СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА Российский патент 2009 года по МПК C12N9/58 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования базидиальных грибов рода Coprinus в качестве молокосвертывающих ферментов при производстве сыра с применением ферментов микробного происхождения.

Известен способ производства сыра с использованием в качестве молокосвертывающих агентов: в виде природного фермента химозина (реннина), получаемого из сычугов скота молочного возраста; в виде смеси сычужного фермента с пепсином; пепсинов, экстрагируемых из желудков взрослого скота или слизистых оболочек желудков цыплят; в виде бактериальных (из родов Bacillus, Pseudomonas, Stretococcus) и дрожжевых (из родов Rhodotorula, Candida) препаратов; в виде ферментных препаратов из мицелиальных культур микромицетов родов Mucor, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, соответственно, [Гудков А. В. Сыроделие: Технологические, биологические и физико-химические аспекты, М. Дели принт, 2004. - 804 с; Чеботарев А.И., Дурова Ж.И., Петина Т.А. Использование фермента сычужного действия из Asperillus candidus шт.11 в производстве дорогобужского сыра. Прикладная биохимия и микробиология, 1969, т.5, №4, с.451-454; Югова Л.В., Дорохов В.В., Производство и применение продуктов микробиологических производств. Микробные заменители сычужного фермента, М., 1988. - 19 с.].

Большинство из существующих в практике сыродельной промышленности молокосвертывающих препаратов микробного происхождения (из бактерий, дрожжей, микромицетов) не нашло широкого коммерческого спроса не только в связи с нестандартностью сырья и отсутствием достаточно стабильных его источников, но и в связи с существенным недостатком, присущим ферментативной активности этих препаратов, а именно, наряду с высокой молокосвертывающей активностью они обладают высоким уровнем общего неспецифического протеолиза белков молока, что приводит к получению сыров невысокого качества, часто с легким или выраженным привкусом горечи. Таким образом, высококачественного заменителя сычужного фермента из продуцентов микробного происхождения пока не получено.

Следует также указать, что важным моментом биотехнологического процесса, основанного на использовании указанных групп микроорганизмов (бактерии, дрожжи, микромицеты), является существующая на этих производствах опасность профзаболеваний персонала (кандидозы, микозы, аллергические реакции разной степени тяжести и т.п.), связанная с биологической природой применяемых продуцентов. Культуры высших базидиальных макромицетов, в отличие от культур микромицетов, в ходе биотехнологического процесса (в поверхностных или глубинных условиях) не имеют стадии спороношения, что исключает опасность соответствующих профзаболеваний и способствует экологической чистоте рабочих помещений.

Известны продуценты молокосвертывающих ферментов культур высших базидиальных грибов из родов Irpex, Trametes, Fomitopsis, Ganoderma, Russula, Kawai М. Studies of milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes. [III. Partial purification and some properties of the enzyme produced by Irpex lacteus Fr. // Agr.Biol.Chem. 1971. V.35. Р.1517-1525].

Культуры видов указанных родов (за исключением р.Russula) выделены из так называемых трутовых (афиллофоровых) грибов, плодовые тела которых в природе имеют кожистую или деревянистую фактуру, часто покрыты твердой коркой, не токсичны, но и не съедобны.

Известен способ получения молокосвертывающего фермента путем культивирования продуцента базидиального гриба на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, [RU №854983, C12R 1/645, 1981.08.15].

Данное техническое решение принято в качестве «ближайшего аналога» настоящего изобретения.

В «ближайшем аналоге» культура из рода Russula выделена из плодового тела агарикового (пластинчатого) гриба рода сыроежек. Фермент получен путем культивирования продуцента Russula decolorans (сыроежка сереющая) на жидкой питательной среде с последующим выделением фермента из культуральной жидкости.

Недостатками «ближайшего аналога» являются длительное культивирование продуцента и относительно высокая общая протеолитическая активность препарата. Максимальная активность молокосвертывающего фермента в «ближайшем аналоге» наступает при глубинном выращивании на 8-9 сутки.

Кроме того, жизнедеятельность грибов этого рода в природных условиях напрямую зависит от степени их сожительства с корнями различных пород деревьев (симбиоз), поэтому в биотехнологических условиях культуры, выделенные из симбиотрофных видов базидиомицетов, характеризуются низкой скоростью роста.

Кроме того, в «ближайшем аналоге» возможность строгой таксономической идентификации продуцента не обеспечивается, в связи с этим надежность микроскопического контроля всего биотехнологического процесса затруднена.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей повысить качество молокосвертывающего фермента, сократить сроки культивирования продуцента.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении молокосвертывающего фермента при использовании агарикового макромицета Coprinus lagopides.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что способ получения молокосвертывающего фермента путем культивирования продуцента базидиального гриба на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли.

Из базидиальных грибов рода Coprinus в качестве продуцента используют агариковый макромицет Coprinus lagopides.

За счет реализации отличительных признаков изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) достигаются важные новые свойства объекта.

Использование агарикового макромицета Coprinus lagopides позволяет получить молокосвертывающий фермент с высокой качественной характеристикой: с высоким уровнем молокосвертывающей активности и низким уровнем общей протеолитической активности, что повышает его качество.

Получение молокосвертывающего фермента на основе агарикового макромицета Coprinus lagopides позволяет сократить сроки ферментации продуцента, что улучшает биотехнологический процесс.

Заявителям не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителей, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Агариковый макромицет Coprinus lagopides является ксилотрофным сапротрофом, растет на богатой лигнином почве, погребенной или обгорелой древесине, прелых опилках и др. Экологически отличается от других видов этого рода - не встречается на навозе. Молодые плодовые тела съедобны.

Агариковый макромицет Coprinus lagopides выделен из плодовых тел Coprinus lagopides, собранных в северо-восточной пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга. Плодовые тела (син. базидиомы) собраны, охарактеризованы и индуцированы в чистую культуру авторами.

Для осуществления способа используют штаммы агарикового макромицета Coprinus lagopides ТИ-12, Coprinus lagopides ТИ-32 и Coprinus lagopides ТИ-33 из коллекции культур высших базидиальных грибов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).

В коллекции указанные штаммы агарикового макромицета Coprinus lagopides ТИ-12, ТИ-32 и ТИ-33 хранятся в стеклянных пробирках на косяках сусло-агара (содержание сахаров 4° по Баллингу, агар 20%) в рефрижераторе при температуре 4-6°С±2°С. Воздушный мицелий Coprinus lagopides вначале роста белого цвета, затем серовато-коричневатый, обратная сторона колоний гладкая, реверзум не окрашен.

Гифальная система агарикового макромицета Coprinus lagopides мономитическая: гифы двух типов - недифференцированные генеративные 3-8 мкм в диаметре, длинноклетные, с регулярными небольшими пряжками, гиалиновые и мешковидные гифы, дифференцировавшиеся из них и идентичные таковым поверхности кутикулы плодовых тел.

Характерным признаком вегетативного мицелия является обильное образование склероциев (плотно упакованных генеративных гиф) буроватого цвета, волокновидных, иногда содержащих вздутые запасающие клетки (10-20 мкм в диаметре), морфологически также подобные клеткам кутикулы плодовых тел.

Агариковый макромицет Coprinus lagopides, в отличие от прототипа Russula decolorans, имеет в природе независимый сапротрофный тип питания, что существенно облегчает работу с ним в искусственных условиях.

Важной и отличительной от прототипа биологической характеристикой агарикового макромицета Coprinus lagopides является его способность в лабораторных условиях при хранении культуры in vitro образовывать небольшие плодовые тела.

Шляпки плодовых тел, образующихся в пробирке, имеют размер 10-20 мм в диаметре, вначале эллипсоидальные, конические, затем распростертые, часто расщепленные по краю, беловатые, затем серые с винным оттенком. В центре шляпки кремово-желтоватые, сначала покрыты многочисленными беловато-сероватыми чешуйками, затем голые, слегка ребристые. Кутикула состоит из радиально ориентированных пузыревидных цилиндрических клеток 10-20 мкм в диаметре. Пластинки плодовых тел от сероватых до буро-черных. Ножки 15-75×4 мм, цилиндрические, беловатые, у основания утолщенные, войлочные. Споры темно-бурые, 6-9×5-7 мкм, лимоновидные, гладкие, толстостенные с центральной усеченной порой прорастания, в массе фиолетово-черные. Эти морфологические признаки плодовых тел, полученных in virto, подтверждают их принадлежность к виду Coprinus lagopides Р.Karst. [Watling R. and Gregory N.M., 1987. In: British Fungus Flora. Agarics and Boleti: Part 5. Royal Botanic Garden, Edinburgh, 121 pp.], что служит полной гарантией отнесения культур заявленного продуцента к указанному виду агарикового макромицета. Факт надежной таксономической идентификации продуцента обеспечивает и надежность микроскопического контроля всего биотехнологического процесса.

В глубинных условиях биотехнологического процесса агариковый макромицет Coprinus lagopides развивается, как и большинство культур базидиальных макромицетов, в виде пушистых пеллет (шариков), средний диаметр его пеллет 5-7 мм. Изменения цвета культуральной жидкости в процессе ферментации не происходит.

Максимальная активность молокосвертывающего фермента, образуемого указанными культурами агарикового макромицета Coprinus lagopides, наступает при глубинном выращивании на 5-6 сутки роста.

Полученный молокосвертывающий фермент сохраняет уровень ферментативной активности в диапазоне температур 20-50°С, оптимум ферментативной активности лежит в диапазоне 34-37°С, оптимальная ферментативная активность при рН молока 6.4-6.6. Молекулярная масса молокосвертывающего фермента 39±0.5 кВа.

Способ осуществляют следующим образом.

Молокосвертывающий фермент получают культивированием агарикового макромицета Coprinus lagopides на жидкой питательной среде.

При культивировании продуцента в качестве источника углерода могут быть использованы - глюкоза, пивное сусло, мальтоза и другие ди- и олигосахариды.

В качестве источника азота рекомендуется использовать пептон, соевую муку, мочевину, азотнокислый калий, аммонийные соли.

В качестве минеральных солей используют КН₂РО₄, К₂HPO₄, ZnSO₄·7Н₂O, FeSO₄·7Н₂O, CuSO₄·5Н₂O, CaCl₂, NaCl.

Молокосвертывающую активность определяют по общепринятой методике: пробирку с субстратом (объем молока 10 мл), содержащим 0,0015 М раствор CaCl₂ нагревают до 35°С и вносят 2 мл исследуемого ферментного препарата. Активность препарата оценивают по времени образования плотного молочного сгустка.

За единицу молокосвертывающей активности принимают количество фермента, которое свертывает 100 мл молока за 40 мин при 35°С. Расчет молокосвертывающей активности ведут по формуле:

где К - коэффициент разведения исследуемого фермента,

П время в минутах, в течение которого из 100 мл молока при добавлении 2 мл фермента образуется плотный молочный сгусток,

40 - среднее время при производстве сыра (в минутах),

2 - количество вносимого фермента (мл).

Протеолитическую активность оценивают по ГОСТу 20264.2 - 88. За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 35°С катализирует переход в неосаждаемое ТХУ состояние такое количество казеина, которое содержит 1 мкмоль тирозина.

Пример 1

Получение молокосвертывающего фермента культивированием агарикового макромицета Coprinus lagopides ТИ-12 на жидкой питательной среде

Питательная среда на основе глюкозы и пептона.

Глубинное культивирование проводят на роторной качалке при 28-30°С в колбах Эрленмейера (0.75 л), содержащих 250 мл питательной среды следующего состава, г/л: глюкоза 10; пептон 2.5; KH₂PO₄ 0.6; К₂HPO₄ 0.4; ZnSO₄·7Н₂O 0.001; FeSO₄·7Н₂O 0.001; CaCl₂ 0.05; NaCl 0.5; дрожжевой экстракт 2.0 (по сух. весу); рН среды до стерилизации 5.8-6.0. Стерилизацию среды проводят при 0.5·10⁵ Па в течение 30 минут.

Выделение фермента методом ультрафильтрации.

По достижении максимальной молокосвертывающей активности (6 сутки) мицелиальную биомассу отделяют фильтрованием от культуральной жидкости. Затем культуральный фильтрат концентрируют и очищают от низкомолекулярных соединений методом ультрафильтрации и лиофильно высушивают.

Удельная молокосвертывающая активность фермента составляет 45000-53000 Ед/г (время створаживания молока 1 мин).

Образуемый под действием данного фермента плотный молочный сгусток не имеет привкуса горечи, что подтверждает низкий уровень протеолитической активности.

Питательная среда на основе пивного сусла и соевой муки.

Глубинное культивирование проводят на роторной качалке при 28-30°С в колбах Эрленмейера (0.75 л), содержащих 250 мл питательной среды следующего состава: пивное сусло (4° по Баллингу), соевая мука (1%).

Выделение фермента методом ультрафильтрации.

По достижении максимальной молокосвертывающей активности (5 сутки) мицелиальную биомассу отделяют фильтрованием от культуральной жидкости. Затем культуральный фильтрат концентрируют и очищают от низкомолекулярных соединений методом ультрафильтрации и лиофильно высушивают.

Удельная молокосвертывающая активность сухого фермента составляет 55000-60000 Ед/г (время створаживания молока 0.5-1 мин).

Образуемый под действием данного фермента плотный молочный сгусток не имеет привкуса горечи, что подтверждает низкий уровень протеолитической активности.

Пример 2.

Получение молокосвертывающего фермента культивированием агарикового макромицета Coprinus lagopides ТИ-32 на жидкой питательной среде.

Питательная среда на основе пивного сусла и соевой муки.

Глубинное культивирование проводят на роторной качалке при 28-30°С в колбах Эрленмейера (0.75 л), содержащих 250 мл питательной среды следующего состава: пивное сусло (4° по Баллингу), соевая мука (1%).

Выделение фермента методом ультрафильтрации.

По достижении максимальной молокосвертывающей активности (6 сутки) мицелиальную биомассу отделяют фильтрованием от культуральной жидкости. Затем культуральный фильтрат концентрируют и очищают от низкомолекулярных соединений методом ультрафильтрации и лиофильно высушивают.

Удельная молокосвертывающая активность данного сухого фермента составляет 48000-52000 Ед/г (время створаживания молока 2-3 мин).

Образуемый под действием данного фермента плотный молочный сгусток не имеет привкуса горечи, что подтверждает низкий уровень протеолитической активности.

Пример 3.

Получение молокосвертывающего фермента культивированием агарикового макромицета Coprinus lagopides ТИ-33 на жидкой питательной среде.

Питательная среда на основе пивного сусла и соевой муки.

Глубинное культивирование проводят на роторной качалке при 28-30°С в колбах Эрленмейера (0.75 л), содержащих 250 мл питательной среды следующего состава: пивное сусло (4° по Баллингу), соевая мука (1%).

Выделение фермента методом ультрафильтрации.

По достижении максимальной молокосвертывающей активности (6-6.5 суток) мицелиальную биомассу отделяют фильтрованием от культуральной жидкости. Затем культуральный фильтрат концентрируют и очищают от низкомолекулярных соединений методом ультрафильтрации и лиофильно высушивают.

Удельная молокосвертывающая активность данного сухого фермента составляет 37000-40000 Ед/г (время створаживания молока 4-5 мин).

Образуемый под действием данного фермента плотный молочный сгусток не имеет привкуса горечи, что подтверждает низкий уровень протеолитической активности.

Культивирование агариковых макромицетов Coprinus lagopides ТИ-12, Coprinus lagopides ТИ-32 и Coprinus lagopides ТИ-33 на жидкой питательной среде (Пример 1, Пример 2 и Пример 3) подтверждает использование агарикового макромицета Coprinus lagopides в качестве молокосвертывающего фермента.

Предложенный способ получения молокосвертывающего фермента, включающий изучение базидиальных грибов рода Coprinus, использование агарикового макромицета Coprinus lagopides и проведение экспериментальных исследований, подтверждающих высокую молокосвертывающую активность, в Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете), обусловливает, по мнению заявителей, соответствие его критерию «промышленная применимость».

Использование предложенного способа позволяет улучшить биотехнологический процесс (сократить сроки ферментации продуцента) и получить фермент с более высокой качественной характеристикой: с высоким уровнем молокосвертывающей активности и низким уровнем общей протеолитической активности.

Способ получения молокосвертывающего фермента предусматривает глубинное культивирование агарикового макромицета Coprinus lagopides на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. Это позволяет получить фермент с высоким уровнем молокосвертывающей активности и низким уровнем общей протеолитической активности.

Способ получения молокосвертывающего фермента путем культивирования продуцента базидиального гриба на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийся тем, что из базидиальных грибов рода Coprinus в качестве продуцента используют агариковый макромицет Coprinus lagopides.