилхлорида. Через 1 час добавляют по капле 14 мл 1-молярного раствора титантетрахлорида в метиленхлориде при -10°C. Перемешивают реакционную смесь в течение 3 ч при -10°C и далее хранят 12 ч при -30°C без перемешивания. Затем добавляют 8 мл уксусной кислоты и 140 мл 7% водного раствора винной кислоты и перемешивают реакционную смесь еще 2 ч при комнатной температуре. После добавления 50 мл 20% водного раствора гидросульфита натрия перемешивают ее еще 1 час и экстрагируют метиленхлоридом. Органическую фазу сушат сульфатом магния, выпаривают и очищают методом хроматографии на силикагеле (этилацетат/гептан = 1/3 -> 1/1). Получают 6,3 г (74%) продукта 3 в виде светло-желтого твердого соединения C₄₀H₄₇N₃O₇Si (709,92) МС (ESI⁺) 710 (M + H⁺).

3-[3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-3-фенилпропил]-4-(3-метоксифенил)-1-(4-нитрофенил)азетидин-2-он (4)

Смесь, содержащую 6,1 г (8,6 ммоль) продукта 3, 7,3 мл бистриметилсилилацетамида, 0,5 г тетрабутиламмонийфторида и 100 мл трет-бутилметилового эфира, перемешивают в атмосфере аргона в течение 10 ч при комнатной температуре. По завершении взаимодействия медленно добавляют 5 мл уксусной кислоты при охлаждении на льду и выпаривают. Остаток отделяют методом хроматографии на силикагеле (этилацетат/гептан = 1/2). Получают 3,3 г (70%) продукта 4 в виде светло-желтого твердого соединения C₃₁H₃₈N₂O₅Si (546,74) МС (ESI⁺) 547,3 (M + H⁺).

1-(4-аминофенил)-3-[3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-3-фенилпропил]-4-(3-метоксифенил)азетидин-2-он (5)

Проводят взаимодействие 3,0 г (5,5 ммоль) продукта 4 в 50 мл этилацетата и 1,0 г палладия на древесном угле (10%) в течение 2 ч в атмосфере водорода при давлении 5 бар, применяя автоклав. Реакционный раствор фильтруют, выпаривают и отделяют методом хроматографии на силикагеле (метиленхлорид/метанол = 10/1). Получают 2,4 г (86%) продукта 5 в виде бесцветного твердого соединения: C₃₁H₄₀N₂О₃Si (516,76) МС (ESI⁺) 517,4 (M + H⁺).

1-(4-аминофенил)-3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-4-(3-метоксифенил)азетидин-2-он (6)

15 мл 2N водной соляной кислоты добавляют к 2,3 г продукта 5 в 20 мл тетрагидрофурана и перемешивают в течение 2 ч. Добавляют к реакционной смеси водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу сушат сульфатом магния, выпаривают и очищают методом хроматографии на силикагеле (этилацетат/гептан = 1/1 -> 1/0). Получают 1,1 г продукта 6 в виде бесцветного твердого соединения C₂₅H₂₆N₂O₃ (402,50) МС (ESI⁺) 403,2 (M + H⁺).

9H-флуорен-9-илметиловый эфир (4-{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил]фенилкарбамоил}бутил)карбаминовой кислоты (8)

0,8 г (2,0 ммоль) продукта 6 и 1,35 г (4,0 ммоль) 5-(Fmoc-амино)валериановой кислоты 7 (Fluka) растворяют в 15 мл ДМФА (диметилформамид). Постепенно добавляют следующие вещества: 4,8 г TOTU (Fluka), 1,6 г Oxime (этиловый эфир гидроксииминоциануксусной кислоты; Fluka) и 5,5 мл NEM (4-этилморфолин). Через 1 час при комнатной температуре реакционную смесь разбавляют 100 мл этилацетата и промывают три раза водой. Органическую фазу сушат, применяя MgSO₄, фильтруют и выпаривают. Остаток очищают методом флэш-хроматографии (этилацетат/н-гептан 2:1). Получают 0,58 г (41%) продукта 8 в виде аморфного твердого соединения: C₄₅H₄₅N₃O₆ (723,8) МС (ESI⁺) 724,4 (M + H⁺).

{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил]-фенил}амид 5-аминопентаноевой кислоты (9)

570 мг (0,78 ммоль) продукта 8 и 0,8 мл диэтиламина растворяют в 5 мл ДМФА (диметилформамид). Выпаривают раствор через 1 час при комнатной температуре. Остаток очищают методом флэш-хроматографии (метиленхлорид/метанол/концентрированный аммиачный раствор 30:10:3), получают 220 мг (56%) продукта 9 в виде аморфного твердого соединения C₃₀H₃₅N₃O₄ (501,63) МС (ESI⁺) 502,3 (M + H⁺).

9H-флуорен-9-илметиловый эфир [2-(4-азидофенил)-1-(4-{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил]фенилкарбамоил}бутилкарбамоил)этил]карбаминовой кислоты (11)

200 мг (0,40 ммоль) продукта 9 и 340 мг (0,79 ммоль) Fmoc-пара-азидо-Phe-OH (Bachem) растворяют в 4 мл ДМФА (диметилформамид) и проводят взаимодействие согласно получению продукта 8. Получают 300 мг (82%) продукта 11 в виде аморфного твердого соединения: C₅₄H₅₃N₇O₇ (912,07) МС (ESI⁺) 912,5 (M + H⁺).

{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил]фенил}амид 5-[2-амино-3-(4-азидофенил)пропиониламино]пентаноевой кислоты (12)

300 мг (0,33 ммоль) продукта 11 и 0,8 мл диэтиламина растворяют в 4 мл ДМФА (диметилформамид) и проводят взаимодействие согласно получению соединения 9. Получают 42 мг (19%) соединения 12 в виде аморфного твердого соединения: C₃₉H₄₃N₇O₅ (689,82) МС (ESI⁺) 690,3 (M + H⁺).

[2-(4-азидофенил)-1-(4-{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил]фенилкарбамоил}бутилкарбамоил)этил]амид 5-(2-оксогексагидротиено[3,4-d]имидазол-6-ил)пентаноевой кислоты (14)

40 мг (0,058 ммоль) соединения 12 и 60 мг D-биотинил-N-гидроксисукцинимида 13 (Bachem) растворяют в 0,5 мл ДМФА (диметилформамид). Выпаривают раствор через 1 час при комнатной температуре. Остаток очищают методом флэш-хроматографии (метиленхлорид/метанол/концентрированный аммиак 30:5:1). Получают 29 мг (55%) соединения 14 в виде аморфного твердого соединения C₄₉H₅₇N₉O₇S (912,12) МС (ESI⁺) 916,6 (M + H⁺).

Исследования фотоаффинной маркировки и связывания

Выделяют везикулы из ткани щеточной каймы тонкой кишки кролика способами, известными специалистам (Kramer и др. J. Biol. Chem. 268, 18035-18046 (1993)). Выполняют фотоаффинную маркировку, применяя соединение с радиоактивной меткой формулы Ia), или формулы Ib), или формулы Ic), или формулы Id), или формулы Ie) данного изобретения в фотохимическом реакторе типа Rayonet RPR-100 (от "The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT"). Мембранные везикулы щеточной каймы (от 100 до 200 мкг белка) инкубируют с одним из соединений в объеме 200 мкл в смеси 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/100 мМ NaCl/100 мМ маннит при 20°C в темноте в течение 5 мин. Вместо везикул щеточной каймы можно также применять органеллы, в частности их мембраны. К ним относятся приведенные далее утверждения. После инкубации в темноте проводят облучение УФ-светом при 254 нм в течение 20 или 60 с. Затем везикулы щеточной каймы дважды промывают указанным буфером. Белки осаждают по обычным методикам, таким как, например, добавление этанола, добавление соли или детергента, нагревание, циклическое замораживание и оттаивание, или другим подходящим способом, известным специалистам, и фракционируют методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле. Радиоактивно меченые белки детектируются методами LSC или флюорографии. Сродство меченых белков из ткани щеточной каймы относительно данных соединений составляет величину в диапазоне от 1 до 100 нМ.

Животные и мембранные препараты

Самцов Новозеландских белых кроликов массой 4-5 кг (Harlem Winkelmann, Borchem, Germany) содержат на стандартной диете Altronin® C 2023 (Altronin®, Lage, Germany) без ограничения. Мембранные везикулы щеточной каймы из желудка, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, ободочной кишки, прямой кишки и почек получают методом Mg²⁺-осаждения. Микросомы печени крыс и мембраны адипоцитов крыс получают по стандартным методикам.

Ингибирование абсорбции холестерина

Абсорбцию кишечного холестерина определяют модифицированным способом Zilversmit/Hughes. Самцов мышей NMRI (Charles River Deutschland GmbH, Salzfeld, Germany), содержащихся на обычной пище (Altronin®, Lage, Germany), держат голодными в течение 12 ч. Каждому животному вводят при помощи желудочного зонда 0,5 мл раствора 0,5% метилцеллюлоза/5% Solutol (BASF, Ludwigshafen, Germany) в качестве носителя с 3 мг соответствующего ингибитора абсорбции холестерина или без него, а затем 0,25 мл раствора Intralipid® (Pharmacia & Upjohn, Erlangen, Germany), содержащего 0,24 мкКю [¹⁴C]-холестерина и 0,25 мкКю [³H]-ситостерина. Животных (пять мышей на группу) содержат в клетках для изучения метаболизма и собирают фекалии. Через 24 ч животных умерщвляют и определяют радиоактивность в фекалиях и печени, применяя анализ сжиганием.

Растворимость 145 кДа-связующего белка для ингибиторов абсорбции холестерина

Мембранные везикулы щеточной каймы тонкой кишки кролика после фотоаффинной маркировки промывают несколько раз смесью 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/ 300 мМ маннит. Полученный осадок растворяют до концентрации белка 1 мг/мл в течение 60 мин при 4°C в смеси 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/75 мМ KCl/5 мМ MgCl₂/1 мМ EGTA/1 мМ DTT/1% (мас./об.) н-октилглюкозид/1% Triton X-100/1% (мас./об.) ("солюбилизационный буфер"). По-другому, растворимость мембранных белков можно повысить до концентрации белка 10 мг/мл с 1% SDS в 10 мМ буфере Tris/Hepes (pH 7,4) при 4°C в течение 10 мин с последующим разбавлением 1:10 смесью 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/1% н-октилглюкозид. После центрифугирования супернатанты, содержащие солюбилизированные мембранные белки, смешивают и разбавляют подходящими буферами для хроматографии, содержащими 1% н.-октилглюкозида в качестве детергента.

Очистка радиоактивно меченого 145 кДа-связующего белка для ингибиторов абсорбции холестерина после фотоаффинной маркировки фотореактивным 2-азетидиноном C-1

Фотоаффинная маркировка

Образцы мембранных везикул щеточной каймы подвздошной кишки (250 мкг белка) инкубируют с 66 нМ (0,3 мкКю) [³H]C-1 в смеси 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/100 мМ NaCl/100 мМ маннит в течение 30 мин при 20°C в темноте. После облучения в течение 30 с при 254 нм в фотохимическом реакторе Rayonet RPR 100, оснащенном 4 лампами RPR 2537 A (The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT, USA), собирают образцы, после центрифугирования мембранные везикулы повторно суспендируют в 2 мл смеси 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/300 мМ маннит и через 20 мин центрифугируют при 20°C. Данную процедуру повторяют три раза. Полученный осадок растворяют в 2 мл "солюбилизационного буфера". После центрифугирования отбирают 40 мкл аликвоту супернатанта и анализируют на включение радиоактивности в мембранные белки методом SDS PAGE и последующим разделением геля.

Аффинная хроматография с лектином ростков пшеницы

Супернатант, содержащий солюбилизированные мембранные белки, добавляют к 0,5 мл агарозного геля с лектином ростков пшеницы. Через 30 мин при 20°C собирают шарики посредством центрифугирования и промывают 3 раза 2 мл смеси 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/100 мМ NaCl/100 мМ маннит/1% (мас./об.) н.-октилглюкозид. Адсорбированные белки элюируют 4 порциями по 2 мл смеси 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/100 мМ NaCl/100 мМ маннит/300 мМ N-ацетил-D-глюкозамин; во всех элюатах определяют активности аминопептидазы N и сахарозо-α-глюкозидазы и из 100 мкл аликвот каждой фракции осаждают и анализируют белок методом SDS-PAGE.

Хроматография на гидроксилапатите

N-ацетилглюкозаминные элюаты из хроматографии с применением лектина из ростков пшеницы разбавляют десятикратно смесью 10 мМ натрийфосфатный буфер (pH 7,4)/1% (мас./об.) н.-октилглюкозид и вносят в колонку с гидроксилапатитом (высота 10 см, диаметр 1 см), уравновешенную смесью 10 мМ натрийфосфатный буфер (pH 7,4)/1% (мас./об.) н.-октилглюкозид с постоянной скоростью 0,25 мл/мин и собирают фракции по 1 мл. Далее элюируют белки следующим образом: 10 мл смеси 10 мМ натрийфосфатный буфер (pH 7,4)/1% (мас./об.) н.-октилглюкозид, затем градиенты фосфата: 15 мл от 10 до 250 мМ, 15 мл от 250 до 700 мМ и 10 мл от 700 до 1000 мМ фосфата. В каждой фракции определяют активность аминопептидазы N и сахарозо-α-глюкозидазы и радиоактивность. Из каждой фракции отбирают по 100 мкл и осаждают белок, затем проводят SDS-PAGE с последующим определением распределения радиоактивно меченых белков, разрезая гели на 2 мм кусочки.

Препаративный электрофорез в SDS-геле

Собирают фракции, содержащие радиоактивно меченый 145 кДа-белок, и осаждают белок смесью хлороформ/метанол. После растворения в SDS-буфере (62,5 мМ Tris/HCl (pH 6,8)/2% SDS/5% 2-меркаптоэтанол/10% глицерин/0,001% бромфеноловый синий) образец центрифугируют и вносят прозрачный супернатант в разделительный гель, препаративный 7,5% SDS-гель (диаметр 28 мм; длина разделительного геля 5 см). Проводят электрофорез при 500 В (40 мМ, 6 В) и фракционируют элюат на фракции по 1,5 мл. Для анализа состава белка методом SDS-PAGE используют аликвоты каждой фракции по 150 мкл.

Очистка 145 кДа-связующего белка для ингибиторов абсорбции холестерина методом аффинной хроматографии с применением стрептавидина/биотина

10 образцов мембранных везикул щеточной каймы подвздошной кишки кролика (200 мкг белка) инкубируют с 200 мкМ биотин-меченого ингибитора холестерина C-4 в смеси 10 мМ Tris/Hepes буфер (pH 7,4)/100 мМ NaCl/100 мМ маннит в течение 30 мин в темноте при 20°C с последующим облучением при 254 нм в течение 30 с в фотохимическом реакторе Rayonet RPR-100, оснащенном 4 лампами RPR 2537 A. После сбора везикулы промывают 3 раза 2 мл смеси Tris/Hepes буфер (pH 7,4)/300 мМ маннит. Конечный осадок суспендируют в 2 мл "солюбилизационного буфера" в течение 1 час при 4°C. После центрифугирования смешивают прозрачный супернатант с 0,5 мл шариков стрептавидин-агарозы и выдерживают с перемешиванием при 4°C в течение 2 ч. После центрифугирования шарики инкубируют с 2 мл смеси 10 мМ Tris/Hepes буфер (pH 7,4)/300 мМ маннит/1% н.-октилглюкозид/4 мМ PMCF/4 мМ иодацетамид/4 мМ EDTA в течение 10 мин при 4°C с последующим центрифугированием. После двукратного повторения данной процедуры белки элюируют из шариков стрептавидин-агарозы 3 порциями по 2 мл указанного выше буфера, содержащего 5 мМ биотин. Из всех элюатов отбирают аликвоты для определения ферментативной активности аминопептидазы N и сахарозо-α-глюкозидазы и для анализа методом SDS-PAGE. Для конечной очистки биотиновые элюаты, содержащие ковалентно-модифицированный 145 кДа-связующий белок для ингибиторов абсорбции холестерина, подвергают препаративному электрофорезу в SDS-геле, описанному выше.

Ферментативная фрагментация

145 кДа-белок, выделенный по обеим методикам, осаждают смесью хлороформ/метанол и повторно растворяют в 3 мкл смеси Tris/HCl буфер (pH 6,8)/6,2% SDS/0,5% 2-меркаптоэтанол/0,0005% бромфеноловый синий. Ферментативную фрагментацию проводят, добавляя 5 мкл свежеприготовленного раствора химотрипсина (35 нг/мл) в указанном выше буфере и инкубируя при 30°C в течение 1 час. Реакцию прекращают, добавляя SDS-буфер, содержащий 4 мМ EDTA/4 мМ PMCF/4 мМ иодацетамид, и нагревая 5 мин при 95°C с последующим SDS-PAGE в Tris/Tricine-гелях.

Электрофорез в SDS-геле

SDS-PAGE выполняют в гелях с вертикальными слоями (20 x 17 x 0,15 см), применяя систему для электрофореза LE 2/4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) c концентрациями гелей 7-10,5% при содержании акриламида 97,2% и N,N-метилен-бис-акриламида 2,8% или для аналитических целей в разработанных ранее гелях NOVEX (4-12%, 12% или 15%, Invitrogen (Groningen, The Netherlands), используя систему для электрофореза Xcell II от Novex. Электрофоретическое разделение фрагментов белков проводят в Tris/Tricine-гелях (16,5%) согласно Schaggre & Jagow. После электрофореза гели фиксируют в 12,5% трихлоруксусной кислоте, а затем окрашивают при помощи Serva Blue R 250. Для определения распределения радиоактивности индивидуальные полоски геля нарезают на кусочки по 2 мм, гидролизуют белок при помощи 250 мкл тканевого солюбилизатора Biolute S и проводят измерения в жидкостном сцинтилляционном счетчике, применяя 4 мл сцинтиллятора Quickszint 501.

Солюбилизация 145 кДа-связующего белка для ингибиторов абсорбции холестерина

Предварительным условием очистки 145 кДа-связующего белка для ингибиторов абсорбции холестерина является удовлетворительная растворимость данного целого мембранного белка в неденатурированном состоянии. Эксперименты по солюбилизации с разнообразными детергентами показывают, что фотомеченый белок может быть растворен при содержании SDS около 80-90% и Zwittergent 9-13 около 60%, тогда как с CHAPS, NP-40, дигитонином и Triton-X-114 нельзя достичь существенной растворимости. 1% растворы неионных детергентов, таких как Triton-X-100, н.-октилглюкозид, децилмальтозид, додецилмальтозид или холестеринполусукцинат/додецилмальтозид в смеси 10 мМ буфер Tris/Hepes (pH 7,4)/300 мМ маннит дают только частичную растворимость 145 кДа-белка, затрудняя тем самым его очистку. В конце концов, найдены два протокола, обеспечивающие 60-80% растворимость 145 кДа-белка и дающие возможность применять процедуру очистки: a) солюбилизация при 1% SDS с последующим разбавлением при 1% н.-октилглюкозида до начальной концентрации 0,1% SDS/1% н.-октилглюкозида; b) солюбилизация при помощи смеси 10 мМ Tris/Hepes буфер (pH 7,4)/75 мМ KCl/5 мМ MgCl₂/1 мМ EGTA/1 мМ DTT/1% Triton X-100/1% н.-октилглюкозид ("солюбилизационный буфер"). Процедура солюбилизации позволяет успешное фракционирование мембранных белков щеточной каймы методом хроматографии.

Модель биотин-меченого 2-азетидинонового фотоаффинного зонда

Для одностадийной очистки целевого белка для ингибиторов абсорбции холестерина присоединяют биотинсодержащую фотолабильную группу N-(биотинил)-4-азидофенилаланин через спейсер к пара-положению N-фенильного или бензиламинового кольца 2-азетидиноновых ингибиторов абсорбции холестерина. Соотношение структура-активность показывает, что данное положение допускает существенную химическую модификацию, сохраняя эффективность ингибирования абсорбции кишечного холестерина in vivo. После введения NMRI-мышам биотин-меченой фотоаффинной метки C-4 ингибируют абсорбцию кишечного холестерина в зависимости от дозы, показывая биологическую эффективность биотин-меченого фотолабильного ингибитора абсорбции холестерина, предварительным условием для идентификации белка(белков) является вовлечение их в абсорбцию кишечного холестерина при помощи данного зонда. Фотоаффинная маркировка BBMV тонкой кишки кроликов при помощи азидобензоил-производного [³H]C-1 в присутствии повышенных концентраций биотин-меченого ингибитора холестерина C-4 дает в результате зависящее от концентрации снижение степени маркировки 145 кДа-белка, указывая специфическое взаимодействие C-4 с 145 кДа-связующим белком для ингибиторов абсорбции холестерина в мембране щеточной каймы энтероцитов тонкой кишки.

Очистка 145 кДа-связующего белка, фотомеченого посредством тритий-меченого 2-азетидинонового ингибитора абсорбции холестерина C-1

Фотомеченый 145 кДа-связующий белок находится в диапазоне молекулярных масс, где высокообильные мембранные белки мембран щеточной каймы, подобные комплексу сахарозо-α-глюкозидазы/изомальтазы или аминопептидазе N, мигрируют в SDS-гели, делая таким образом обязательным полное отделение от данных белков для определения последовательности. Биохимическое исследование идентифицирует 145 кДа-белок как гликозилированный единый мембранный белок со сдвигом молекулярной массы от 145 кДа до 110 кДа при дегликозилировании N-гликаназой. Поэтому авторы исследовали различные лектины в качестве предполагаемых лигандов для аффинной хроматографии. При использовании агарозы с лектином ростков пшеницы достигают полного удерживания фотомеченого 145 кДа-белка, притом что элюируют 70-80% ферментативной активности сахарозо-α-глюкозидазы и аминопептидазы N. При использовании N-ацетилглюкозамина можно элюировать все количество радиоактивно меченого 145 кДа-белка вместе с 30-50% активности аминопептидазы N и сахарозо-α-глюкозидазы. Всего достигают 4-5-кратного обогащения 145 кДа-связующего белка для ингибиторов абсорбции холестерина. Произведена оценка ряда различных методик дополнительной очистки. Ионообменная хроматография на колонках Mono Q или Mono S ведет к полному отделению от сахарозо-α-глюкозидазы/изомальтазы, но только частично от аминопептидазы N, тогда как применяя металл-хелатирующюю аффинную хроматографию, не достигают четкого разделения. Хроматография на гидроксилапатите может обеспечить сильное обогащение 145 кДа-белка и отделение от сахарозо-α-глюкозидазы и аминопептидазы N. Оптимизированный профиль фосфатного градиента дает почти полное отделение 145 кДа-белка от других мембранных белков; 145 кДа-белок элюируют при высоких концентрациях фосфата и освобождают от существенных ферментативных активностей сахарозо-α-глюкозидазы или аминопептидазы N. Конечной очистки достигают методом SDS-PAGE элюатов из хроматографии на гидроксилапатите. Оценочное количество чистого 145 кДа-белка составляет 1-3% материала, внесенного в колонку с гидроксилапатитом, показывая, что достигают 150-500-кратного коэффициента обогащения относительно мембраны щеточной каймы и 2500-10000-кратного относительно общего белка энтероцитов.

Очистка 145 кДа-связующего белка для ингибиторов абсорбции холестерина методом (стрептавидин-биотин)-аффинной хроматографии после фотоаффинной маркировки биотин-меченого фотолабильного ингибитора абсорбции холестерина

BBMV тонкой кишки кроликов инкубируют с 200 нкМ C-4 и осуществляют сшивку при ультрафиолетовом облучении при 254 нм. После солюбилизации ковалентно-модифицированные белки, содержащие биотин-меченые 2-азетидиноновые ингибиторы абсорбции холестерина, экстрагируют стрептавидинсодержащими шариками. После интенсивного промывания связанные белки элюируют 10 мМ раствором биотина и анализируют методом SDS-PAGE. Стрептавидиновые шарики удерживают преимущественно один белок Mr 145 кДа, при этом, если ультрафиолетовое облучение не используют, то белки не детектируются, указывая, что 145 кДа-белок является первостепенным связующим белком для биотин-меченого фотолабильного ингибитора абсорбции холестерина C-4. Биотиновые экстракты из стрептавидиновых шариков не содержат детектируемых ферментативных активностей сахарозо-α-глюкозидазы/изомальтазы или аминопептидазы N, показывая, что элюированный 145 кДа-белок, вероятно, представляет одну единую белковую часть, модифицированную ковалентным связыванием биотин-меченого ингибитора абсорбции холестерина. Присутствие 200 нкМ других ингибиторов абсорбции холестерина, таких как эзетимиб, при фотомаркировке с применением C-4 снижает количество 145 кДа-белка, экстрагируемого стрептавидиновыми шариками, показывая прямую конкуренцию ингибиторов абсорбции холестерина с C-4 за идентично связывающие места; в противоположность этому, субстраты для других кишечных питательных переносчиков для желчных кислот, жирных кислот, глюкозы, олигопептидов или аминокислот не влияют на количество экстрагируемого 145 кДа-белка. Проведение данных экспериментов по маркировке с клеточными мембранами из различных органов показывает, что только при маркировке BBMV из тонкой кишки, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки кролика можно экстрагировать 145 кДа-белок, тогда как после маркировки BBMV из желудка, слепой кишки, ободочной кишки, прямой кишки, почки, печени или адипоцитов 145 кДа-белок не удерживается стрептавидиновыми шариками. Таким образом, можно очищать 145 кДа-связующий белок только из данных анатомических мест, где происходит абсорбция кишечного холестерина, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки. 145 кДа-белок, очищенный методом хроматографии с применением лектина пшеничных ростков и гидроксилапатита и методом стрептавидин-биотин-аффинной хроматографии, невидим в SDS-гелях. После ферментативной фрагментации химотрипсином получают почти идентичные пептидные системы с набором пептидов с молекулярной массой в диапазоне 4-35 кДа, это показывает, что 145 кДа-белки, очищенные обоими способами, являются идентичными и содержат предпочтительно, если не исключительно, только одну белковую часть.

Фиг.1: часть 1 реакционной схемы для синтеза [2-(4-азидофенил)-1-(4-{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил]фенилкарбамоил}бутилкарбамоил)этил]амида 5-(2-оксогексагидротиено[3,4-d]имидазол-6-ил)пентаноевой кислоты (14).

Фиг.2: часть 2 реакционной схемы для синтеза [2-(4-азидофенил)-1-(4-{4-[3-(3-гидрокси-3-фенилпропил)-2-(4-метоксифенил)-4-оксоазетидин-1-ил]фенилкарбамоил}бутилкарбамоил)этил]амида 5-(2-оксогексагидротиено[3,4-d]имидазол-6-ил)пентаноевой кислоты (14).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к холестеринсвязывающим белкам, и может быть использовано для выделения таких белков из кишечника. Выделяют 145 кДа-белок путем инкубации биологического материала из тканей кишечника с радиоактивно меченым фотореактивным 2-азетидиноновым соединением. Затем биологический материал солюбилизируют и удаляют клеточный дебрис, добавляют супернатант в устройство, содержащее агарозу с пектином пшеничных ростков. Полученный элюат агарозы с лектином пшеничных ростков вносят на колонку с гидроксилапатитом, после этого радиоактивно меченые фракции загружают на препаративный SDS-PAGE и собирают. Далее производят очистку полученного 145 кДа-белка. Изобретение позволяет получить белок, способный связывать холестерин и/или связывать ингибиторы поглощения холестерина. 4 н.п. ф-лы, 2 ил.

1. Очищенный 145 кДа-белок, способный связывать холестерин и/или связывать ингибиторы поглощения холестерина, полученный способом, в котором

1) получают биологический материал, выбранный из кишечной ткани, или клеток из кишечной клеточной культуры, или клеток щеточной каймы подвздошной кишки человека, крысы, мыши или кролика.

2) биологический материал из 1) инкубируют с фотореактивным 2-азетидиноновым соединением, которое является радиоактивно меченым и имеет структуру, представленную формулой I

где R выбран из одной из следующих групп а)-е):

3) биологический материал солюбилизируют и удаляют клеточный дебрис;

4) добавляют супернатант в устройство, содержащее агарозу с лектином пшеничных ростков;

5) элюат агарозы с лектином пшеничных ростков из 4) вносят на колонку с гидроксилапатитом;

6) радиоактивно меченые фракции из 5) загружают на препаративный SDS-PAGE;

7) радиоактивно меченые фракции собирают и при необходимости

осаждают.

1) получают биологический материал, выбранный из кишечной ткани, или клеток из кишечной клеточной культуры, или клеток щеточной каймы подвздошной кишки человека, крысы, мыши или кролика;

2) биологический материал из 1) инкубируют с фотореактивным 2-азетидиноновым соединением, которое является радиоактивно меченым и имеет структуру, представленную формулой I

где R выбран из одной из следующих групп а)-е):

3) биологический материал солюбилизируют и удаляют клеточный дебрис;

4) супернатант добавляют в устройство, содержащее агарозу с лектином пшеничных ростков;

5) элюат агарозы с лектином пшеничных ростков из 4) вносят на колонку с гидроксилапатитом;

6) радиоактивно меченые фракции из 5) загружают на препаративный SDS-PAGE;

7) радиоактивно меченые фракции собирают и при необходимости осаждают.

1) получают биологический материал, выбранный из кишечной ткани, или клеток из кишечной клеточной культуры, или клеток щеточной каймы подвздошной кишки человека, крысы, мыши или кролика;

2) биологический материал из 1) инкубируют с фотореактивным ингибитором захвата холестерина, который является радиоактивно меченым и имеет структуру, представленную формулой I, или который является биотин-меченым и имеет следующую структуру

3) биологический материал из 2) солюбилизируют и удаляют клеточный дебрис;

4) супернатант добавляют в стрептавидин-агарозу;

5) элюат добавляют в SDS-PAGE;

6) белки, соответствующие диапазону размеров 140-150 кДа, удаляют, элюируют и при необходимости подвергают повторной укладке.

1) получают биологический материал, выбранный из кишечной ткани, или клеток из кишечной клеточной культуры, или клеток щеточной каймы подвздошной кишки человека, крысы, мыши или кролика, который содержит указанный очищенный 145 кДа-белок;

2) предоставляют соединение;

3) осуществляют взаимодействие очищенного 145 кДа-белка из 1) и соединения из 2);

4) определяют количество холестерина, захваченного биологическим материалом из 3);

5) результат из 4) сравнивают с результатами контрольного эксперимента, в котором определяют захват холестерина биологическим материалом, который имеет такую же видовую и/или тканевую специфичность как очищенный 145 кДа-белок из 1), но не приведен в контакт с соединением из 2);

6) результаты из 5) в случае пониженного захвата холестерина клетками, которые приведены в контакт с соединением из 2), определяют соединение, ингибирующее вторичный захват холестерина.