Способ ингибирования метастазирования опухолей путем подавления дедифференцировки опухолевых клеток Российский патент 2025 года по МПК C12N15/11 A61K48/00 A61P35/02 

Изобретение относится к медицине, к онкологии, а именно к противоопухолевой терапии, и направлено на ингибирование формирования вторичных опухолевых узлов (метастазов) за счет введения в организм молекул, которые могут являться химическими ингибиторами, природными молекулами или их синтетическими аналогами, в том числе микроРНК мимиками, в том числе содержащими в своей структуре химически-модифицированные нуклеотиды, или их смеси, которые блокируют процесс дедифференцировки дифференцированных опухолевых клеток во вторичном очаге за счет подавления экспрессии генов стволовости и ключевых сигнальных путей стволовой пластичности опухолевых клеток.

В 90% случаев причиной смерти от онкологических заболеваний является развитие метастазов, которые поражают жизненно-важные органы [1]. В настоящее время для предотвращения и лечения метастатической болезни используют химические соединения и биомолекулы, которые либо уничтожают опухолевые клетки, либо тормозят их инвазию, миграцию, пролиферацию и выход клеток микрометастазов из спящего состояния. Основным методом торможения развития метастатической болезни является адъювантная (послеоперационная) химио- и/или таргетная терапия, которая, тем не менее, при подавляющем большинстве локализаций не позволяет добиться существенного увеличения выживаемости, поскольку не направлена напрямую на ингибирование механизмов метастазирования опухоли и, в большинстве случаев, может способствовать уничтожению только отдельных высокочувствительных клонов опухолевых клеток во внутренних органах.

Другим подходом к ингибированию метастазирования является использование молекул, влияющих на ангиогенез в опухоли. Так, например, известно моноклональное антитело против сосудисто-эндотелиального фактора роста - бевацизумаб, которое одобрено для терапии первой линии метастазов рака молочной железы в комбинации с цитостатиками. Однако, согласно клиническим данным, несмотря на увеличение безрецидивного периода у пациенток (на 1-2 месяца), увеличения общей выживаемости не наблюдается. Более того, отмечены случаи, когда антиангиогенная лекарственная терапия приводила к ускорению роста опухоли и озлокачествлению ее фенотипа после прекращения лечения [2]. Необходимо отметить, что данная терапия направлена на этап роста макрометастазов, не влияет на сам процесс перехода микрометастазов в макрометастазы, и соответственно, не предотвращает развитие метастатической болезни, а связана с ее лечением. Известна противораковая композиция, содержащая микроРНК-125, для ингибирования ангиогенеза [3]. Авторы предполагают, что данная композиция может способствовать подавлению метастазирования за счет способности микроРНК-125 снижать секрецию сосудисто-эндотелиального фактора роста и, как следствие, подавлять инвазию опухолевых клеток. Однако в данном патенте авторы не представили данные о метастазировании опухолей после введения препарата.

Описан подход к предотвращению развития метастатической болезни с использованием ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ММП), регулирующих способность опухолевых клеток к инвазии [4]. Недостатком данного подхода является то, что их использование у пациентов во II и III стадиях клинических испытаний не продемонстрировало эффективность и характеризовалось серьезными побочными эффектами [5]. Кроме того, на момент постановки диагноза микрометастазы уже сформировались у пациентов и находятся в дормантном (спящем) состоянии.

Известна фармацевтическая композиция на основе микроРНК для лечения рака, включающая одну или несколько микроРНК (3670, 8078, 4477a) [6]. Использование данных микроРНК приводит к ингибированию пролиферации и индукции апоптоза опухолевых клеток линии NCI-H460 (карцинома легких). Однако данных об антиметастатическом потенциале данной композиции in vivo авторами патента представлено не было. Кроме того, механизм действия препарата основан на элиминации опухолевых клеток, однако клетки микрометастазов находятся в дормантном состоянии, то есть они не пролиферируют и, соответственно, не будут подвергаться апоптозу.

В патенте [7] продемонстрирована возможность использования микроРНК-340 для терапии колоректального рака, а также для подавления метастатического процесса (преимущественно в печень). В данном случае эффект обусловлен восполнением пула противоопухолевой микроРНК-340, концентрация которой часто снижена при колоректальном раке. Ограничение данного способа обусловлено тем, что использование микроРНК-340 в качестве антиметастатического препарата целесообразно только при снижении уровня экспрессии данной микроРНК в клетках колоректального рака, мигрировавших в костный мозг.

Недостатком перечисленных выше подходов является то, что диссеминация опухолевых клеток происходит уже на ранних этапах развития опухолевого процесса, как правило, еще до обнаружения первичного очага и постановки диагноза [8]. Согласно современным представлениям, раковая клетка, вышедшая из первичного очага в кровеносное русло и проникшая в отдаленные ткани и органы (вторичный опухолевый очаг), проходит мезенхимально-эпителиальный переход, после чего становится дормантной (спящей). В этом состоянии она, в качестве микрометастаза, способна достаточно долго находиться в ткани/органе, никак себя не проявляя [9]. В то же время, под действием микроокружения, продуцирующего ряд факторов, например, таких как IL-6, IL-8, IL-11 TGFβ, происходит процесс дедифференцировки, приводящий к переходу дорматной клетки в подобную стволовой, которая способна пролиферировать, и, как следствие, давать начало макрометастазу - формировать вторичный опухолевый очаг.

Известен способ предотвращения метастазов за счет ингибирования формирования преметастатических ниш. Для этого предложено использовать молекулы/препараты, влияющие: на рекрутирование прометастатических иммунных клеток, регуляцию иммуносупрессорных клеток, микроокружение преметастатических ниш, циркулирующие опухолевые клетки и колонизацию во вторичном опухолевом очаге [10]. Между тем, большинство исследований в данном направлении находятся на этапе доклинических исследований.

Наиболее перспективным подходом к предотвращению развития метастатической болезни является воздействие на раковую клетку с целью подавления развития метастаза во вторичном органе. Это может быть реализовано за счет: ингибирования мезенхмально-эпителиального перехода, ингибирования аутофагии при нахождении клеток в дормантном состоянии, пролонгации дормантного состояния, блокировании дедифференцировки опухолевых клеток [8, 11, 12]

Известен способ предотвращения развития метастатаза за счет ингибирования аутофагии - введение гидроксихлорохина с 2-дезоксиглюкозой ингибирует аутофагию и подавляет метастазирование в легкие и печень на модели ксенотрансплантанта рака молочной железы у мышей [13]. В клиническом исследовании NCT01894633 показано, что комбинированная терапия рака молочной железы за счет введения хлорохина в сочетании с лучевой терапией улучшает выживаемость пациенток без прогрессирования метастазов в головной мозг по сравнению с контрольной группой (83,9% и 53,1% соответственно) [14]. К недостаткам данного подхода относится то, что хлорохин плохо проникает внутрь клеток при низких значениях рН, характерных для многих солидных опухолей [15], а также обладает широким спектром побочных эффектов при длительном использовании [16].

Наиболее близким к настоящему изобретению является способ предотвращения метастазирования, заключающийся в пролонгации дормантного состояния опухолевых клеток - микрометастазов. Для этого используют ингибиторы WNT-сигналинга, такие как вантиктумаб, ипафрицепт и розамантузумаб. Данные препараты, ингибирующие путь Wnt на уровне взаимодействия лиганд/рецептор, вышли на I стадию клинических испытаний. Серьезным недостатком данного подхода является то, что побочные эффекты терапии привели к прекращению исследований. Известен препарат Foxy-5 (пептид, имитирующий Wnt5a), способный влиять на неканонический путь Wnt, подавляя миграцию, адгезию и метастазирование рака молочной железы. Препарат успешно прошел I фазу клинических испытаний, в настоящее время идет набор для проведения II фазы. Ограничением данного способа лечения является то, что препарат используется в составе комбинированной терапии - хирургического вмешательства, облучения и химиотерапии [17], кроме того, имеет выраженную токсичность, а пролонгация дормантного состояния предполагает длительную терапию, которую пациент может не перенести.

Технической задачей настоящего изобретения является предотвращение развития метастазов, т.е. роста вторичного опухолевого узла. Этот результат достигается за счет блокирования дедифференцировки дифференцированных опухолевых клеток, находящихся в составе микрометастазов.

Поставленная задача решается тем, что внутривенно вводят молекулы, ингибирующие гены стволовой пластичности в раковых клетках, что предотвращает переход микрометастаза в макрометастаз во вторичном опухолевом очаге.

Сущность изобретения поясняется фигурами.

На фиг. 1 представлены результаты подсчета количества и определения среднего диаметра маммосфер, образуемых клетками линии T47D без добавления ингибиторов (Контроль), при добавлении ингибитора 93 нМ BIBR1532, 64 мкМ 10058-F4, 5 мкМ FLI-6 или смеси всех трех ингибиторов (n=3).

На фиг. 2 представлены результаты подсчета количества и определения среднего диаметра маммосфер, образуемых CD44 популяцией клеток линии T47D без добавления ингибиторов (Контроль), при добавлении ингибитора 93 нМ BIBR1532, 64 мкМ 10058-F4, 5 мкМ FLI-6 или смеси всех трех ингибиторов (n=3).

На фиг. 3 представлены данные изменения экспрессии генов стволовости под действием смеси трех ингибиторов.

На фиг. 4 представлены результаты подсчета среднего количества метастазов в группах животных после введения ингибиторов.

На фиг. 5 представлены результаты подсчета средней площади метастазов в группах животных после введения ингибиторов.

На фиг. 6 представлены расчеты индекса ингибирования метастазирования и индекса торможения роста метастазов в группах животных после введения ингибиторов.

На фиг. 7 приведен список генов стволовости и уровень их экспрессии в клетках линии T47D при обработке микроРНК miR-195-5р, miR-520a или miR-630 в концентрации 50 нМ. Примечание: МФ - метафектен.

На фиг. 8 представлены результаты транскриптомного анализа CD44^- клеток линии T47D без и после обработки смесью микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 в концентрации 50 нМ.

На фиг. 9 представлены результаты подсчета количества и определения среднего диаметра маммосфер, образуемых CD44^- популяцией клеток линии T47D при обработке смесью miR-195-5р/miR-520a/miR-630.

На фиг. 10 представлены результаты подсчета количества и определения среднего диаметра маммосфер, образуемых CD44^- популяцией клеток линии ВТ474 при обработке смесью микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630.

На фиг. 11 представлены результаты подсчета количества и определения среднего диаметра маммосфер, образуемых CD44^- клетками линии T47D при добавлении смеси химически-модифицированных микроРНК мимиков miR-195-5р/miR-520a/miR-630.

На фиг. 12 приведена динамика роста ксенографта опухоли у мышей NOD.SCID (n=2) при введении клеток линии T47D, предобработанных смесью микроРНК (miR-195-5р/miR-520a/miR-630) в концентрации 50 нМ.

На фиг. 13 приведена динамика роста ксенографта опухоли у мышей NOD.SCID (n=2) при введении клеток линии ВТ474, предобработанных смесью микроРНК (miR-195-5р/miR-520a/miR-630) в концентрации 50 нМ.

На фиг. 14 показаны результаты измерения площади субплевральных метастазов у мышей C57BL/6 с карциномой Льюиса с внутривенным введением физиологического раствора (контроль) и смеси микроРНК (miR-195-5р/miR-520a/miR-630) в липосомальной форме.

На фиг. 15 показаны результаты подсчета количества субплевральных метастазов у мышей C57BL/6 с карциномой Льюиса с внутривенным введением физиологического раствора (контроль) и смеси микроРНК (miR-195-5р/miR-520a/miR-630) в липосомальной форме.

На фиг. 16 представлены данные расчета индекса торможения роста метастазов и ингибирования метастазирования у мышей C57BL/6 с карциномой Льюиса с внутривенным введением физиологического раствора (контроль) и смеси микроРНК (miR-195-5р/miR-520a/miR-630) в липосомальной форме.

Принципиальным отличием настоящего изобретения от существующих способов является то, что для предотвращения развития метастазов используется ингибирование процесса дедифференцировки дифференцированных опухолевых клеток во вторичном очаге при помощи молекул и/или их смесей. Данными молекулами могут является природные или синтетические молекулы, включая химические ингибиторы, микроРНК, в том числе микроРНК мимики, в том числе содержащие в своей структуре химически-модифицированные нуклеотиды.

Пример осуществления изобретения

Пример 1. Подавление дедифференцировки опухолевых клеток и их способности давать начало росту опухолевого узла с использованием химических ингибиторов дедифференцировки опухолевых клеток

Клетки линии T47D (люминальный рак молочной железы типа А) культивируют в полной питательной среде RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Великобритания), глутамина (Gibco, Великобритания), антибиотика-антимикотика (Sigma, США) (ППС RPMI-1640) до достижения 70-80% конфлюентности. Клетки снимают с поверхности пластика с использованием аккутазы (Stemcell Technologies, США). Часть клеток отбирают для оценки влияния ингибиторов на общий пул клеток линии T47D, остальные используют для выделения CD44^- популяции, для этого клетки окрашивают флуоресцентно-меченными антителами FITC-anti-human CD44 (clone BJ18, Sony, США) и отбирают фракцию CD44^- на клеточном сортере SH800 (Sony, США). Для оценки способности к образованию маммосфер 1 тыс. клеток в 1 мл среды Mammocult Basal Medium (Stemcell Technologies, Канада) с добавлением 10% Mammocult proliferation supplement (Stemcell Technologies, Канада), 4 мкг/мл гепарина (Sigma, США), 0,48 мкг/мл гидрокортизона (Stemcell Technologies, Канада), антибиотика-антимикотика (Sigma, США) рассаживают в лунки 12-луночного планшета. Дно лунок планшета предварительно покрывают 1% агарозой (Хеликон, Россия) для уменьшения адгезии клеток к пластику. Для получения одноклеточной суспензии клетки предварительно пропускают через клеточное сито с размером пор 40 мкм (Corning). Эксперимент выполняют в трех биологических повторах. Для индукции дедифференцировки в экспериментальные лунки добавляют 50 нг/мл IL6 (Abcam, США). Также в ряд лунок добавляют один из ингибиторов - BIBR1532 (Sigma, США), 10058-F4 (Sigma, США), FLI-06 (Sigma, США), в концентрациях, эквивалентных их IC50 (BIBR1532 - 93 нМ, 10058-F4 - 64 мкМ, FLI-6 - 5 мкМ), или их смесь в концентрациях, эквивалентных их IC50. В качестве контроля клетки в лунках инкубируют с добавлением DMSO (вещество, в котором растворяют ингибиторы). Планшеты инкубируют в СО₂-инкубаторе в течение 7 дней, после чего получают фотографии всех лунок с использованием сканирующего микроскопа Leica DMi8 (Leica, Германия). Количество и диаметр маммосфер определяют с использованием программного обеспечения ImageJ методом, предложенным Vlachou и коллегами с модификациями [18]. Наличие в лунках сфероидов - образований сферической или близкой к сферической формы диаметром более 50 мкм - указывает на способность клеток к дедифференцировке. Снижение количества образующихся маммосфер и/или их диаметра указывает на подавление процесса дедифференцировки опухолевых клеток и их способности давать начало росту опухолевого узла (фиг. 1, фиг. 2).

Пример 2. Подавление экспрессии генов стволовости в опухолевых клетках с использованием ингибиторов

Клетки линии T47D (люминальный рак молочной железы типа А) культивируют в полной питательной среде RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Великобритания), глутамина (Gibco, Великобритания), антибиотика-антимикотика (Sigma, США) (ППС RPMI-1640) до достижения 70-80% конфлюентности. Клетки снимают с поверхности пластика с использованием аккутазы (Stemcell Technologies, США). Часть клеток отбирают для оценки влияния ингибиторов на общий пул клеток линии T47D, остальные используют для выделения CD44^- популяции, для этого клетки окрашивают флуоресцентно-меченными антителами FITC-anti-human CD44 (clone BJ18, Sony, США) и отбирают фракцию CD44^- на клеточном сортере SH800 (Sony, США). Для анализа транскриптома 20 тыс. клеток рассаживают в лунки 6-луночного планшета, предварительно покрытого 1% агарозой (Хеликон, Россия), в 2 мл среды Mammocult Basal Medium (Stemcell Technologies, Канада) с добавлением 10% Mammocult proliferation supplement (Stemcell Technologies, Канада), 4 мкг/мл гепарина (Sigma, США), 0,48 мкг/мл гидрокортизона (Stemcell Technologies, Канада), антибиотика-антимикотика (Gibco, Великобритания). Для индукции дедифференцировки в экспериментальные лунки добавляют 50 нг/мл IL6 (Abcam, США). Также в ряд лунок добавляют один из ингибиторов - BIBR1532 (Sigma, США), 10058-F4 (Sigma, США), FLI-06 (Sigma, США), в концентрациях, эквивалентных их IC50 (BIBR1532 - 93 нМ, 10058-F4 - 64 мкМ, FLI-6 - 5 мкМ), или их смесь в концентрациях, эквивалентных их IC50. В качестве контроля клетки в лунках инкубируют с добавлением DMSO (вещество, в котором растворяют ингибиторы). Через 24 часа клетки снимают с поверхности пластика с использованием TrypLE (Gibco, США), центрифугируют и к осадку добавляют RNALater (Qiagen, Германия). Тотальную РНК из опухолевых клеток выделяют с помощью набора RNeasy mini Kit Plus (Qiagen, Германия), в состав которого включена ДНКаза для деградации остаточных количеств ДНК. Качество РНК оценивают при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США), RIN (RNA integrity number - показатель целостности РНК) составляет 8,0-9,6. Количество РНК оценивают при помощи наборов Qubit. Для анализа экспрессии генов стволовости используют микроматрицу Clarium S (Affymetrix, США).

Воздействие трех ингибиторов на CD44^- клетки линии T47D приводит к снижению экспрессии ключевых генов стволовости TERT, BMI1, CDK6, MYC, FZD9, NOTCH1, определяющих дедифференцировку, и повышению экспрессии генов KLF5, KLF6 и SOX2 (фиг. 3).

Пример 3. Подавление дедифференцировки опухолевых клеток и их способности давать начало легочным метастазам с использованием ингибиторов в экспериментах in vivo

Клетки LLC (карцинома легких Льюиса) рассаживают в лунки 6-луночного планшета в полной питательной среде DMEM/F12 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Великобритания), глутамина (Gibco, Великобритания), антибиотика-антимикотика (Gibco, Великобритания) (ППС DMEM/F12). В лунки добавляют один из ингибиторов - BIBR1532 (Sigma, США), 10058-F4 (Sigma, США), FLI-06 (Sigma, США), в концентрациях, эквивалентных их IC50 (BIBR1532 - 93 нМ, 10058-F4 - 64 мкМ, FLI-6 - 5 мкМ), или их смесь в концентрациях, эквивалентных их IC50. В качестве контроля клетки в лунках инкубируют с добавлением DMSO (вещество, в котором растворяют ингибиторы). Через 24 часа клетки снимают с поверхности пластика с использованием TrypLE (Gibco, США).

Пятьсот тысяч клеток вводят мышам линии С57Bl/6 внутрибрюшино. Через 7 дней животных выводят из эксперимента, извлекают легкие и подсчитывают количество метастазов. Рассчитывают индексы ингибирования метастазирования (ИИМ) и торможения роста метастазов (ТРМ) по формулам (1, 2):

, (1)

где А - среднее количество метастазов, В - доля животных с метастазами, соответственно в контрольной (к) и опытной (о) группах.

, (2)

где Scon - средняя площадь метастазов в контрольной группе, мм², Sexp - площадь метастазов у животных опытной группы, мм².

Показано, что ингибиторы значительно снижают количество метастазов (фиг. 4), среднюю площадь метастазов (фиг. 5) и частоту метастазирования (фиг. 6). Наибольшее снижение отмечали при использовании одновременно трех ингибиторов. При этом ИИМ и ТРМ приближается к 100%. Частота метастазирования в контроле составила 100%, в группе FLI-06 - 60%, в группах 10058-F4 и BIBR-1535 - 30% и при использовании всех трех ингибиторов - 20%. Таким образом, ингибиторы генов стволовости предотвращают развитие метастазов в легких и тормозят их рост in vivo.

Пример 4. Получение микроРНК мимиков

РНК-олигонуклеотиды SEQ ID NO 1-9 синтезируют стандартным химическим путем. Для проведения работ с РНК-олигонуклеотидами и приготовления буферов используют воду и реагенты, свободные от нуклеаз. Лиофилизированные РНК-олигонуклеотиды в конечной концентрации 20 мкМ смешивают попарно в 100 мкл гибридизационного буфера (50 мМ Трис-HCl, 250 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, рН 7.5), а именно для получения мимика:

miR-195-5: р смешивают РНК-олигонуклеотиды SEQ ID NO 1 с SEQ ID NO 4 или для получения модифицированного РНК мимика с SEQ ID NO 7;

miR-520a: смешивают РНК-олигонуклеотиды SEQ ID NO 2 с SEQ ID NO 5 или для получения модифицированного РНК мимика с SEQ ID NO 8;

miR-630: смешивают РНК-олигонуклеотиды SEQ ID NO 3 с SEQ ID NO 6 или для получения модифицированного РНК мимика с SEQ ID NO 9.

Смесь помещают в термоциклер и инкубируют 2 минуты при 94°С, далее смесь остужают со скоростью 5°С/минуту, аликвотируют и хранят при -80°С.

Пример 5. Подавление экспрессии генов стволовости в опухолевых клетках с использованием микроРНК

Клетки линии T47D (люминальный рак молочной железы типа А) и BT474 (люминальный рак молочной железы типа В) культивируют в полной питательной среде RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Великобритания), глутамина (Gibco, Великобритания), антибиотика-антимикотика (Gibco, Великобритания) (ППС RPMI-1640) до достижения 70-80% конфлюентности. Клетки снимают с поверхности пластика с использованием TrypLE (Gibco, США). Далее проводят трансфекцию клеток мимиками микроРНК, таргетированными к генам стволовой пластичности: miR 195-5р (к гену TERT), miR 630 (к гену OCT4), miR 520a (к гену FZD9) в концентрации 50 нМ с использованием метафектена (Biontex, Германия) в ППС RPMI-1640. Через 24 часа проводят замену среды, еще через 48 часов снимают клетки с поверхности пластика с использованием TrypLE (Gibco, США) и проводят оценку экспрессии генов стволовой пластичности в клетках.

Тотальную РНК из клеточных культур выделяют с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНКазу I, в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и чистоту выделения РНК оценивают на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, США). Концентрация РНК должна составлять от 15 до 150 нг/мкл, при А260/А280 = 1,65 - 1,95; А260/А230 = 1,80 - 1,95. Целостность РНК оценивают при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США) и набора R6K ScreenTape. RIN должен составлять 6,8 - 9,0.

Уровень экспрессии генов TERT (5p15.33); OCT4 (6p21.33); SMO (7q32.1); SNAI2 (8q11.21); MYC (8q24.21); TGFBR1 (9q22.33); KLF4 (9q31.2); BMI1 (10p12.2); VIM (10p13); FLT3 (13q12.2); SMAD2 (18q21.1); KLF1 (19p13.13); MOB3B (9p21.2); LAT (16p11.2); LMNB3; SOX2 (3q26.33) оценивают при помощи обратно-транскриптазной количественной ПЦР в режиме реального времени (qPCR) с оригинальными праймерами и зондами по технологии TaqMan (Table S2) на амплификаторе Rotor-Gene-6000 (Corbett Research Pty Ltd., Австралия). Для получения кДНК на матрице мРНК проводят реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAid™ (Thermo Fisher Scientific, США) со случайными гексануклеотидными праймерами в соответствии с инструкцией к набору. ПЦР ставят в трех репликах в объеме 15 мкл, содержащем 250 мкM dNTPs (Sibenzyme, Россия), 300 нM прямого и обратного праймеров, 200 нM зонда, 2.5 мM MgCl2, 19 SE buffer (67 мM Tris-HCl pH 8,8 при 25°C, 16.6 мM(NH4)2SO4, 0,01 % Tween-20), 2,5 ед. HotStart Taq polymerase (Sibenzyme, Россия) и 50 нг кДНК. Проводят амплификацию по двухшаговой программе: 1 цикл - 94°С, 10 мин - предварительная денатурация; 40 циклов - 1 шаг 94°С, 10 сек. и 2 шаг 20 сек. - при температуре 60°С. В качестве гена-рефери используют: GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase) и ACTB (actin beta), уровень экспрессии генов нормализуют по отношению к экспрессии генов-рефери. В качестве калибратора используют РНК, выделенную из интактной клеточной культуры без добавления метафектена. Уровень экспрессии измеряют в условных единицах. Относительную экспрессию оценивают с помощью метода Pfaffl по следующей формуле (3) для определения отношения экспрессии между образцом и калибратором:

, (3)

где Е - эффективность реакции;

Ct - пороговый цикл генов мишеней (target) и гена-реферри (ref);

ΔCt, target(calibrator-test) = Ct гена мишени в калибраторе минус Ct гена мишени в опытном образце;

ΔCt, ref(calibrator-test) = Ct гена-рефери в калибраторе минус Ct гена-рефери в опытном образце.

Оценивают различия в экспрессии генов OCT4, SMO, MYC, SNAI2, MOB3B, KLF4, BMI1, VIM, FLT3, LAT, SMAD2, LMNB3, SOX2, TERT, TGFB1, TGFBR1, MOB3B относительно GAPDH и ACTB и интактной культуры клеток.

Показано, что в клетках линий T47D и ВТ474 микроРНК miR 195-5р, miR 520a и miR 630 оказывают специфичное ингибирующее действие на гены-мишени: TERT, FZD9, OCT4 соответственно (фиг. 7). Помимо специфичного подавления экспрессии генов стволовости, микроРНК проявляли и неспецифичное ингибирующее действие на гены стволовости, к которым они не были таргетированы.

Пример 6. Подавление экспрессии генов стволовости и ключевых путей стволовой пластичности опухолевых клеток с использованием смеси микроРНК

Клетки линии T47D (люминальный рак молочной железы типа А) и BT474 (люминальный рак молочной железы типа В) культивируют в полной питательной среде RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Великобритания), глутамина (Gibco, Великобритания), антибиотика-антимикотика (Sigma, США) (ППС RPMI-1640) до достижения 70-80% конфлюентности. Клетки снимают с поверхности пластика с использованием аккутазы (Stemcell Technologies, США). Клетки окрашивают флуоресцентно-меченными антителами FITC-anti-human CD44 (clone BJ18, Sony, США) и отбирают фракцию CD44 на клеточном сортере SH800 (Sony, США). Далее проводят трансфекцию клеток смесью мимиков микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 в концентрациях 25 нМ и 50 нМ с использованием метафектена (Biontex, Германия) в ППС RPMI-1640. Для индукции дедифференцировки к клеткам добавляют IL-6 (Abcam, США) в конечной концентрации 50 нг/мл. Через 24 часа проводят замену среды, еще через 24 часа снимают клетки с поверхности пластика с использованием TrypLE (Gibco, США) и проводят оценку экспрессии генов стволовой пластичности в клетках, анализ транскриптома, определяют способность образования маммосфер, а также способность давать начало росту опухолевого узла in vivo.

Тотальную РНК из клеточных культур выделяют с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНКазу I, в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и чистоту выделения РНК оценивают на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, США). Концентрация РНК должна составлять от 15 до 150 нг/мкл, при А260/А280 = 1,65 - 1,95; А260/А230 = 1,80 - 1,95. Целостность РНК оценивают при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США) и набора R6K ScreenTape. RIN должен составлять 6.8-9,0.

Полный транскриптомный микрочиповый анализ проводят с использованием человеческой платформы Clariom™ S Assay (Affymetrix, США). Для обработки результатов микрочипа (анализ ДЭГ, включая построение тепловых карт и определение сигнальных путей) используют программное обеспечение Transcriptome Analysis Console (TAC) (версия 4.0). Порог ДЭГ устанавливают на значение p <0,05 (кратность изменения: > 2 или <-2). Анализ ANOVA, скорректированный eBayes, используют для идентификации ДЭГ. Анализ eBayes корректирует дисперсию анализа ANOVA с помощью эмпирического байесовского подхода, который использует информацию из всех наборов тестов для получения улучшенной оценки дисперсии. Набор зондов считают выраженным, если 50 % образцов в наборе данных имеют значения DABG (обнаруженные выше фона) ниже порога DABG. Порог DABG установливают на 0,05, а порог положительного/отрицательного AUC должен быть >0,7.

Внесение смеси микроРНК вызывает подавление генов стволовой пластичности и ключевых сигнальных путей каскада пластичности (фиг. 8). Смесь микроРНК в концентрации 50 нМ ингибирует 3605 (86,62%) и активирует - 557 (13,38%) генов в дифференцированных CD44 опухолевых клетках линии T47D. Топ-10 дифференциально экспрессированных генов (ДЭГ), ингибированных в клетках после воздействия смеси микроРНК: GPSM2, C10orf107, PSRC1, MFSD10, C4orf48, NDE1; MIR484, HIST1H2AM; HIST1H3J, CEP19, RCC2. Эти гены, в основном, связаны с клеточным циклом. Топ-10 up-регулированных ДЭГ: ISG15, OAS1, IFIT3, IFIT1, IFNL1, OAS2, MX1, IFI6, IFI27, IFNB1 - все эти гены связаны с системой интерферона и деградацией вирусной РНК в клетках. FoldChange этих генов колеблется от 76 до 728. Среди 43 генов стволовости дифференциально ингибированными оказываются 20 генов, активированными только 3 гена. Снижается экспрессия всех известных маркеров стволовых клеток опухоли молочной железы: CD44, ALDH1A1, CD24, ABCG2, ST8SIA1. Из 114 онкогенов (по базе KEGG) - 31 ингибированы (MYC, PIM1, NRAS, KRAS, MET, PIK3CA, FGFR2 и др.) и 1 активирован (VHL). Для сигнальных путей, связанных с канцерогенезом и прогрессией опухоли: VEGRA-VEGFR signaling pathway - 108 генов ингибировано, 14 активировано, Malignant signaling pathway - 84 гена ингибировано, 13 активировано, PI3K-AKT1-mTOR signaling pathway - 60 генов ингибировано, только 7 активировано, Cell cycle - 44 генa ингибировано и 3 активировано, EGF/EGFR signaling pathway - 66 гена ингибировано и 6 активировано, TGF-beta signaling pathway - 34 гена ингибировано и 2 активировано.

Пример 7. Подавление дедифференцировки опухолевых клеток и их способности давать начало росту опухолевого узла с использованием смеси микроРНК in vitro

Для оценки способности к образованию маммосфер 1 тыс. клеток в 1 мл среды Mammocult Basal Medium (Stemcell Technologies, Канада) с добавлением 10% Mammocult proliferation supplement (Stemcell Technologies, Канада), 4 мкг/мл гепарина (Sigma, США), 0,48 мкг/мл гидрокортизона (Stemcell Technologies, Канада), антибиотика-антимикотика (Sigma, США) рассаживают в лунки 12-луночного планшета. Дно лунок планшета предварительно покрывают 1% агарозой (Хеликон, Россия) для уменьшения адгезии клеток к пластику. Для получения одноклеточной суспензии клетки предварительно пропускают через клеточное сито с размером пор 40 мкм (Corning). Эксперимент выполняют в трех биологических повторах. Планшеты инкубируют в СО₂-инкубаторе в течение 7 дней, после чего получают фотографии всех лунок с использованием сканирующего микроскопа Leica DMi8 (Leica, Германия). Количество и диаметр маммосфер определяют с использованием программного обеспечения ImageJ. Наличие в лунках сфероидов - образований сферической или близкой к сферической формы диаметром более 50 мкм - указывает на способность клеток к дедифференцировке и способность давать начало росту опухолевого узла.

Добавление смеси микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 в концентрациях 25 нМ и 50 нМ приводит к снижению способности клеток линии T47D к образованию маммосфер и в концентрации 50 нМ - к снижению их среднего диаметра (фиг. 9).

Добавление смеси микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 в концентрации 50 нМ снижает способность клеток линии BT474 к образованию маммосфер (фиг. 10).

Пример 8. Подавление дедифференцировки опухолевых клеток и их способности давать начало росту опухолевого узла с использованием смеси химически-модифицированных микроРНК in vitro

Клетки линии T47D (люминальный рак молочной железы типа А) культивируют в полной питательной среде RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Великобритания), глутамина (Gibco, Великобритания), антибиотика-антимикотика (Sigma, США) (ППС RPMI-1640) до достижения 70-80% конфлюентности. Клетки снимают с поверхности пластика с использованием аккутазы (Stemcell Technologies, США). Клетки окрашивают флуоресцентно-меченными антителами FITC-anti-human CD44 (clone BJ18, Sony, США) и отбирают фракцию CD44 на клеточном сортере SH800 (Sony, США). Далее клетки рассаживают в планшеты в ППС RPMI-1640 и добавляют смесь химически модифицированных мимиков miR-195-5р/miR-520a/miR-630 в концентрациях 25 нМ и 50 нМ. Для индукции дедифференцировки к клеткам добавляют IL-6 (Abcam, США) в конечной концентрации 50 нг/мл. Через 24 часа проводят замену среды, еще через 24 часа снимают клетки с поверхности пластика с использованием TrypLE (Gibco, США), после чего проводят оценку способности клеток к образованию маммосфер. Для этого 1 тыс. клеток в 1 мл среды Mammocult Basal Medium (Stemcell Technologies, Канада) с добавлением 10% Mammocult proliferation supplement (Stemcell Technologies, Канада), 4 мкг/мл гепарина (Sigma, США), 0,48 мкг/мл гидрокортизона (Stemcell Technologies, Канада), антибиотика-антимикотика (Sigma, США) рассаживают в лунки 12-луночного планшета. Дно лунок планшета предварительно покрывают 1% агарозой (Хеликон, Россия) для уменьшения адгезии клеток к пластику. Для получения одноклеточной суспензии клетки предварительно пропускают через клеточное сито с размером пор 40 мкм (Corning). Эксперимент выполняют в трех биологических повторах. Планшеты инкубируют в СО₂-инкубаторе в течение 7 дней, после чего получают фотографии всех лунок с использованием сканирующего микроскопа Leica DMi8 (Leica, Германия). Количество и диаметр маммосфер определяют с использованием программного обеспечения ImageJ. Наличие в лунках сфероидов - образований сферической или близкой к сферической формы диаметром более 50 мкм - указывает на способность клеток к дедифференцировке.

Культивировании клеток линии T47D с химически модифицированными мимиками miR-195-5р/miR-520a/miR-630 приводит к снижению количества образующихся маммосфер (фиг. 11).

Пример 9. Подавление дедифференцировки опухолевых клеток и их способности давать начало росту опухолевого узла с использованием микроРНК in vivo

Способность опухолевых клеток давать начало росту опухолевого узла in vivo оценивают на модели ксенографтов у мышей NOD.SCID с предварительно вшитой эстрадиоловой капсулой. Клетки линии T47D и BT474 снимают с поверхности пластика с использованием аккутазы (Stemcell Technologies, США). Клетки окрашивают флуоресцентно-меченными антителами FITC-anti-human CD44 (clone BJ18, Sony, США) и отбирают фракцию CD44 на клеточном сортере SH800 (Sony, США). Далее проводят трансфекцию смесью мимиков микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 (смесь 2) в концентрации 50 нМ, с использованием метафектена (Biontex, Германия) в ППС RPMI-1640. Для индукции дедифференцировки к клеткам добавляют IL-6 (Abcam, США) в конечной концентрации 50 нг/мл. Через 24 часа клетки снимают с поверхности пластика с использованием TrypLE (Gibco, США), после чего суспензию клеток в середе RPMI-1640 смешивают с матригелем (Corning, USA) в соотношении 1:1 (vol.:vol.) и вводят 0,5 млн клеток подкожно в область 4 молочной железы мыши линии NOD.SCID. Размер опухолевого узла (мм²) 2 раза в неделю измеряют с использованием штангенциркуля и рассчитывают объем по формуле (4):

0,5×1×w, (4)

где l - длинна, мм;

w - ширина, мм.

Обработка дифференцированных клеток линий T47D и BT474 смесью микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 подавляет их способность давать опухолевый рост in vivo. Дифференцированные CD44^- клетки линии T47D в модели IL-6 индуцированной дедифференцировки способны давать начало росту опухолевого узла. В то же время предварительная обработка клеток смесью микроРНК miR-195-5p/miR-520a/miR-630 приводит к заметному уменьшению размера опухолевого узла (ксенографта) у экспериментальных животных (фиг. 12, фиг. 13) и практически к полной регрессии образовавшихся небольших опухолевых узлов на 47 сутки роста.

Пример 10. Блокировка метастазирования опухоли с использованием смеси микроРНК in vivo

Оценку антиметастатического действия смеси микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 проводят на модели спонтанного метастазирования карциномы Льюиса. Смесь микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 готовят в форме липосомального препарата. Для этого смешивают холестерол l≥99% (Sigma-Aldrich), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) (Avanti Polar Lipids), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N [amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000 Amine) (Avanti Polar Lipids), растворяют в трет-бутаноле в соотношении по весу 1:5:10:100, замораживают и лиофилизируют.

Самкам мышей линии C57BL/6 подкожно в область правого бока вводят 4×10⁶ клеток карциномы Льюиса (LLC), после чего на 5, 8 и 11 сутки внутривенно (в хвостовую вену) вводят комплекс смеси микроРНК в форме липосомального препарата ресуспендированного в физиологическом растворе в концентрации 0,3; 0,6, и 1,35 мг микроРНК мимика/кг. Мышам контрольной группы в аналогичные сроки вводят физиологический раствор. На 7 сутки после введения опухоли проводят ее резекцию. На 15 сутки после трансплантации опухолевых клеток мышей подвергают эвтаназии методом цервикальной дислокации, выделяют легкие и проводят подсчет количества и площади субплевральных метастазов. Рассчитывают индексы ингибирования метастазирования (ИИМ) и торможения роста метастазов (ТРМ) по формулам (5, 6):

, (5)

где А - среднее количество метастазов, В - доля животных с метастазами, соответственно в контрольной (к) и опытной (о) группах.

, (6)

где Scon - средняя площадь метастазов в контрольной группе, мм², Sexp - площадь метастазов у животных опытной группы, мм².

Введение липосомального препарата содержащего смеси микроРНК miR-195-5р/miR-520a/miR-630 вызывает дозозависимое подавление метастазирования у мышей с опухолью LLC - снижение количества субплевральных метастазов в легких и их площади (фиг. 14, фиг. 15). Индекс ингибирования метастазирования составляет 54,43%, 92,41% и 98,31% при дозе препарата 0,3, 0,6 и 1,35 мг/кг соответственно (фиг. 16).

Таким образом, реализуемое техническое решение - способ блокировки метастазирования за счет ингибирования дедифференцировки опухолевых клеток для противоопухолевой терапии с использованием молекул, включая химические ингибиторы и биомолекулы, в том числе микроРНК мимики, в том числе содержащие в своей структуре химически-модифицированные нуклеотиды - обеспечивает эффективное подавление экспрессии генов стволовости, ингибирует ключевые пути стволовой пластичности в опухолевых клетках, препятствует дедифференцировке дифференцированной опухолевой клетки, т.е. переходу ее в состояние стволовой опухолевой клетки, подавляет способность опухолевых клеток давать начало росту опухолевых узлов и подавляет метастазирование опухоли в организме. Реализуемое техническое решение предназначено для противоопухолевой терапии, а именно для предотвращения развития метастатической болезни у больных с операбельной и местно-распространенной формами опухолей.

Список использованных источников

1. Chaffer, C.L. and R.A. Weinberg. A perspective on cancer cell metastasis. Science, 2011. 331(6024): p. 1559-64.

2. Kerbel, R.S. Issues regarding improving the impact of antiangiogenic drugs for the treatment of breast cancer. Breast, 2009. 18 Suppl 3(0 3): p. S41-7.

3. Jong Bae Park et al. Anti-cancer composition comprising microrna molecules. 2008.

4. Winer, A. et al. Inhibition of Breast Cancer Metastasis by Presurgical Treatment with an Oral Matrix Metalloproteinase Inhibitor: A Preclinical Proof-of-Principle Study. Mol Cancer Ther, 2016. 15(10): p. 2370-2377.

5. Overall, C.M. and O. Kleifeld. Towards third generation matrix metalloproteinase inhibitors for cancer therapy. Br J Cancer, 2006. 94(7): p. 941-6.

6. Taewoo Lee et al. Pharmaceutical composition for treating cancer comprising microrna as active ingredient. 2016, Bioneer Corp: Canada.

7. et al. COLON CANCER TREATMENT AGENT USING miR-340. 2013.

8. Ramamoorthi, G. et al. Disseminated cancer cells in breast cancer: Mechanism of dissemination and dormancy and emerging insights on therapeutic opportunities. Semin Cancer Biol, 2022. 78: p. 78-89.

9. Fares, J. et al. Molecular principles of metastasis: a hallmark of cancer revisited. Signal Transduct Target Ther, 2020. 5(1): p. 28.

10. Zhou, Y., M. Han, and J. Gao. Prognosis and targeting of pre-metastatic niche. J Control Release, 2020. 325: p. 223-234.

11. Kim, H.M. and J.S. Koo. The Role of Autophagy in Breast Cancer Metastasis. Biomedicines, 2023. 11(2).

12. Anderson, R.L. et al. A framework for the development of effective anti-metastatic agents. Nat Rev Clin Oncol, 2019. 16(3): p. 185-204.

13. Zhou, N. et al. The combination of hydroxychloroquine and 2-deoxyglucose enhances apoptosis in breast cancer cells by blocking protective autophagy and sustaining endoplasmic reticulum stress. Cell Death Discov, 2022. 8(1): p. 286.

14. Rojas-Puentes, L.L. et al. Phase II randomized, double-blind, placebo-controlled study of whole-brain irradiation with concomitant chloroquine for brain metastases. Radiat Oncol, 2013. 8: p. 209.

15. Varisli, L., O. Cen and S. Vlahopoulos. Dissecting pharmacological effects of chloroquine in cancer treatment: interference with inflammatory signaling pathways. Immunology, 2020. 159(3): p. 257-278.

16. Kimura, T. et al. Chloroquine in cancer therapy: a double-edged sword of autophagy. Cancer Res, 2013. 73(1): p. 3-7.

17. Shaw, H.V., A. Koval and V.L. Katanaev. Targeting the Wnt signalling pathway in cancer: prospects and perils. Swiss Med Wkly, 2019. 149: p. w20129.

18. Vlachou, T. et al. Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures. J. Vis. Exp. , 2019. 153: p. e60256.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="2023-52.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2024-01-22">

<ApplicantFileReference>2023-52</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe

obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniia Sibirskii

gosudarstvennyi meditsinskii universitet Ministerstva

zdravookhraneniia Rossiiskoi Federatsii</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ ингибирования

метастазирования опухолей, путем подавления дедифференцировки

опухолевых клеток </InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>7</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tagcagcacagaaatattggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaagtacttccctctggagtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttccctggtacagaatacttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tagcagcacagaaatattggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctccagagggaagtactttct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agtattctgtaccagggaaggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caavavvvcvgvgcvgcvavv</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, а именно к способу ингибирования метастазирования опухолей путем подавления дедифференцировки опухолевых клеток, заключающемуся в подавлении экспрессии генов стволовости. Способ также включает введение в организм молекул, которые могут являться химическими ингибиторами, природными молекулами или их синтетическими аналогами, в том числе микроРНК мимиками, в том числе содержащими в своей структуре химически-модифицированные нуклеотиды, или их смеси. Способ позволяет предотвращать развитие метастазов за счет блокирования дедифференцировки дифференцированных опухолевых клеток, находящихся в составе микрометастазов. 2 з.п. ф-лы, 16 ил., 10 пр.

1. Способ ингибирования метастазирования опухолей путем подавления дедифференцировки опухолевых клеток, заключающийся в подавлении экспрессии генов стволовости, угнетении функции их продуктов - белков стволовости и ингибировании ключевых путей стволовой пластичности в опухолевых клетках, которое предотвращает дедифференцировку дифференцированных опухолевых клеток, т.е. их переход в состояние стволовых опухолевых клеток, в результате чего подавляется способность опухолевых клеток давать начало росту опухолевых узлов и метастазов в организме.

2. Способ ингибирования метастазирования опухолей путем подавления дедифференцировки опухолевых клеток по п. 1, характеризующийся тем, что используют композицию трех микроРНК - miRNA-195-5p, miRNA-520a, miRNA-630, где микроРНК являются природной молекулой микроРНК, изо-микроРНК, прекурсором образования микроРНК, мимиком молекул микроРНК, в том числе содержащей в своей структуре химически модифицированные нуклеотиды, и которые представляют собой олигонуклеотиды, включающие в свою структуру консенсусную последовательность miRNA-195-5p, miRNA-520a, miRNA-630, указанную в позиции 2-9 SEQ ID NO 1-3 соответственно, или ее фрагмент длиной не менее 6 нуклеотидов.

3. Способ ингибирования метастазирования опухолей путем подавления дедифференцировки опухолевых клеток по п. 1, характеризующийся тем, что используют композицию трех ингибиторов: ингибитора, подавляющего взаимодействие с-Мус с белком Мах и препятствующего активации генов транскрипционным фактором с-Мус, ингибитора теломеразы и ингибитора сигнального пути Notch.