СПОСОБ НЕМЕДИКАМЕНТОЗНОГО СНИЖЕНИЯ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ Российский патент 2009 года по МПК A61K36/07 A61P3/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования грибов класса Basidiomycetes рода Panus, а именно использования биомассы съедобных грибов вида Panus conchatus или экстракта из биомассы в составе пищевого рациона для снижения уровня общего холестерина и триглицеридов в крови, повышения уровня липидов высокой плотности в крови, снижения уровня общего холестерина и активации метаболизма холестерина в печени при гиперлипидемии.

Известны способы снижения гиперлипидемии путем использования грибов класса Basidiomycetes разных видов из рода Pleurotus, Nina Gunde-Cimerman. Medicinal Value of the Genus Pleurotus (Fr.) P.Karst. (Agaricales s.1., Basidiomycetes) // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.69-71; US №6372964, 435/171, 424/195.15, 435/254.1, 435/256.8, 2002.04.16.

Известны способы снижения гиперлипидемии путем использования базидиальных макромицетов вида Pleurotus ostreatus, Bobek P., Ginter E., Jurcovicova M., Kuniak L. Cholesterol-lowering effect of the mushroom Pleurotus ostreatus in hereditary hypercholesterolemic rats // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / p.371.; Bobek P., Ginter E., Ozdin L. Oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) accelerates the plasma clearance of lowdensity and high-density lipoproteins in rats // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / p.372.; Opletal L. Phytotherapeutic aspects of diseases of the circulatory system // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.372-373; Bobek P., Ozdin L. The mushroom Pleurotus ostreatus accelerates plasma very-low-density lipoprotein clearance in hypercholesterolemic rat // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.374-375; Bobek P., Ozdin L., Kuniak L., Hromadova M. Regulation of cholesterol metabolism with dietary addition of oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus) in rats with hypercholesterolemia // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.377-378.

Известны способы снижения гиперлипидемии путем использования базидиальных макромицетов вида Lentinus edodes, вида Volvariella volvacea, вида Agrocybe aegerita, вида Tremella fuciformis, Solomon P.Wasser and Alexander L.Weis. Medicinal Properties of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review) // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.34-35.

Известен способ снижения гиперлипидемии путем использования базидиальных макромицетов вида Flammulina velutipes, вида Coprinus domesticus, Olga V. Remesova, Nina P. Denisova. The Action of Higher Basidiomycetes Mushrooms Mycelia on Plasma Lipids and Lipoproteins of Hyperlipidemic Rats and Guinea Pigs // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.331-336.

В известных грибах класса Basidiomycetes макромицетов рода Panus, снижающих гиперлипидемию, не обнаружено.

Известно выращивание штамма гриба белой гнили Panus tigrinus на синтетической среде для получения лигнинолитических ферментов, RU №2021371 C1, C12N 9/08, C12N 1/14, 1994.10.15.

Известно использование гриба Panus tigrinus для утилизации лигнинсодержащего сырья, RU №2255979 С2, C12N 1/14, 2005.07.10.

Известный гриб Panus tigrinus используется для лигнинолитической ферментации.

Известны способы получения кормового продукта путем использования штаммов грибов Panus tigrinus, SU №1622388 A1, C12N 1/14, 1991.01.23; RU №2196438 C1, C12N 1/14, 2003.01.20.

Известный гриб Panus tigrinus используется для получения белкового кормового продукта.

Известна возможность использования с медицинской целью базидиальных грибов рода Panus, снижающих агрегацию тромбоцитов, Lorenzen К., Anke Т. et al., 1994 - Two inhibitors of platelet aggregation from a Panus species (Basidiomycetes). // Zeitschrift fur Naturforschung 49C: 132-138.

Известен способ получения белковой биомассы гриба путем использования грибов класса Basidiomycetes рода Panus, RU №2186851 С2, С12Р 21/00, C12N 1/14, 2002.08.10.

Данное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.

В ближайшем аналоге путем глубинного культивирования гриба Panus tigrinus получают белковую биомассу, которую используют в пищевой, кормовой и медицинской промышленности.

В базидиальных грибах рода Panus видов грибов, снижающих гиперлипидемию, не обнаружено.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей выявить из базидиальных грибов рода Panus вид гриба, снижающий уровень гиперлипидемии, определить и расширить возможности осуществления способа.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии заключается в использовании грибов класса Basidiomycetes рода Panus.

Из рода Panus используют грибы вида Panus conchatus.

Продукты глубинного культивирования грибов вида Panus conchatus вносят в состав пищевого рациона.

В качестве продукта глубинного культивирования используют биомассу грибов вида Panus conchatus.

Биомассу грибов вида Panus conchatus используют при минимальном количестве 2% от пищевого рациона.

В качестве продукта глубинного культивирования используют экстракт из биомассы грибов вида Panus conchatus.

Экстракт из биомассы грибов вида Panus conchatus используют при минимальном количестве 0.002% от пищевого рациона.

Заявителями не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

За счет реализации отличительных признаков изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) достигаются важные новые свойства объекта.

В роде Panus выявлен гриб вида Panus conchatus, продукты глубинного культивирования которого снижают уровень гиперлипидемии.

Использование в качестве продукта глубинного культивирования биомассы или экстракта из биомассы гриба Panus conchatus существенно снижает уровень гиперлипидемии.

Внесение биомассы при минимальном количестве 2% или экстракта из биомассы при минимальном количестве 0.002% от пищевого рациона обеспечивает осуществление способа.

Использование биомассы гриба или экстракта из биомассы гриба Panus conchatus расширяет возможности осуществления способа.

Заявителям не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителей, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом.

Для немедикаментозного снижения гиперлипидемии используют гриб Panus conchatus.

Продукты глубинного культивирования гриба Panus conchatus вносят в состав пищевого рациона.

В качестве продуктов глубинного культивирования используют биомассу или экстракт из биомассы гриба Panus conchatus.

Биомассу гриба Panus conchatus используют в количестве 2% от пищевого рациона.

Экстракт из биомассы гриба Panus conchatus используют в количестве 0.002% от пищевого рациона.

Базидиальные грибы рода Panus являются сапротрофами, обитающими на древесине лиственных и хвойных пород, в природе вызывают так называемую белую гниль древесины. В Ленинградской области грибов из рода Panus насчитывается всего четыре вида (И.В.Змитрович, В.Ф.Малышева, Е.Ф.Малышева, В.А.Спирин. Плевротоидные грибы Ленинградской области. 2004, 123 с.).

Родовое название Panus уже долгие годы продолжает оставаться законсервированным (в отличие от родовых названий других грибов), что подтверждено последним Сент-Луисским конгрессом (International Code of Botanical nomenclature (Saint Louis Code) // Regnum Vegetabile. 2000. Vol.138.). Совокупность многих коррелятивно связанных важных признаков грибов этого рода позволяет четко отдифференцировать их от грибов родов Pleurotus и Lentinus.

Культура Panus conchatus выделена из плодовых тел дереворазрушающего гриба Panus conchatus (Bull.: Fr.) Fr. (Панус раковинообразный), собранных в северо-восточной пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга. Плодовые тела Panus conchatus съедобны. Они собраны, охарактеризованы и индуцированы в чистую культуру авторами.

Для осуществления способа используют культуру Panus conchatus ТИ-16 из коллекции культур высших базидиальных грибов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).

В коллекции культуру Panus conchatus поддерживают на косяках сусло-агара (пивное сусло 4° по Баллингу, агар 20%) и хранят в рефрижераторе при +4°±2°С.

Достоверное снижение уровня гиперлипидемии подтверждено в эксперименте.

Эксперимент проведен на белых беспородных крысах-самцах массой 140-160 г, полученных из питомника «Рапполово РАМ» г.Санкт-Петербурга.

Модель гиперлипидемии белых беспородных крыс-самцов выбрана на основании опыта Института Экспериментальной Медицины РАМН (г.С.-Петербург) и зарубежных работ (Климов А.Н., Рыженков В.Е. Экспериментальное изучение гиполипидемических и антиатеросклеротических средств. Методические рекомендации, М., 1988, 18 с.; Staprans I., Rapp J.H., Pan X-M. et al., Oxidized lipids in the diet accelerate the development of fatty streaks in cholesterol-fed rabbits, Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol., 1996, v 16, N4, 533-538).

ПРИМЕР 1.

Получение биомассы гриба Panus conchatus.

Предварительно готовят посевной материал, выращивая культуру Panus conchatus в стационарных условиях на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза 20; пептон 4; КН₂PO₄ 0.6; К₂HPO₄ 0.4; MgSO₄ 0,5; ZnSO₄·7H₂O 0,001; FeSO₄·7H₂O 0,005; MnSO₄ 0,003; CaCl₂ 0,05; кукурузный экстракт 1,0 (по сухому весу); рН среды до стерилизации 5,8-6,0. Стерилизацию среды проводят при 0.5*10⁵ Па в течение 30 минут.

Посевной материал выращивают в течение 7-10 дней при 25-28°С, диспергируют и используют в качестве инокулюма для получения биомассы гриба Panus conchatus.

Глубинное культивирование гриба Panus conchatus проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл глюкозо-пептонной среды указанного состава и суспензию посевного материала в количестве 10% от объема среды. Культивирование проводят на роторной качалке при 120-160 об/мин в течение 7 суток при 25-28°С. Указанный температурный интервал является оптимальным для активного роста культуры Panus conchatus.

Выросшую при глубинном культивировании биомассу гриба Panus conchatus отделяют от нативного раствора, сушат при температуре 40-50°С и измельчают в порошок.

Примечание:

Глубинное культивирование гриба Panus conchatus аналогичным способом можно проводить и на натуральной среде, в состав которой входят пивное сусло (4° по Баллингу) и соевая мука (1%), рН среды 5.8-6.0.

Для глубинного культивирования могут быть использованы и другие известные питательные среды.

ПРИМЕР 2.

Получение этилацетатного экстракта из биомассы гриба Panus conchatus.

15 г порошка биомассы гриба Panus conchatus замачивают в 900 мл воды и выдерживают в течение 30 мин. Доводят рН до 7.7, используя 4% NaOH. Добавляют 150 мл метанола и 300 мл этилацетата. Процесс экстракции в двухфазной системе растворителей H₂O:МеОН:этилацетат (при соотношении 3:0.5:1) проводят на магнитной мешалке в течение 30 мин. Раствор центрифугируют при 5000 об/мин и 4°С в течение 10 мин и отбирают этилацетатный экстракт.

Отобранный раствор упаривают под вакуумом при температуре 40-45°С и подвергают последующей кристаллизации охлаждением.

Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в потоке воздуха при 40°С.

Примечание:

Можно использовать водно-спиртовой экстракт, а также экстракты, полученные с применением других экстрагентов.

ПРИМЕР 3.

Проведение эксперимента.

Экспериментально индуцированную гиперлипидемию создавали у животных (белых беспородных крыс-самцов) путем использования в качестве их ежедневного пищевого рациона специального гиперлипидемического корма в течение трех недель (21 день).

Животные были разделены на несколько групп.

Интактная группа (12 животных) получала стандартный сухой корм и водопроводную воду ad libitum.

Контрольная группа (7 животных) получала гиперлипидемический корм и воду.

Животные опытной группы №1 (7 животных), наряду с гиперлипидемическим кормом, получали добавку в виде сухой биомассы гриба Panus conchatus.

Животные опытной группы №2 (7 животных), наряду с гиперлипидемическим кормом, получали добавку в виде сухого этилацетатного экстракта из биомассы гриба Panus conchatus.

Гиперлипидемический корм в качестве основы включал овсяные хлопья, в качестве атерогенных компонентов - сухой кристаллический холестерин 5%, свиной жир 25%, подсолнечное масло 18%, витамин D (эргокальциферол) 200 тыс. МЕ/сутки.

Животные опытных групп №1 и №2 получали per os добавки в виде сухой биомассы гриба и сухого этилацетатного экстракта из биомассы гриба Panus conchatus, смешанные с основной массой гиперлипидемического корма в количестве 2% и 0.002% от пищевого рациона соответственно.

Примечание:

Внесение добавок в виде биомассы гриба Panus conchatus при минимальном количестве 2% от пищевого рациона и этилацетатного экстракта из биомассы гриба Panus conchatus при минимальном количестве 0.002% от пищевого рациона является оптимальным.

Определение общего холестерина, холестерина ЛПВП и триглицеридов в крови и общего холестерина в печени.

По истечении 21 дня у животных, предварительно наркотизированных уретаном, проводили забор крови и ткани печени.

Содержание общего холестерина и холестерин ЛПВП определяли с помощью набора «Ольвекс диагностикум» (Санкт-Петербург, Россия).

Метод основан на сочетании ферментативной реакции с реакцией окисления. Образующаяся в результате этих реакций перекись водорода взаимодействует под действием пероксидазы с 4-аминофеназоном и фенолом с образованием окрашенного продукта - хинонимина.

Определение триглицеридов проводили в сыворотке крови с применением энзиматического колориметрического метода с использованием набора реагентов для определения триглицеридов в сыворотке или цельной крови человека «ВИТАЛ ДИАГНОСТИКС» (Санкт-Петербург, Россия).

Содержание общего холестерина, холестерина ЛПВП и триглицеридов в сыворотке крови животных интактной группы, контрольной группы и опытных групп №1 и №2 и общего холестерина в печени у животных интактной группы, контрольной группы и опытной группы №1 представлены в таблице.

Примечание:

Коэффициент атерогенности (КА) выражен через отношение разницы между содержанием общего холестерина и холестерина ЛПВП к содержанию ЛПВП и позволяет судить о степени угрозы развития атеросклеротического процесса в организме (Климов А.Н. Антиатерогенная функция липопротеинов высокой плотности. С.34-54; в кн: Атеросклероз. Проблемы патогенеза и терапии. Изд. «Медицинская литература», СПб., 2006. С.246).

Из таблицы «Снижение уровня индуцированной гиперлипидемии у крыс под влиянием рациона с добавками биомассы культуры Panus conchatus и этилацетатного экстракта из биомассы» видно:

У животных контрольной группы (гиперлипидемический корм) по сравнению с интактной группой:

- концентрация общего холестерина в сыворотке крови увеличилась на 77%;

- содержание триглицеридов в сыворотке крови увеличилось на 130%;

- концентрация ЛПВП в сыворотке крови составила 2.05 ммоль/л (в интактной группе 1.43 ммоль/л);

- КА возрос до 0.5;

- концентрация общего холестерина в печени повысилась на 33%.

У животных опытной группы №1 (гиперлипидемический корм плюс биомасса гриба Panus conchatus) по сравнению с контрольной группой:

- концентрация общего холестерина в сыворотке крови снизилась на 17%;

- содержание триглицеридов в сыворотке крови снизилось на 20%;

- концентрация ЛПВП в сыворотке крови повысилась и составила 2.28 ммоль/л (в контрольной группе 2.05 ммоль/л);

- КА снизился в 5 раз;

- концентрация общего холестерина в печени снизилась на 45%.

У животных опытной группы №2 (гиперлипидемический корм плюс экстракт из биомассы гриба Panus conchatus) по сравнению с контрольной группой:

- концентрация общего холестерина в сыворотке крови снизилась на 23%;

- содержание триглицеридов в сыворотке крови снизилось на 8%;

- концентрация ЛПВП в сыворотке крови составила 2.20 ммоль/л (в контрольной группе 2.05 ммоль/л);

- КА снизился до 0.07.

Таким образом, внесение в гиперлипидемический корм животных добавок в виде биомассы или экстракта из биомассы гриба Panus conchatus не только снижает уровень общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови, но и сохраняет высокое содержание «хорошего холестерина» (ЛПВП), что приводит к существенному снижению уровня гиперлипидемии (о чем свидетельствует низкий коэффициент атерогенности) и, следовательно, к снижению опасности развития атеросклеротического процесса в организме животных.

Предложенный способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии, относящийся к микробиологической промышленности, включающий использование грибов Panus conchatus и проведение экспериментальных исследований, подтверждающих снижение гиперлипидемии, проведенный в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П.Павлова и Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете), обусловливает, по мнению заявителей, соответствие его критерию «промышленная применимость».

Использование предложенного способа позволяет:

- использовать съедобные грибы Panus conchatus для снижения уровня холестерина и триглицеридов в крови, повышения уровня ЛПВП в крови, снижения уровня холестерина и активации его метаболизма в печени, что в целом приводит к существенному снижению уровня гиперлипидемии,

- расширить возможности осуществления способа за счет внесения в состав пищевого рациона биомассы грибов Panus conchatus и экстрактов из биомассы в лечебных и профилактических целях.

Снижение уровня индуцированной гиперлипидемии у крыс под влиянием рациона с добавками биомассы культуры Panus conchatus и этилацетатного экстракта из биомассы Интактная группа. (стандартный корм)Контрольная группа (гиперлипидемический корм)Опытная группа №1 (гиперлипидемический корм + биомасса)Опытная группа №2 (гиперлипидемический корм + экстракт)в сыворотке кровиОбщий холестерин (ммоль/л)1.723.052.55*2.36*По сравнению с интактной группой-+77%+48%+37%По сравнению с контрольной группой---17%-23%Триглицериды (ммоль/л)0.701.611.29*1.49**По сравнению с интактной группой-+130%+84%+112%По сравнению с контрольной группой---20%-8%ЛПВП (ммоль/л)1.432.052.28*2.20*Коэффициент атерогенности0.20.50.10.07в печениОбщий холестерин (мг/г)0.0760.1010.056*-По сравнению с интактной группой-+33%-26%-По сравнению с контрольной группой---45%-Примечание: * - достоверность р<0.05
** - достоверность р>0.05

Изобретение относится к медицине и микробиологической промышленности и предназначено для снижения гиперлипидемии в организме. Для этого используют продукты глубинного культивирования гриба Panus conchatus в виде биомассы или экстракта из нее в составе пищевого рациона. Биомассу или экстракт вводят в состав пищевого рациона при минимальном количестве 2% или 0.002% от пищевого рациона соответственно. Способ позволяет снижать уровень общего холестерина, триглицеридов, повышать уровень липопротеидов высокой плотности в крови и активировать метаболизм холестерина в печени. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии, заключающийся в использовании грибов класса Basidiomycetes рода Panus, отличающийся тем, что из рода Panus используют грибы вида Panus conchatus, продукты глубинного культивирования которого вносят в состав пищевого рациона.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве продукта глубинного культивирования используют биомассу при минимальном количестве 2% от пищевого рациона.3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве продукта глубинного культивирования используют экстракт из биомассы при минимальном количестве 0,002% от пищевого рациона.