СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭКЗОЛЕКТИНОВ ИЗ ГРИБА-БАЗИДИОМИЦЕТА Российский патент 2009 года по МПК C12N1/14 A23J3/20 

Изобретение относится к микробиологии, микологии и аналитической биохимии и может быть использовано для выделения внеклеточных белков-лектинов из жидких сред культивирования высших грибов-базидиомицетов. Выделенные белки могут быть использованы при проведении научных и прикладных исследований в области биохимии, энзимологии и иммунологии, а также в технологии производства средств медицинской диагностики, лечебных препаратов.

Известен способ выделения внутриклеточного лектина (эндолектина) из высшего гриба Lentinus edodes, или шиитаке, заключающийся в экстракции плодовых тел 0,15 М хлористым натрием с последующим отделением жидкости от грибной биомассы (плодовых тел) центрифугированием, осаждением супернатанта сульфатом аммония с 80%-ным насыщением, отделением полученного осадка, диализом против 25 мМ трис-солянокислого буфера с рН 7,4 до получения прозрачного супернатанта (неочищенных лектинов). Затем полученный раствор подвергают градиентному элюированию в два этапа: сначала на носителе DEAE Sephadex A-50, затем на носителе Hydroxyapatite phosphate, конечным продуктом которого является внутриклеточный лектин (Jeune K.H., Moon I.J., Kim M.K., Chung S.R. Studies on lectins from Korean higher fungi; IV. A mitogenic lectin from the mushroom Lentinus edodes // Planta Med. 1990. V.56. P.592).

Однако полученный по данной технологии лектин характеризуется недостаточно высокой удельной активностью. Кроме того, данный способ предполагает использование плодовых тел гриба Lentinus edodes для получения исходного неочищенного солевого экстракта, которые выращивают в течение длительного времени по трудоемкой технологии, что существенно удорожает технологию получения лектина.

Известен способ выделения внутриклеточного лектина шиитаке, предполагающий использование плодовых тел в качестве сырья для получения исходного неочищенного раствора лектина. Способ заключается в экстракции массы гриба водным буфером, осаждении полученного экстракта сульфатом аммония, отделении полученного осадка центрифугированием, который затем очищают в два этапа: с помощью гель-фильтрации на носителе Sephadex G-100 и аффинной хроматографии на носителе N-acetylgalactosamineagarose (Wang H.X., Ng T.B., Ooi V.E.C. Studies on purification of a lectin from fruiting bodies of the edible shiitake mushroom Lentinus edodes // Intern. J. Biochem. Cell Biol. 1999. V.31, N 5. P.595-599).

Данный способ предполагает получение более качественного препарата лектина по сравнению с предыдущим способом. Однако данная технология также характеризуется высокой себестоимостью из-за использования дорогостоящих плодовых тел гриба в качестве сырья и необходимостью применения для окончательной очистки лектина аффинной хроматографии на механически непрочном и дорогостоящем носителе агарозной природы.

Наиболее близким к заявляемому является способ выделения внутриклеточных лектинов из грибов-базидиомицетов, заключающийся в получении экстрактов из глубинного мицелия грибных культур. Способ заключается в выращивании мицелия грибов методом погруженного культивирования, отделении и промывке мицелия от жидких питательных сред, высушивании при 60°С до постоянной массы, измельчении высушенного мицелия с последующей трехкратной экстракцией водой. Полученный объединенный экстракт доводят до рН 7,0, центрифугируют, супернатант лиофилизуют, сухой остаток растворяют в буфере, а раствор подвергают диализу и центрифугируют при 27000g на холоду в течение 20 мин (Banerjee P.С., Ghosh A.K., Sengupta S. Hemagglutinating activity in extracts of mycelia from submerged mushroom cultures // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V.44. P.1009-1011).

Однако полученный по данной технологии белок характеризуется недостаточной степенью очистки, неопределенными в этой связи физико-химическими характеристиками, что, безусловно, не позволяет его использовать как готовый препарат.

Задачей изобретения является получение экзолектина, сохраняющего высокую биологическую активность в процессе выделения из культуральной жидкости, характеризующегося высокой степенью чистоты при сокращении времени и снижении себестоимости его получения.

Технический результат заключается в получении нового препарата, обладающего высокой биологической активностью и устойчивостью при хранении.

Поставленная задача решается тем, что способ выделения экзолектинов из гриба-базидиомицета Lentinus edodes предусматривает выращивание мицелия гриба на жидкой питательной среде, в качестве которой используют водный раствор с растворенными веществами, представляющими собой источник углерода, источник азота и соль меди (II) в следующих концентрациях: источник углерода 200-400 мМ, источник азота - 15-30 мМ, соль меди (II) - 0,5-2 мМ, фильтрацию, упаривание фильтрата культуральной жидкости до остаточного количества 0,03-0,10 первоначального объема, с последующим осаждением белков агентом, в качестве которого используют ацетон при соотношении ацетона к остаточному количеству фильтрата (2-2,5):1, а отделенный белковый осадок растворяют в минимальном количестве воды и подвергают процессу гель-хроматографии. Выращивание мицелия гриба на жидкой питательной среде проводят в течение 14-21 суток при температуре 25-28°С. В качестве источника углерода используют D-глюкозу, или L-арабинозу, или D-галактозу, или D-лактозу. В качестве источника азота используют L-аспарагин. Надосадочную жидкость упаривают до удаления ацетона и подвергают процессу гель-хроматографии.

Белок, полученный заявленным способом, является новым, поскольку из уровня техники не известен препарат, полученный выделением внеклеточных лектинов грибов-базидиомицетов.

Выделенный по заявляемой технологии внеклеточный лектин Lentinus edodes в концентрированном водном растворе обладает титром гемагглютинации порядка 2×10⁴, на основании чего следует говорить о высокой лектиновой активности. Кроме того, препараты, полученные по заявляемой технологии, действительно устойчивы при хранении, поскольку лектиновая активность сохраняется на неизменном уровне в течение нескольких месяцев при температуре не выше 4°С. Внеклеточный лектин (L2) - протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 кДа. L2 содержит в своем составе (90,3±1,0) % (m/m) углеводов, представленных глюкозой (73% общей массы углеводной части молекулы лектина) и галактозой (27% общей массы углеводной части молекулы лектина). Определен аминокислотный состав белка. В L2 высоко содержание Asn: 42% (m/m) от суммы аминокислот. Этот факт наряду с составом углеводной части молекулы (Glc+Gal) позволяет отнести L2 к N-аспарагинсвязанным белкам. Спектр ЯМР ¹Н образца не противоречит возможности наличия в его составе углеводных и α-аминокислотных звеньев, то есть протеогликановой природе L2.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят глубинное культивирование гриба-базидиомицета, в качестве питательной среды используют водный раствор, содержащий источник углерода, источник азота и соль меди (II). Таким образом, получают культуральную жидкость - источник грибного лектина. Культуральную жидкость отделяют от глубинного мицелия фильтрованием, упаривают, добавляют ацетон и выдерживают упаренный фильтрат с ацетоном до визуально полного выпадения белкового осадка. Осадок отделяют от надосадочной жидкости (супернатанта) и растворяют в минимальном количестве воды. Из супернатанта удаляют ацетон в токе теплого воздуха. Получают неочищенные растворы, содержащие грибной лектин, которые затем подвергают процессу гель-хроматографии. Водный раствор лектина пропускают через колонку (1,7×9 см) с Sephadex G-25, элюент вода. Выход белковых фракций регистрируют при 280 нм. Активную по гемагглютинации фракцию подвергают гель-фильтрации на колонке (1,5×43 см) с Sephadex G-75, уравновешенной 0,1 М NaCl. Обессоленный водный раствор концентрируют.

Пример. Выращивали культуру Lentinus edodes (шиитаке) на чашках Петри с агаризованным пивным суслом (3-4 градуса по Баллингу), рН 6-6,5. Температура 26°С. После полного зарастания чашек Петри блоки агаризованной среды с культурой шиитаке использовали в качестве инокулята жидкой питательной среды - водного раствора с растворенными веществами, представляющими собой источник углерода, источник азота и соль меди (II). Источником углерода служила D-глюкоза в концентрации 300 мМ по углероду, источником азота - L-аспарагин в концентрации 20 мМ по азоту, концентрация CuSO₄·5H₂O составляла 1 мМ. Инкубировали в термостате при 27°С градусах в течение 14 суток. Культуральную жидкость Lentinus edodes, полученную таким образом, отделяли от глубинного мицелия фильтрованием, фильтрат упаривали до остаточного количества 0,03-0,10 первоначального объема при температуре 30°С. К выпаренному фильтрату добавляли ацетон марки «осч», соблюдая соотношение объемов 1:2 соответственно, и выдерживали при 4°С в течение нескольких суток (до визуально полного выпадения белкового осадка). Осадок отделяли от супернатанта, растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды. Из супернатанта удаляли ацетон в токе теплого воздуха при температуре 30°С. Полученные таким образом неочищенные концентрированные водные растворы лектина шиитаке подвергали дальнейшей очистке методом гель-хроматографии до получения препарата лектина. Водный раствор лектина пропускают через колонку (1,7×9 см) с Sephadex G-25, элюент вода. Выход белковых фракций регистрируют при 280 нм. Активную по гемагглютинации фракцию подвергают гель-фильтрации на колонке (1,5×43 см) с Sephadex G-75, уравновешенной 0,1 М NaCl. Обессоленный водный раствор концентрируют.

Использование соли меди (II) в качестве добавки к питательной среде - источнику внеклеточных лектинов позволило оптимизировать процессы культивирования гриба-базидиомицета на питательной среде с целью получения грибной субстанции и выделения белка из грибной субстанции в виде неочищенного раствора, содержащего грибной лектин. При этом эффективность процессов была достигнута при использовании в качестве компонентов жидкой питательной среды, наряду с источником углерода и источником азота, соли меди (II) в определенных, экспериментально подобранных, интервалах концентраций.

Были испытаны составы питательных сред с разными концентрациями Cu²⁺, D-глюкозы, или L-арабинозы, или D-галактозы, или D-лактозы, а также L-аспарагина. Одновременно определяли один из важнейших параметров, характеризующих эффективность процедуры выделения и очистки целевого белка - удельную лектиновую активность, достигаемую в культуральной жидкости при используемых концентрациях перечисленных соединений. Наилучший результат получался при концентрации ионов меди (II) в синтетической среде культивирования Lentinus edodes - 1 мМ, D-глюкозы - 300 мМ по углероду, L-аспарагина - 20 мМ по азоту, при этом достигалось 8-кратное увеличение удельной лектиновой активности культуральной жидкости. Более низкие концентрации меди из приведенного выше интервала значений малодейственны, а более высокие характеризуются значительным количеством мешающего гель-хроматографическому процессу нерастворимого ни в воде, ни в ацетоне осадка. Гель-хроматограммы полученных реакционных смесей показали, что, в отличие от значительно увеличенной степени осаждения искомого белка-лектина (судя по интенсивности поглощения при 280 нм, в 7,5 раз по сравнению с контролем - реакционной смесью при отсутствии катионов меди), картина для супернатантов оставалась практически неизменной, и их гель-хроматограммы мало отличались. На основании проведенных исследований был сделан вывод об улучшении параметров разделения белков и увеличении продукции внеклеточного лектина Lentinus edodes при использовании катиона меди в качестве добавки к синтетической питательной среде.

Предлагаемый способ позволил оптимизировать первый этап выделения в индивидуальном состоянии двух внеклеточных лектинов базидиомицета в связи с усилением биосинтеза лектинов в присутствии меди (II) и/или участием меди (II) в дифференциации белков культуральной жидкости на стадии получения ацетонового осадка белковой природы, а также участием иона меди в образовании комплексов с лектинами, отличающихся по хроматографическим свойствам. Отделенная осаждением часть культуральной жидкости характеризовалась значительно увеличенным количеством лектина L2. Кроме того, способ обеспечивает мягкое воздействие на белки, не нарушающее структуру биологически активных лектинов.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выделения внеклеточных белков-лектинов из жидких сред культивирования высших грибов-базидиомицетов. Способ предусматривает выращивание гриба-базидиомицета Lentinus edodes на питательной среде, в качестве которой используют водный раствор, содержащий источник углерода, азота и соль меди (II). При этом источником углерода служила D-глюкоза, или L-арабиноза, или D-галактоза, или D-лактоза. Источником азота - L-аспарагин. Выращивание мицелия осуществляли в течение 14-21 суток при температуре 25-28°С. После чего полученную таким образом культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием. Полученный фильтрат упаривают до остаточного количества 0,03-0,10 первоначального объема. К выпаренному фильтрату добавляют ацетон при соотношении ацетона к остаточному количеству фильтрата (2-2,5):1 и выдерживают при температуре 4°С до визуально полного выпадения белкового осадка. Отделяют осадок от супернатанта и растворяют в минимальном количестве воды. Из супернатанта удаляют ацетон в токе теплого воздуха при температуре 30°С. После чего полученные водные растворы подвергали гель-хроматографии до получения препарата лектина. Изобретение позволяет получить новый препарат, обладающего высокой биологической активностью и устойчивостью при хранении. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ выделения экзолектинов из гриба-базидиомицета Lentinus edodes, предусматривающий выращивание мицелия гриба на жидкой питательной среде, в качестве которой используют водный раствор с растворенными веществами, представляющими собой источник углерода, источник азота и соль меди(II) в следующих концентрациях: источник углерода 200-400 мМ, источник азота 15-30 мМ, соль меди(II) 0,5-2 мМ, фильтрацию, упаривание фильтрата культуральной жидкости до остаточного количества 0,03-0,10 первоначального объема с последующим осаждением белков агентом, в качестве которого используют ацетон при соотношении ацетона к остаточному количеству фильтрата (2-2,5) : 1, а отделенный белковый осадок растворяют в минимальном количестве воды и подвергают процессу гель-хроматографии.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выращивание мицелия гриба на жидкой питательной среде проводят в течение 14-21 сут при температуре 25-28°С.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют D-глюкозу, или L-арабинозу, или D-галактозу, или D-лактозу.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника азота используют L-аспарагин.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что надосадочную жидкость упаривают до удаления ацетона и подвергают процессу гель-хроматографии.