СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АНТИГЕННОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ БИОМАТЕРИАЛА Российский патент 2003 года по МПК A61K41/00 A61K39/00 C12N5/06 

Изобретение относится к способам повышения антигенности и иммуногенности биоматериала и предназначено для использования в биологии и медицине, в частности для диагностики и иммунотерапии инфекционных заболеваний и солидных опухолей.

Путем модификации биоматериала можно повысить его антигенность и иммуногенность. Антигенность - способность антигенов взаимодействовать со свободными антителами, клеточными рецепторами и другими эффекторами иммунного ответа. Иммуногенность - способность антигенов вызывать иммунный ответ. В основе иммунодиагностики опухолей лежит наличие у раковых клеток "опухолевых антигенов". Они подразделяются на специфические антигены, которые экспрессируются только в клетках опухолей, и опухоль-ассоциированные антигены, которые могут быть как у опухолевых клеток, так и у нормальных клеток при определенных условиях. Например, "онкофетальные" антигены, которые отсутствуют у нормальных зрелых клеток, но могут появляться во время эмбриогенеза и при малигнизации клеток. Специфические антигены являются онкомаркерами, выявляются только у определенных гистологических типов опухолей и применяются для их диагностики. Опухоль-ассоциированные антигены, например карциноэмбриональный антиген (СЕА) и альфа-фетопротеин, выявляются у различных типов опухолей и могут применяться для их скрининговой диагностики, так как обладают "перекрестной реактивностью". Опухолевые антигены вызывают активацию клеточного иммунитета путем сенсибилизации Т-лимфоцитов (клеток-эффекторов), которая осуществляется с помощью антигенпредставляющих клеток (АПК) - Лангерганса, дендритных клеток и макрофагов. Взаимодействие молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности АПК с целевым антигеном необходимо для его представления системе иммунного надзора организма. Гидрофильные группы расположены на наружной поверхности клеточной мембраны, а гидрофобные - на внутренней и скрыты от окружающей клетку водной фазы. Повышение гидрофобности белков наружной поверхности клеточной мембраны изменяет их антигенность [1] и иммуногенность, что способствует представлению целевых антигенов клеточных мембран системе Т-клеток-эффекторов с помощью АПК [2, 3].

Известно, что ряд инфекционных антигенов и опухолевые клетки являются слабо иммуногенными или неиммуногенными и не способны вызвать эффективный защитный иммунный ответ. Это способствует развитию персистирующих инфекций или прогрессированию опухолевого процесса и обосновывает необходимость повышения иммуногенности клеток.

Известен способ повышения антигенности биоматериала путем их химической модификации, состоящий в обработке клеток нуклеофильными соединениями, например производными хлор (фтор) бензола (фенола). Такая обработка приводит к существенному изменению содержания гидрофильных кластеров и молекул МНС на наружной поверхности клеточной мембраны, а также антигенного состава и иммуногенности мембранных белков [4]. Установлено, что при химической модификации нормальных клеток нуклеофильными соединениями - динитрохлорбензолом, динитрофторбензолом (ДНХБ, ДНФБ) изменения гидрофобности клеточной мембраны и конформации белков приводят к изменению антигенного репертуара клеточной поверхности и появлению на ней новых структур, имеющих общие антигенные детерминанты с опухолевыми антигенами (онкомаркерами). На наружной поверхности клеточных мембран появляются антигены, имитирующие опухолевые антигены. Неоантиген, полученный при химической модификации нормальных клеток, представляет собой антиген клеточной поверхности, имитирующий различные опухолевые антигены. Он может использоваться для диагностики опухолей путем определения реактивности сенсибилизированных к опухолевому антигену лимфоцитов. Он обладает в 200-500 раз большей способностью выявлять сенсибилизированные лимфоциты (антигенностью) в сравнении с немодифицированным антигеном из мембран клеток опухоли, полученных из операционного материала (по данным исследований in vitro). Сенсибилизация лимфоцитов может определяться по результатам измерения реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), реакции бласттранформации лимфоцитов (РБТЛ), определению цитотоксичности лимфоцитов в различных разведениях с клетками-мишенями и др. Выявление Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к имитирующему опухолевые антигену, свидетельствует о наличии опухоли. В практической медицине широкое применение получил тест РТМЛ. Сенсибилизированные лимфоциты в присутствии специфического антигена выделяют цитокины, которые подавляют миграцию лейкоцитов в капилляре. При отсутствии сенсибилизированных лимфоцитов или антигена в исследуемой суспензии клеток торможения миграции лейкоцитов не наступает.

Однако этот способ повышения антигенности производит отрицательный побочный эффект, выражающийся в канцерогенности самих нуклеофильных соединений.

Известен способ повышения антигенности и иммуногенности биоматериала путем его модификации, состоящий в модификации белков клеточных мембран под влиянием биологических (вирусов Sindbis, Newcastle; биополимеров - гидрофобных, гидрофильных и др. ) [5, 6, 7] и химических факторов (ДНХБ, ДНФБ, производных акридина и др.) [8, 9], что может приводить к изменению их антигенного состава - "ксеногенизации" клеток [10].

Однако эти способы имеют большой недостаток, состоящий в биоповреждающем действии вирусов и биополимеров и канцерогенном действии химических материалов.

Известен также способ повышения антигенности и иммуногенности биоматериала путем его физической модификации высоким гидростатическим давлением. При этом способе высокое давление (1200-1500 атм) в течение 15-30 мин действует на белки мембран клеток бактерий и опухолей, что приводит к перераспределению пептидов наружной поверхности клеток в иммуногенные кластеры и повышению экспрессии молекул МНС на поверхности клеток (на 40-1700%, сохраняется более 96 ч) [11, 12]. Модифицированные высоким давлением клетки становятся сильными стимуляторами иммунного ответа в результате изменения состава и свойств антигенов клеточной поверхности. Так, например введение кроликам антигенов бактерии (Leptospira interrogans), модифицированной высоким давлением, вызывает образование высокого титра антител (1:2048), что свидетельствует о значительном повышении их иммуногенности [13]. Иммунизация модифицированными гидростатическим давлением опухолевыми антигенами приводила к развитию выраженной реакции гиперчувствительности замедленного типа и стимуляции секреции цитокинов лимфоцитами, развитию противоопухолевого иммунного ответа у экспериментальных животных [14, 15]. Иммуногенные свойства антигенов, модифицированных гидростатическим давлением, усиливаются при их обработке N-ацетил-цистеином и цитокинами - интерфероном, TNF [16, 17].

Однако способ модификации высоким гидростатическим давлением является технически сложным, требует уникального дорогостоящего физического оборудования и обладает низкой производительностью.

Заявляемое изобретение решает задачу увеличения производительности процесса повышения антигенности и иммуногенности биоматериала и упрощения его технической реализации.

Сущность изобретения состоит в способе повышении антигенности и иммуногенности биоматериала путем его физической модификации, в котором модификацию осуществляют излучением лазера. В качестве биоматериала используют рекомбинантные или синтетические белки, или клеточные мембраны, или вирусы, или бактерии, или хламидии, а в качестве белков или мембран - нормальные зрелые клетки человека, в частности фибробласты кожи или лейкоциты из крови человека, а также эмбриональные клетки от человека, или птиц, или земноводных, или хордовых, или иглокожих. При модификации вирусов, бактерий или хламидий используют рекомбинантные или синтетические антигенные структуры из них. При модификации биоматериала он может вводиться в суспензию, на поверхность которой подают излучение лазера. В частном случае суспензию подают в зону облучения в виде сплошной или капельной струи, излучение лазера имеет длину волны от 9 до 11 мкм, плотность мощности находится в диапазоне 0,1-1,0 кВт/см², струя имеет диаметр 0,5-15 мм, а скорость истечения струи 0,05 м/с до 10 м/с. Иммуногенность целевого антигена может быть увеличена дополнительно путем его введения в антигенпредставляющие клетки, которые в свою очередь активируются белками теплового шока. В частном случае синтез белков теплового шока осуществляют путем лазерного облучения живых клеток с длиной волны от 0,5 до 1,5 мкм.

Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, состоит в повышении энергии, вкладываемой в модифицируемый биоматериал. Это позволяет значительно упростить техническую реализацию и повысить производительность процесса до коммерчески приемлемого уровня. Так, на модельной установке, созданной авторами, достижима производительность до 2 т обрабатываемого материала при полуторасменной работе, что в десятки и сотни раз превышает возможную производительность дорогих установок сверхвысокого давления. Авторами выявлены изменения антигенности и иммуногенности рекомбинантных и синтетических белков или мембран клеток путем их физической модификации лазерным излучением. Подобраны параметры лазерного излучения, которые вызывают слияние клеток, приводят к их агрегации в "гигантские клетки" (фиг. 1). Авторы полагают наличие трех основных механизмов обнаруженного увеличения антигенности и иммунногенности. Во-первых, иммуногенность антигенов мембран клеток-мишеней повышается при увеличении их поверхности. Во-вторых, антигены на поверхности клеточных мембран могут быть экранированы блокирующими факторами, например антителами. Поэтому они не распознаются системой Т-клеточного иммунобиологического надзора. При взаимодействии мощного инфракрасного лазерного излучения с содержащей биоматериал водной средой происходит испарение ее молекул, в результате чего образуются кавитационные пузырьки. Коллабирование пузырьков происходит со скоростью 300-1000 м/с и сопровождается образованием ударной волны по типу "теплового взрыва" с акустическим эффектом. "Молекулярное сотрясение" мембранных структур клетки при взаимодействии с полем ударной волны, формирующейся при лазерном облучении, способствует освобождению их от экранирующих блокирующих факторов и экспозиции целевого антигенного репертуара клеток-мишеней с последующим возникновением сенсибилизированных к целевым антигенам популяции цитотоксических Т-лимфоцитов. В-третьих, действие ударной волны вызывает развертывание глобулярных структур белков и биомембран, что приводит к выходу гидрофобных участков на их наружную поверхность. Конформационные изменения фиксируются в результате взаимодействия с "активными" кластерными структурами воды, которые образуются из ее макромолекулы в результате разрыва внутримолекулярных и межмолекулярных "водородных" связей при воздействии ударной волны. Кластерные структуры воды взаимодействуют с гидрофобными участками мембран клеток и белков, что способствует возникновению их функционально активных межмолекулярных структур. Стабилизация конформационных перестроек макромолекул с помощью кластерных структур молекул воды способствует активации "участков связывания" и взаимодействию антител и антигенов, повышению их иммуногенности.

Имитирующий опухолевые антигены эпитоп наружной поверхности клеточных мембран используется для диагностики солидных опухолей путем выявления сенсибилизированных к опухолевым антигенам лимфоцитов у больных онкопатологией с использованием реакции торможения миграции лейкоцитов и (или) кожных тестов гиперчувствительности замедленного типа.

Имитирующий опухолевые антигены эпитоп наружной поверхности клеточных мембран используется для иммунотерапии онкологических заболеваний путем введения его в антигенпредставляющие (дендритные) клетки in vitro с последующей их внутрикожной или подкожной инъекцией больному.

Имитирующий опухолевые антигены эпитоп наружной поверхности клеточных мембран используется для иммунотерапии онкологических заболеваний путем предактивации антигенпредставляющих клеток кожи (клеток Лангерганса) in vivo с помощью лазерного излучения и (или) ДНХБ (ДНФБ) с последующим внутрикожным введением антигена.

Изобретение поясняется графическими изображениями, где на фиг.1 представлена микрофотография уже упомянутого процесса слияния клеток и образования "гигантской клетки" при лазерном облучении биоматериала, в табл.1 приведена сравнительная характеристика антигенности онкомаркеров и опухольимитирующих эмбриональных антигенов у больных с онкопатологией. В табл.2 приведена динамика выявления положительных реакций торможения миграции лейкоцитов с HBsAg и ПЦР с ДНК гепатита В среди контактных лиц. В табл.3 приведена динамика выявления вируснейтрализующих антител у больных с энтеровирусной инфекцией (КОКСАКИ-В5) в реакции непрямого иммунофлюоресцентного анализа. В табл.4 дана оценка иммуногенности золотистого стафиллококка при модификации его лазерным излучением, в табл.5 - оценка иммуногенности поверхностного HBS-Ag по данным изменений показателей гуморального и клеточного иммунитета при профилактической вакцинации, а в табл.6 - оценка иммуногенности поверхностного HBS-Ag по данным изменений показателей клеточного иммунитета при лечебной вакцинации больных гепатитом В. На фиг.2 приведена функциональная схема примера реализации предлагаемого способа.

Из табл. 1 следует, что наибольшей антигенностью обладает модифицированный лазерным излучением эмбриональный антиген из мембранной фракции икры морских ежей. Он может применяться для скрининговой диагностики онкопатологии, особенно ее ранних стадий. Клинический пример: Больной А., 38 лет, находился в стационаре по поводу язвенной болезни желудка. РТМЛ с онкомаркерами - карциноэмбриональным антигеном, СА19-9, альфафетопротеином, СА19-9, ПСА - проба отрицательная. РТМЛ с онкофетальными антигенами из куриного эмбриона, модифицированными ДНХБ и вирусом Sendai, а также с модифицированным лазером эмбриональными антигенами из клеточных мембран икры морских ежей - проба положительная. Произведена гастроскопия - язва угла желудка диаметром 3,5 см, хронический гастрит с атрофией слизистой. При гистологическом исследовании биоптатов данных за опухолевый рост нет. Повторная гастроскопия через 3 недели - язва уменьшилась до 1,5 см, данных за опухолевый рост не получено. Гистологическое исследование биоптатов, полученных при повторной гастроскопии, выявило наличие низкодифференцированной аденокарциномы. Послеоперационный диагноз - рак желудка II стадии. Таким образом, тест РТМЛ с модифицированными лазером эмбриональным антигеном из мембранной фракции икры морских ежей является чувствительным методом дифференциальной диагностики рака и неопухолевых заболеваний, в частности в ранних стадиях этого заболевания (I-II ст.).

Методом иммуноферментного анализа и электрохемиолюминесценции установлено наличие общих антигенных детерминант у модифицированной лазером мембранной фракции икры морских ежей и известных онкомаркеров (СЕА, альфафетопротеина, СА19-9, СА72-4, МСА, НСЕ, СА-125, ХГ, ПСА). Наличие "перекрестной реактивности" с различными специфическими опухолевыми антигенами (онкомаркерами) у модифицированных лазером эмбриональных антигенов из икры морских ежей указывает на возможность их применения для скрининговой диагностики различных типов опухолей с последующим углубленным обследованием для выявления их локализации, морфологических исследований и последующего лечения. Из данных табл.2 следует, что модифицированный лазерным излучением поверхностный антиген гепатита В обладает выраженной антигенностью и выявляет даже незначительные изменения клеточного иммунитета (по данным РТМЛ) при инфицировании вирусом гепатита В. Вирус гепатита В обладает слабой антигенностью и иммуногенностью и не вызывает у инфицированных лиц сенсибилизации клеток-эффекторов, достаточной для элиминации вируса, что приводит к его персистенции в организме. Тест с модифицированным лазером поверхностным антигеном гепатита В позволяет выявить сенсибилизированные к этому вирусу Т-лимфоциты, иногда даже при отсутствии репликации вируса (по данным ПЦР-диагностики). Чувствительность диагностического теста с модифицированным антигеном гепатита В не уступает ПЦР-диагностике гепатита В, а по своей экономической эффективности в несколько раз превышает ее. Динамика показателей иммунофлюоресценции (табл.3) отражает повышение антигенных свойств вируса Коксаки при его модификации лазерным излучением, что указывает на перспективность его применения в иммунодиагностике этого заболевания, при персистирующих и латентных формах его течения. Из данных табл.4 следует, что модификация лазерным излучением антигена из мембранной фракции золотистого стафилококка повышает его иммуногенность более чем в 500 раз. Из данных табл.5 следует, что лазерная модификация HBs-Ag приводит к повышению иммуногенности профилактической вакцины по данным показателей клеточного и гуморального иммунитета. Эти свойства могут быть использованы для повышения эффективности вакцинации в группах риска. Из данных табл.6 видно, что у больных активным хроническим гепатитом В применение аутовакцины на основе дендритных клеток, примированных HbsAg, а также вакцины на основе модифицированного лазером HbsAg с предактивацией антигенпредставляющих клеток Лангерганса кожи in vivo путем индукции образования белков теплового шока излучением лазера с активными средами на парах меди приводило к активации показателей клеточного иммунитета (по данным РТМЛ с поверхностным антигеном гепатита В), которые нарушены при данном заболевании. Это способствует элиминации инфекционного антигена и ускорению наступления ремиссии заболевания. Терапевтическую аутовакцину для лечения гепатита В получали путем инкубации моноцитов аутокрови больных в присутствии гранулоцит-макрофаг колонийстимулирующего фактора - лейкомакс (GM-CSF) в сочетании с интерлейкином-IV (IL-4) в течение 5-7 суток с целью получения дендритных клеток с последующим введением в них целевых антигенов (HbsAg) путем электропорации. Полученную вакцину на основе активированных дендритных клеток вводили внутрикожно 1-2 раза в неделю в течение месяца. Другим путем получения терапевтической вакцины для лечения гепатита В является предактивация антигенпредставляющих клеток эпидермиса кожи - клеток Лангерганса - путем индукции белков теплового шока (БТШ) в коже излучением лазера, например лазера с активными средами на парах меди, с последующим введением внутрикожно целевого антигена (HbsAg). У 11 больных активным хроническим гепатитом В с пониженными показателями клеточного иммунитета применили вакцину с дендритными клетками, примированными HbsAg, в дозе 20 мкг внутрикожно 1 раз в неделю в течение 3 месяцев, причем у 6 из них применялся HbsAg, модифицированный лазерным излучением. У 16 больных была применена схема, включающая внутрикожное введение HbsAg с предактивацией антигенпредставляющих клеток Лангерганса эпидермиса кожи in vivo индуктором БТШ - излучением лазера (лазера с активными средами на парах меди - длина волны 512 и 578 нм, плотность мощности излучения- 0,8-1,3 Вт/см², экспозиция 180 с на зону). Антиген вводили внутрикожно 1 раз в неделю в течение 3 месяцев, причем в 7 случаях из 16 использовали модифицированный лазером HbsAg. Динамическое наблюдение в течение более 6 месяцев показало стойкий эффект при использовании модифицированного лазерным излучением HbsAg в обеих группах больных (как при активации дендритных клеток in vitro, так и in vivo). В контрольной группе, получавшей традиционную терапию, положительный эффект отмечался у 4 из 11 больных. Эффективность современных методов лечения хронического гепатита В (сочетание интерферона с рибавирином, ламивудином, интерлейкинами (IL-1, IL-2, IL-12), тимозином, антителами-Гепатект, вакцинами с антигеном, сорбированным на гидроокиси алюминия) не превышает 40%. Это обусловлено нарушением презентации вирусного антигена дендритными клетками и снижением количества и функциональной активности цитотоксических лимфоцитов. Применение вакцины с антигеном, сорбированным на гидроокиси алюминия, приводит к активации гуморального, а не клеточного иммунитета, а в элиминации вирусов существенную роль играет система Т-клеточного иммунитета. Ее активация с использованием аутовакцин на основе дендритных клеток, примированных модифицированным лазерным излучением целевыми антигенами, позволит значительно улучшить результаты лечения хронического гепатита В.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Лазерное излучение с длиной волны 9-11 мкм и плотностью мощности 0,1-1,0 кВт/см² фокусируется на поверхности специально сформированной струи диаметром 0,5-15 мм, содержащей суспензию с биоматериалом, со скоростью истечения от 0,05 м/с до 10 м/с. В качестве биоматериала предлагается использовать рекомбинантные и синтетические белки или клеточные мембраны, вирусы, бактерии или хламидии. В качестве белков или мембран предлагается использовать нормальные зрелые клетки человека, в частности фибробласты кожи или лейкоциты из крови человека, а также эмбриональные клетки от человека, или птиц, или земноводных, или хордовых, или иглокожих. При модификации вирусов, бактерий или хламидий предлагается использовать антигенные структуры из них. Иммуногенность целевого антигена может быть увеличена дополнительно путем его введения в антигенпредставляющие клетки, которые в свою очередь активируются белками теплового шока. В частном случае синтез белков теплового шока осуществляют путем лазерного облучения живых клеток с длиной волны от 0,5 до 1,5 мкм.

В примере реализации способа (фиг.8) выходящий из СО₂-лазера 1 луч (с длиной волны 10,6 мкм) транспортируется к фокусирующему устройству 2, которое фокусирует его на текущей в поперечном направлении струе обрабатываемого материала в пятно с плотностью мощности, регулируемой в диапазоне 0,1-1 кВт/см². Для контроля над процессом часть излучения (до 10% мощности) с помощью плоскопараллельной пластинки 3 ответвляется на датчик мощности излучения 4. В устройстве формирования струи 5 с помощью профилированного сопла-конфузора создаются необходимые параметры (диаметр - 0,7 мм и скорость истечения - 5 м/с) сплошной или капельной струи суспензии мембранной фракции икры морских ежей. В зоне взаимодействия 6 происходит повышение антигенности и иммуногенности исходного биоматериала, и он поступает в сборник 7. Для визуального контроля над процессом взаимодействия луч He-Ne лазера 8, сформированный коллиматором 9, проецируется на экран 10. Часть излучения, прошедшая через или мимо струи, поглощается в поглотителе 11. Массовый состав веществ анализируется методами жидкостной или газовой хроматографии, а биологические испытания выполняются в лабораторных и клинических условиях.

Изобретение относится к области медицины и касается способов повышения антигенности и иммуногенности биоматериала. Сущность изобретения включает способ повышения антигенности и/или иммуногенности биоматериала путем воздействия на него излучения лазера с длиной волны от 9 до 11 мкм и плотностью мощности 0,1-1,0 кВт/см², при этом биоматериалом являются рекомбинантные или синтетические елки, или клеточные мембраны, или вирусы, или бактерии, или хламидии, или нормальные зрелые клетки человека, или эмбриональные клетки. Изобретение также включает способ повышения антигенности и/или иммуногенности биоматериала путем его физической модификации in vivo излучением лазера клеток эпидермиса кожи. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа. 2 с. и 14 з.п.ф-лы, 2 ил., 6 табл.

1. Способ повышения антигенности и/или иммуногенности биоматериала путем его физической модификации, отличающийся тем, что модификацию осуществляют излучением лазера с длиной волны от 9 до 11 мкм и плотностью мощности 0,1-1,0 кВт/см². 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биоматериалом являются рекомбинантные или синтетические белки, или клеточные мембраны. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что биоматериалом являются вирусы или бактерии, или хламидии. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что модифицируют нормальные зрелые клетки человека. 5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что модифицируют эмбриональные клетки. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что модифицируют фибробласты кожи или лейкоциты из крови человека. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что эмбриональные клетки получают от человека или птиц, или земноводных, или хордовых, или иглокожих. 8. Способ по п.3, отличающийся тем, что модифицируют рекомбинантные или синтетические антигенные структуры вирусов или бактерий, или хламидий. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что биоматериал вводят в суспензию. 10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что излучение лазера подают на поверхность суспензии. 11. Способ по п.9, отличающийся тем, что суспензию подают в зону лазерного воздействия в виде сплошной или капельной струи. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что струя имеет диаметр 0,5-15 мм. 13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что скорость истечения струи составляет от 0,05 до 10 м/с. 14. Способ повышения антигенности и/или иммуногенности биоматериала путем его физической модификации, отличающийся тем, что физическую модификацию in vivo осуществляют излучением лазера клеток эпидермиса кожи. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что лазерное излучение имеет длину волны от 0,5 до 1,5 мкм. 16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что лазерное излучение имеет среднюю плотность мощности 0,1-10 Вт/см².