СПОСОБ НЕМЕДИКАМЕНТОЗНОГО СНИЖЕНИЯ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ Российский патент 2009 года по МПК A61K36/06 A61P5/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования грибов класса Basidiomycetes рода Trametes, a именно использования биомассы грибов вида Trametes ochracea или экстрактов из биомассы в составе пищевого рациона для снижения уровня холестерина и триглицеридов в крови, увеличения липидов высокой плотности в крови и активации метаболизма холестерина в печени при гиперлипидемии.

Известны способы снижения гиперлипидемии путем использования средств на основе растительного сырья, RU №2173161 С1, A61K 35/78, А61Р 3/06, 2001.09.10; RU №2246964 С1, A61K 35/78, А61Р 3/06, 2005.02.27.

Известны способы снижения гиперлипидемии на основе использования микромицетов разных родов, в частности из рода Aspergillus, US №4231938.

Известны способы снижения гиперлипидемии путем использования базидиальных макромицетов разных видов из рода Pleurotus, Nina Gunde-Cimerman. Medicinal Value of the Genus Pleurotus (Fr.) P.Karst. (Agaricales s.1., Basidiomycetes) // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.69-71; US №6372964, 435/171, 424/195-15, 435/254.1, 435/256.8, 2002.04.16.

Известны способы снижения гиперлипидемии путем использования базидиальных макромицетов вида Pleurotus ostreatus, Bobek P., Ginter E., Jurcovicova M., Kuniak L. Cholesterol-lowering effect of the mushroom Pleurotus ostreatus in hereditary hypercholesterolemic rats // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / p.371.; Bobek P., Ginter E., Ozdin L. Oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) accelerates the plasma clearance of low-density and high-density lipoproteins in rats // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / p.372.; Opletal L. Phytotherapeutic aspects of diseases of the circulatory system // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.372-373.; Bobek P., Ozdin L. The mushroom Pleurotus ostreatus accelerates plasma very-low-density lipoprotein clearance in hypercholesterolemic rat // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.374-375.; Bobek P., Ozdin L., Kuniak L., Hromadova M. Regulation of cholesterol metabolism with dietary addition of oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus) in rats with hypercholesterolemia // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.377-378.

Известны способы снижения гиперлипидемии путем использования базидиальных макромицетов вида Lentinus edodes, вида Volvariella volvacea, вида Agrocybe aegerita, вида Tremella fuciformis, Solomon P.Wasser and Alexander L.Weis. Medicinal Properties of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review) // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.34-35.

Известен способ снижения гиперлипидемии путем использования базидиальных макромицетов вида Flammulina velutipes, вида Coprinus domesticus, Olga V.Remesova, Nina P.Denisova. The Action of Higher Basidiomycetes Mushrooms Mycelia on Plasma Lipids and Lipoproteins of Hyperlipidemic Rats and Guinea Pigs // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.331-336.

Известны способы получения глубинного мицелия гриба рода Trametes (син. Coriolus), SU №718018 A3, C12K 1/00, C12D 13/04; 1980.02.25, SU №1090261 A3, C12N 1/00, C12R 1/645, 1984.04.30; SU №1403990 A3, C08B 37/00,1988.06.15.

Известна противоопухолевая и гипогликемическая композиция на основе активных ингредиентов из Basidiomycotina, обнаруженных в том числе в культуре грибов Trametes (син. Coriolus) versicolor, RU №2274465 C2, A61K 36/07, A61K 36/25, 2006.04.20.

Известен способ снижения холестерина, заключающийся в использовании грибов класса Basidiomycetes рода Trametes, Solomon P.Wasser and Alexander L.Weis. Medicinal Properties of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review) // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / P.50.

Данное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.

Мицелий гриба Trametes versicotor ближайшего аналога используют в качестве противоопухолевого средства.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей выявить из базидиальных грибов рода Trametes вид гриба, снижающий уровень гиперлипидемии, определить и расширить возможности осуществления способа.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии заключается в использовании грибов класса Basidiomycetes рода Trametes.

Из рода Trametes используют грибы вида Trametes ochracea.

Продукты глубинного культивирования грибов вида Trametes ochracea вносят в состав пищевого рациона.

В качестве продукта глубинного культивирования используют биомассу грибов вида Trametes ochracea.

Биомассу грибов вида Trametes ochracea используют при минимальном количестве 2% от пищевого рациона.

В качестве продукта глубинного культивирования используют экстракт из биомассы грибов вида Trametes ochracea.

Экстракт из биомассы грибов вида Trametes ochracea используют при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона.

В качестве экстракта используют этилацетатный экстракт.

Заявителями не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

За счет реализации отличительных признаков изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) достигаются важные новые свойства объекта.

В роде Trametes выявлен базидиальный гриб вида Trametes ochracea, продукты глубинного культивирования которого снижают уровень гиперлипидемии.

Использование в качестве продукта глубинного культивирования биомассы базидиального гриба Trametes ochracea или экстракта из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea существенно снижает уровень гиперлипидемии.

Внесение биомассы при минимальном количестве 2% или экстракта из биомассы при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона обеспечивает осуществление способа.

Использование биомассы базидиального гриба Trametes ochracea или экстракта из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea, в частности этилацетатного экстракта, расширяет возможности осуществления способа.

Заявителям не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителей, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом.

Для немедикаментозного снижения гиперлипидемии используют базидиальный гриб Trametes ochracea.

Продукты глубинного культивирования базидиального гриба Trametes ochracea вносят в состав пищевого рациона.

В качестве продуктов глубинного культивирования используют биомассу или экстракт из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

Биомассу базидиальных грибов Trametes ochracea используют в количестве 2% от пищевого рациона.

Экстракт из биомассы базидиальных грибов Trametes ochracea используют в количестве 0,002% от пищевого рациона.

В качестве экстракта может быть использован этилацетатный экстракт.

Базидиальный макромицет Trametes ochracea (Pers.) Gilb.et Ryvarden (синоним Coriolus zonatus (Nees) Quelet) является дереворазрушающим грибом, в природе обитает на древесине различных пород деревьев, активно разрушая ее. Грибы этой трофической группы (ксилотрофы, лигнотрофы) быстрее адаптируются к искусственным условиям культивирования, чем другие сапротрофные группы (подстилочные, напочвенные и др.). Они могут активно развиваться на питательных средах с использованием более широкого спектра источников азота и углерода на фоне минеральных солей. Плодовые тела этого вида индейцы бассейна Амазонки считают съедобными и используют их в своем пищевом рационе (Ghillean Т.Prance, The Use of Edible Fungi by Amazonian Indians // Advences in Economic Botany, 1984, 1, p.127-139.).

Культура Trametes ochracea выделена из плодовых тел дереворазрушающего гриба Trametes ochracea (Pers.) Gilb. et Rivarden, собранных в северо-восточной пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга. Плодовые тела (син. базидиомы) собраны, охарактеризованы и индуцированы в чистую культуру авторами.

Для осуществления способа используют культуру Trametes ochracea ТИ-15 из коллекции культур высших базидиальных грибов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).

В коллекции культуру Trametes ochracea поддерживают на косяках сусло-агара (пивное сусло 4° по Баллингу, агар 20%) и хранят в рефрижераторе при +4±2°С.

Достоверное снижение уровня гиперлипидемии подтверждено в эксперименте.

Эксперимент проведен на белых беспородных крысах-самцах массой 140-160 г, полученных из питомника «Рапполово РАМ» г.Санкт-Петербурга.

Модель гиперлипидемии белых беспородных крыс-самцов выбрана на основании опыта Института Экспериментальной Медицины РАМН (г.С.-Петербург) и зарубежных работ (Климов А.Н., Рыженков В.Е., Экспериментальное изучение гиполипидемических и антиатеросклеротических средств. Методические рекомендации, М., 1988, 18 с.: Staprans I., Rapp J.H., Pan X-M. et al., Oxidized lipids in the diet accelerate the development of fatty streaks in cholesterol-fed rabbits, Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol., 1996, v 16, N4, 533-538).

ПРИМЕР 1.

Получение биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

Предварительно готовят посевной материал, выращивая культуру Trametes ochracea в стационарных условиях на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза 20; пептон 4; KH₂PO₄ 0,6; K₂HPO₄ 0,4; MgSO₄ 0,5; ZnSO₄·7H₂O 0,001; FeSO₄·7H₂O 0,005; MnSO₄ 0,003; CaCl₂ 0,05; кукурузный экстракт 1,0 (по сухому весу); рН среды до стерилизации 5,8-6,0. Стерилизацию среды проводят при 0,5*10³ Па в течение 30 минут.

Посевной материал выращивают в течение 7-10 дней при 25-28°С, диспергируют и используют в качестве инокулюма для получения биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

Глубинное культивирование базидиального гриба Trametes ochracea проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл глюкозопептонной среды указанного состава и суспензию посевного материала в количестве 10% от объема среды. Культивирование проводят на роторной качалке при 120-160 об/мин в течение 7 суток при 25-28°С. Указанный температурный интервал является оптимальным для активного роста культуры Trametes ochracea.

Выросшую при глубинном культивировании биомассу базидиального гриба Trametes ochracea отделяют от нативного раствора, сушат при температуре 40-50°С и измельчают в порошок.

Примечание:

Глубинное культивирование базидиального гриба Trametes ochracea аналогичным способом можно проводить и на натуральной среде, в состав которой входят пивное сусло (4° по Баллингу) и соевая мука (1%), рН среды 5,8-6,0.

Для глубинного культивирования могут быть использованы и другие известные питательные среды.

ПРИМЕР 2.

Получение этилацетатного экстракта из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

15 г порошка биомассы базидиального гриба Trametes ochracea замачивают в 900 мл воды и выдерживают в течение 30 мин. Доводят рН до 7,7, используя 4% NaOH. Добавляют 150 мл метанола и 300 мл этилацетата. Процесс экстракции в двухфазной системе растворителей Н₂О:МеОН:этилацетат (при соотношении 3:0.5:1) проводят на магнитной мешалке в течение 30 мин. Раствор центрифугируют при 5000 об/мин и 4°С в течение 10 мин и отбирают этилацетатный экстракт.

Отобранный раствор упаривают под вакуумом при температуре 40-45°С и подвергают последующей кристаллизации охлаждением.

Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в потоке воздуха при 40°С.

Примечание:

Можно использовать водно-спиртовой экстракт, а также экстракты, полученные с применением других экстрагентов.

ПРИМЕР 3.

Проведение эксперимента.

Экспериментально индуцированную гиперлипидемию создавали у животных (белых беспородных крыс-самцов) путем использования в качестве их ежедневного пищевого рациона специальной гиперлипидемической диеты в течение трех недель (21 день).

Животные были разделены на несколько групп. Интактная группа (12 животных) получала стандартный сухой корм и водопроводную воду ad libitum. Контрольная группа (7 животных) получала гиперлипидемический корм и воду. Животные опытных групп №1 и №2 (по 7 животных в каждой группе) наряду с гиперлипидемическим кормом получали добавку исследуемых грибных материалов.

Гиперлипидемическая диета в качестве основы включала овсяные хлопья, в качестве атерогенных компонентов - сухой кристаллический холестерин - 5%, свиной жир - 25%, подсолнечное масло - 18%, витамин D (эргокальциферол) - 200 тыс. МЕ/сутки.

Животные опытных групп №1 и №2 получали per os добавку исследуемых грибных компонентов, смешанных с основной массой корма в количестве 2% и 0,002% от пищевого рациона. В качестве грибных добавок опытная группа №1 животных получала сухую биомассу базидиального гриба Trametes ochracea (2%), опытная группа №2 - сухой этилацетатный экстракт из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea (0,002%).

Примечание:

Внесение добавок исследуемых грибных компонентов в виде сухой биомассы базидиального гриба Trametes ochracea при минимальном количестве 2% от пищевого рациона и в виде сухого этилацетатного экстракта из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона является оптимальным.

Определение общего холестерина, холестерина ЛПВП и триглицеридов в крови.

По истечении 21 дня у животных, предварительно наркотизированных уретаном, проводили забор крови.

Забор крови осуществляли при декапитации самотеком с последующим центрифугированием.

Содержание общего холестерина и холестерин ЛПВП определяли с помощью набора «Ольвекс диагностикум» (Санкт-Петербург, Россия).

Метод основан на сочетании ферментативной реакции с реакцией окисления. Образующаяся в результате этих реакций перекись водорода взаимодействует под действием пероксидазы с 4-аминофеназоном и фенолом с образованием окрашенного продукта - хинонимина.

Определение триглицеридов проводили в сыворотке крови с применением энзиматического колориметрирического метода с использованием набора реагентов для определения триглицеридов в сыворотке или цельной крови человека «ВИТАЛ ДИАГНОСТИКС» (Санкт-Петербург, Россия).

Содержание общего холестерина, холестерина ЛПВП и триглицеридов в крови животных интактной группы, контрольной группы и опытных групп №1 и №2 представлены в таблице.

Из таблицы видно, что у животных контрольной группы, получавших гиперлипидемическую (атерогенную) диету наблюдается характерное изменение в содержании атерогенных соединений в сыворотке крови - увеличивается концентрация общего холестерина на 77% и содержание триглицеридов на 130%. Концентрация антиатерогенных липидов (ЛПВП) в сыворотке контрольных животных была выше по сравнению с интактными животными (2,05 ммоль/л по сравнению с 1,43 ммоль/л). Известно, что у крыс спонтанный атеросклероз не встречается, и большая часть холестерина крови находится в составе липидов высокой плотности. Увеличение у них ЛПВП па фоне гиперлипидемической диеты является компенсаторной реакцией организма (Климов А.П. Антиатерогенная функция липопротеинов высокой плотности. С.34-54; в кн: Атеросклероз. Проблемы патогенеза и терапии. Изд. «Медицинская литература», СПб., 2006. С.246).

У животных опытной группы №1, получавших наряду с гиперлипидемической диетой грибную добавку в виде сухой биомассы базидиального гриба Trametes ochracea, уровень гиперхолестеринемии был выше, чем у интактной группы только на 41% (в контрольной группе на 77%). Содержание общего холестерина в сыворотке крови животных опытной группы №1 было на 20% ниже, чем у животных контрольной группы.

Уровень триглицеридов в сыворотке крови животных опытной группы №1 повышался по сравнению с интактной группой только на 8%, (у контрольной группы на 130%). Содержание в крови триглицеридов по сравнению с контрольной группой снижалось на 53%.

Концентрация липопротеидов высокой плотности («хорошего холестерина» - ЛПВП) в крови животных опытной группы №1 практически не отличалась от аналогичных данных контрольной группы, но была значительно выше, чем у животных интактной группы - 2,03 ммоль/л по сравнению с 1,43% ммоль/л.

В клинической практике принято рассчитывать коэффициент атерогенности (КА), который выражают через отношение разницы между содержанием общего холестерина и холестерина ЛПВП к содержанию ЛПВП (Климов, 2006). Коэффициент атерогенности позволяет судить о степени угрозы развития атеросклеротического процесса в организме.

Из таблицы видно, что в норме у животных интактной группы КА очень низкий - 0,2, что естественно, т.к. крысы относятся к группе животных, устойчивых к развитию атеросклероза. Однако на фоне индуцированной гиперлипидемии у животных контрольной группы этот коэффициент возрастает до 0,5. У животных опытной группы №1, получавших наряду с гиперлипидемическим кормом грибную добавку в виде биомассы базидиального гриба Trametes ochracea, КА не только снизился по сравнению с контрольной группой, но и вернулся к норме животных интактной группы - 0,2.

Общая тенденция к снижению уровня гиперлипидемии в крови животных опытной группы №1 подтверждается и у животных опытной группы №2, получавших наряду с гиперлипидемическим кормом не биомассу, а этилацетатный экстракт из биомассы базидиального гриба Trametes ochracea.

Из таблицы видно, что уровень гиперхолестеринемии у животных опытной группы №2 был выше, чем у интактной группы на 32% (в контрольной группе на 77%). Содержание в крови общего холестерина снижалось по сравнению с контрольной группой на 25%, т.е. сходным образом с животными опытной группы №1.

Уровень триглицеридов в сыворотке крови животных опытной группы №2 повышался по сравнению с интактной группой на 120% (р>0,05). Содержание триглицеридов снижалось по отношению к контрольной группе на 4%.

Уровень холестериновой фракции ЛПВП у животных опытной группы №2 был наиболее высоким - 2,12 ммоль/л, соответственно коэффициент атерогенности был наименьшим - 0,1.

Представленные выше в таблице данные характеризуют картину снижения индуцированной гиперлипидемии в сыворотке крови животных.

Картина снижения гиперлипидемии в сыворотке крови опытных животных, представленная в таблице, дополнена данными но оценке содержания холестерина в печени этих животных.

Оценка содержания общего холестерина в печени.

По истечении 21 дня у животных определяли содержание общего холестерина в печени.

В печени исследованных животных анализ содержания общего холестерина (ммоль/л) показал следующее: интактная группа - 0,076, контрольная группа - 0,101, опытная группа №1 - 0,043. Внесение в гиперлипидемический корм животных грибной биомассы из культуры Trametes ochracea приводило к снижению уровня холестерина в печени по сравнению с контрольной группой на 58%. Эти данные не только подтверждают наблюдаемое в сыворотке крови гипохолестерольное действие биомассы базидиального гриба Trametes ochracea, но и свидетельствуют об активации метаболизма холестерина в печени животных под влиянием грибной добавки.

Кроме того, исследовали биомассу двух других видов лигнотрофных грибов из рода Trametes, культуры которых имеются в коллекции культур высших базидиальных грибов кафедры микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). Биомассу культур видов Trametes versicolor и Trametes hirsuta получали глубинным способом и исследовали на животных аналогичным образом, как в случае биомассы культуры Trametes ochracea. Было установлено, что внесение в рацион этих животных биомассы базидиальных грибов Trametes versicolor и Trametes hirsuta приводило к достоверному снижению содержания только общего холестерина в сыворотке крови и печени животных. Пределы снижения были меньше, но почти сходны с уровнем снижения, наблюдаемым при использовании биомассы базидиального гриба Trametes ochracea (15-20% против 20% в сыворотке крови и 35-40% против 58% в печени). Содержание триглицеридов снижалось значительно меньше - всего на 18-20% по сравнению с 53% в случае использования биомассы базидиального гриба Trametes ochracea. Кроме того, и это особенно важно, содержание ЛПВП в крови этой группы животных резко снижалось, почти в 2 раза по сравнению с контрольной группой, в то время как при использовании биомассы базидиального гриба Trametes ochracea содержание «хороших липидов» (ЛПВП) оставалось на уровне контрольной группы. В результате индекс атерогенности такого корма повышался до 1,0 (в случае использования биомассы базидиального гриба Trametes ochracea он составлял всего 0,2, как у животных интактной группы).

Предложенный способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии, относящийся к микробиологической промышленности, включающий использование базидиальных грибов Trametes ochracea и проведение экспериментальных исследований, подтверждающих снижение гиперлипидемии, проведенный в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П.Павлова и Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете), обусловливает, по мнению заявителей, соответствие его критерию «промышленная применимость».

Использование предложенного способа позволяет:

- использовать базидиальные грибы Trametes ochracea для снижения уровня холестерина и триглицеридов в крови, повышения уровня ЛПВП в крови, снижения уровня холестерина и активации его метаболизма в печени, что в целом приводит к существенному снижению уровня гиперлипидемии,

- расширить возможности осуществления способа, за счет внесения в состав пищевого рациона биомассы базидиальных грибов Trametes ochracea и экстрактов из биомассы в лечебных и профилактических целях.

Влияние грибных добавок из культуры Trametes ochracea на уровень индуцированной гиперлипидемии у белых беспородных крыс-самцов (в сыворотке крови) Интактная группа (стандартный корм)Контрольная группа (гиперлипидемическая диета)Опытная группа №1 (гиперлипидемическая диета + биомасса)Опытная группа №2 (гиперлипидемическая диета + экстракт)Общий холестерин (ммоль/л)1,723,05*2,43*2,28*По сравнению с интактной группой-+77%+41%+32%По сравнению с контрольной группой---20%-25%Триглицериды (ммоль/л)0,701,61*0,76*1,55**По сравнению с интактной группой-+130%+8%+120%По сравнению с контрольной группой--- 53%-4%ЛПВП (ммоль/л)1,432,052,032,12Коэффициент атерогенности0,20,50,20,1Примечание:
* - доверительный интервал р<0,05
** - доверительный интервал р>0,05

Способ относится к медицине, а именно к терапии, и касается немедикаментозного снижения гиперлипидемии. Для этого в состав пищевого рациона вносят продукты глубинного культивирования грибов класса Basidiomycetes рода Trametes вида Trametes ochracea. Использование биомассы базидиальных грибов Trametes ochracea, a также экстракта из нее позволяет снижать уровень общего холестерина и триглицеридов в крови, повышать уровень ЛПВП в крови, снижать уровень общего холестерина и активировать метаболизм холестерина в печени. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии, заключающийся в использовании грибов класса Basidiomycetes рода Trametes, отличающийся тем, что из рода Trametes используют грибы вида Trametes ochracea, продукты глубинного культивирования которого вносят в состав пищевого рациона.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве продукта глубинного культивирования используют биомассу при минимальном количестве 2% от пищевого рациона.3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве продукта глубинного культивирования используют экстракт из биомассы при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве экстракта используют этилацетатный экстракт.